AUTOREFERAT Dr n.med. Renata Światkowska-Stodulska

AUTOREFERAT Dr n.med. Renata Światkowska-Stodulska Katedra i Klinika Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdański Uniwersytet Medyczny Gdańsk 2015

1. Imię i Nazwisko Renata Świątkowska-Stodulska 2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe -z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej: 1998- dyplom lekarza uzyskany na Wydziale Lekarskim Akademii Medycznej w Gdańsku (obecnie Gdański Uniwersytet Medyczny) 2002- stopień naukowy doktora nauk medycznych w zakresie medycyny nadany uchwałą Rady Wydziału Lekarskiego Akademii Medycznej w Gdańsku z dnia 14.11.2002 na podstawie rozprawy doktorskiej: Interleukiny 6 i 8 w surowicy chorych z alkoholową chorobą wątroby (promotor: Prof. dr hab. med. Eugenia Częstochowska) 2005- dyplom specjalisty w dziedzinie chorób wewnętrznych pod kierunkiem dr n. med. Ewy Kazimierskiej (Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) 2012- dyplom specjalisty w dziedzinie endokrynologii pod kierunkiem prof. dr hab. med. Krzysztofa Sworczaka (Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 1999-2002- uczestnik dziennych studiów doktoranckich w Klinice Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy Akademii Medycznej w Gdańsku (obecnie Klinika Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego) 2001-2009 asystent Kliniki Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 2

Od 2009 roku do chwili obecnej- adiunkt Kliniki Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego 4. Wskazane osiągnięcia wynikające z art. 16 ust. 2 z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym (DZ.U.nr 65, poz. 595 ze zm.) Osiągniecie naukowe stanowi cykl 6 powiązanych tematycznie publikacji (2011-2015), obejmujący 5 prac oryginalnych i 1 pracę poglądową. Tytuł osiągnięcia naukowego Zaburzenia układu hemostazy u chorych z subkliniczną i pełnoobjawową endogenną hiperkortyzolemią a) Autor/autorzy, tytuł/ tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictw 1. Świątkowska-Stodulska R, Kaniuka-Jakubowska S, Wiśniewski P, Skibowska- Bielińska A, Sworczak K. The estimation of selected endogenous anticoagulation system parameters in patients with subclinical Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol. 2011;165(6):865-871. doi: 10.1530/EJE-11-0535. IF: 3,423; MNiSzW: 30 2. Świątkowska-Stodulska R, Kaniuka-Jakubowska S, Wiśniewski P, Skibowska- Bielińska A, Babińska A, Sowińska-Przepiera E, Sworczak K. Homocysteine and alpha-1 antitrypsin concentration in patients with subclinical hypercortisolemia. Adv Med Sci. 2012;57(2):302-307. doi: 10.2478/v10039-012-0032-8. IF: 0,796; MNiSzW: 15 3. Świątkowska-Stodulska R, Sworczak K. Disorders of hemostasis in overt and subclinical hypercortisolism. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2013;121(10):588-594. doi: 10.1055/s-0033-1355385. IF: 1,760; MNiSzW: 15 Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 3

4. Świątkowska-Stodulska R, Kitowska A, Skibowska-Bielińska A, Wiśniewski P, Sworczak K. Hageman factor C46T promoter gene polymorphism in patients with hypercortisolism. Horm Metab Res. 2014;46(7):510-514. doi: 10.1055/s-0034-1371823. IF: 2,038; MNiSzW: 20 5. Świątkowska-Stodulska R, Mital A, Wiśniewski P, Babińska A, Skibowska- Bielińska A, Sworczak K. Assessment of platelet function in endogenous hypercortisolism. Endocrinol Pol, doi: 10.5603/EP.2015.0014. IF: 1,208; MNiSzW: 15 6. Świątkowska-Stodulska R, Skibowska-Bielińska A, Wiśniewski P, Sworczak K. Activity of selected coagulation factors in overt and subclinical hypercortisolism, Endocrine Journal, doi: 10.1507/endocrj. EJ14-0539. IF: 2,019; MNiSzW: 20 Łączna wartość bibliometryczna cyklu powyżej wymienionych publikacji wynosi : IF: 11,244; MNiSzW: 115 We wszystkich publikacjach, wchodzących w skład osiągnięcia naukowego jestem pierwszym autorem. Oświadczenie dotyczące wykonanych prac oraz mojego procentowego wkładu w powstanie poszczególnych publikacji znajdują się w załączniku 3. Oświadczenia współautorów publikacji, określające indywidualny wkład każdego z nich w powstaniu poszczególnych publikacji przedstawiono w załączniku 5. Badania, będące podstawą przedstawionego osiągnięcia naukowego, prowadziłam w Klinice Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego pod kierunkiem Prof. dr hab. med. Krzysztofa Sworczaka. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 4

b) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Endokrynopatie w złożony sposób wpływają na mechanizmy hemostazy. Wielokrotnie potwierdzono wpływ różnych hormonów na poszczególne etapy krzepnięcia i fibrynolizy, w wyniku czego dochodzi do zaburzenia prawidłowych relacji w układzie hemostazy. Grupą hormonów, wykazującą szczególnie duży wpływ na układ hemostazy, są glikokortykoidy. Zwiększona tendencja do incydentów zakrzepowo-zatorowych występuje zarówno u chorych z endogenną hiperkortyzolemią, jak i u przyjmujących preparaty glikokortykoidowe. Badania epidemiologiczne wykazują kilkukrotnie wyższą częstość występowania powikłań zakrzepowozatorowych u chorych z hiperkortyzolemią w porównaniu z osobami bez zaburzeń hormonalnych. Efekt prozakrzepowego działania tej grupy sterydów wynika z jednej strony z bezpośredniego wpływu hiperkortyzolemii na aktywację układu krzepnięcia i zahamowanie fibrynolizy, z drugiej zaś, z patologii hemostazy w zaburzeniach metabolicznych, do rozwoju których dochodzi w tej endokrynopatii. Biorąc pod uwagę wpływ hiperkortyzolemii na układ hemostazy i jej prozakrzepowe działanie nasuwa się pytanie o stosowanie profilaktyki przeciwzakrzepowej u chorych z chorobą czy zespołem Cushinga. Prace dotyczące tego problemu są nieliczne. Dotychczas nie oblikowano ogólnych standardów profilaktyki przeciwzakrzepowej w tej grupie chorych. U podłoża braku opracowania tych standardów leży zapewne niejasny charakter zaburzeń, prowadzących do rozwoju powikłań zakrzepowo-zatorowych w hiperkortyzolemii. Wciąż pozostaje również otwarty problem, na jakim etapie choroby dochodzi do zwiększonego ryzyka zakrzepicy. Szczególnie wiele niejasności budzą chorzy z subklinicznym zespołem Cushinga. U tych chorych występuje autonomiczna produkcja glikokortykoidów bez typowych objawów hiperkortyzolemii, takich jak: twarz księżycowata, plethora, bawoli kark, otyłość centralna, czy miopatia proksymalna. Dotychczas, poza moimi badaniami, nie opublikowano prac oceniających parametry układu hemostazy w subklinicznej hiperkortyzolemii, a przecież obecnie wiadomo, że subkliniczny zespół Cushinga jest najczęściej spotykaną dysfunkcją hormonalną u pacjentów z przypadkowo wykrytymi guzami nadnercza. Wg Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 5

niektórych autorów sięga ona 5-20 % wszystkich incidentaloma nadnercza. Pragnę również podkreślić, iż podejmowanie przeze mnie badań w tej grupie chorych było również wyzwaniem, ze względu na trudną diagnostykę hormonalną i kryteria rozpoznawania subklinicznej hiperkortyzolemii. Identyfikacja zaburzeń w układzie krzepnięcia oraz etapu choroby na którym do nich dochodzi, wydaje się szczególnie ważna również w ustalaniu dodatkowych wskazań do zabiegu usunięcia przypadkowo stwierdzonych zmian w nadnerczach. Uzasadnione zatem wydaje się podejmowanie w badaniach naukowych oceny poszczególnych parametrów układu hemostazy u pacjentów z endogenną hiperkortyzolemią. W pierwszej z przedstawionych prac oryginalnych [Świątkowska-Stodulska R i wsp. The estimation of selected endogenous anticoagulation system parameters in patients with subclinical Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol. 2011;165(6):865-871] oceniałam parametry endogennego układu antykoagulacyjnego: aktywność białka C, wolnego białka S, antytrombiny, oporność na aktywne białko C (APC-R), oraz stężenie trombomoduliny u pacjentów z subklinicznym zespołem Cushinga. Zgodnie z definicją, subkliniczny zespół Cushinga rozpoznawałam u pacjentów z przypadkowo stwierdzoną w tomografii komputerowej jamy brzusznej zmianą w nadnerczu, bez typowych objawów hiperkortyzolemii w badaniu przedmiotowym, u których badania hormonalne wskazywały na endogenną hiperkortyzolemię: brak pełnego hamowania wydzielania kortyzolu w krótkim teście z 1 mg deksametazonu - overnight (stężenia kortyzolu powyżej 50 nmol/l) oraz dodatkowo przynajmniej jedno z wymienionych kryteriów: nieprawidłowy rytm dobowy kortyzolu, obniżone poranne stężenie hormonu kortykotropowego (ACTH) (do 10 pg/ml i poniżej) lub zwiększone dobowe wydalanie kortyzolu z moczem. U wszystkich pacjentów z subkliniczną hiperkortyzolemią potwierdziłam dodatkowo brak pełnego hamowania wydzielania kortyzolu w surowicy (stężenia powyżej 50 nmol/l) w dwudniowym teście z małymi dawkami deksametazonu (0,5 mg co 6 godzin). Większość autorów uważa, iż stężenia kortyzolu powyżej 140 nmol/l w teście Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 6

overnight są wystarczające do rozpoznania subklinicznej hiperkortyzolemii. Natomiast w grupie pacjentów, u których stężenia kortyzolu po 1 mg deksametazonu znajdują się w przedziale 50-140 nmol/l, należy wykonać dodatkowe badania hormonalne, oceniające oś przysadkowo-nadnerczową. Biorąc jednak pod uwagę trudności diagnostyczne subklinicznego zespołu Cushinga, zasadne jest oznaczenie dodatkowych parametrów hormonalnych oceniających oś przysadkowo-nadnerczową u wszystkich chorych z podejrzeniem subklinicznej hiperkortyzolemii. Zasadę taką przyjęłam w omawianych pracach. Z badań wykluczałam osoby z ostrą lub przewlekłą objawową infekcją, chorobą nowotworową, układową chorobą tkanki łącznej, cechami uszkodzenia wątroby i nerek, kobiety przyjmujące doustną antykoncepcję lub hormonalną terapię zastępczą, pacjentów, którzy przebyli incydent zakrzepowo-zatorowy w okresie ostatnich 6 miesięcy oraz osoby przyjmujące doustne antykoagulanty. Żadna z osób objętych badaniem nie przyjmowała również leków interferujących w oznaczenia gospodarki glikokortykoidowej takich jak: syntetyczne steroidy, leki wpływające na metabolizm deksametazonu, poprzez indukcję bądź hamowanie CYP 3A4, zmieniające stężenie transkortyny (CBG) czy interferujące w oznaczenia dobowego wydalania kortyzolu z moczem. Grupę kontrolną stanowili zdrowi ochotnicy, dobrani odpowiednio pod względem wieku i body mass index (BMI). W prowadzonych przeze mnie badaniach wykazałam znamiennie wyższe średnie aktywności proteiny C i wolnego białka S u pacjentów z subkliniczną hiperkortyzolemią niż u zdrowych ochotników. Nie stwierdziłam znamiennych różnic dla APC-R czy aktywności antytrombiny. Białko C, białko S i antytrombina należą do endogennego układu inhibitorów krzepnięcia krwi. Ich aktywację zapoczątkowuje nagromadzenie się trombiny, która w kompleksie z trombomoduliną, swoim receptorem na komórkach śródbłonka, poprzez aktywację białka C i hamowanie PAI-1 (inhibitora aktywatora plazminogenu-1) zyskuje właściwości profibrynolityczne i antykoagulacyjne. Aktywna proteina C przy udziale kofaktora białka S, degraduje i inaktywuje czynniki krzepnięcia Va i VIIIa, poprzez częściową ich proteolizę. Ważnym endogennym inhibitorem układu krzepnięcia jest również antytrombina, inaktywująca czynnik Xa i trombinę, w mniejszym Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 7

stopniu również czynniki XIIa, XIa i IXa. Niedobór białek C, S i antytrombiny, będących inhibitorami układu krzepnięcia stanowi niepodważalny czynnik ryzyka rozwoju zmian zakrzepowo-zatorowych. Dotychczas prowadzone nieliczne prace oceniające endogenne inhibitory układu krzepnięcia u chorych z pełnoobjawowym zespołem Cushinga wykazały znamiennie wyższą aktywność zarówno białka C, S jak i antytrombiny u tych chorych. Prowadzone przeze mnie badania po raz pierwszy na świecie wykazały zwiększoną aktywność składowych endogennego układu antykoagulacyjnego u chorych z subkliniczą hiperkortyzolemią. Można więc przypuszczać, iż w hiperkortyzolemii dochodzi do zwiększenia aktywności wymienionych inhibitorów układu krzepnięcia. Powstaje zatem pytanie, dlaczego u chorych z hiperkortyzolemią znacznie częściej występują incydenty zakrzepowo-zatorowe, skoro aktywność naturalnego układu antykoagulacyjnego wydaje się być prawidłowa, a nawet zwiększona? U podłoża zmian zakrzepowych nie leży więc niedobór ocenianych przeze mnie składowych endogennego układu antykoagulacyjnego. Nie można wykluczyć, że wzrost aktywności proteiny C i S wynika z ich wzmożonej produkcji pod wpływem endogennych steroidów lub ma charakter wtórny do zwiększonej gotowości prokoagulacyjnej wynikającej m.in. ze wzrostu stężenia osoczowych czynników krzepnięcia. Kolejnym ocenianym przeze mnie parametrem było stężenie trombomoduliny w osoczu krwi żylnej, będącej swoistym receptorem dla trombiny. Uwalnia się ona z komórek śródbłonka po jego uszkodzeniu, stąd jest traktowana jako marker uszkodzenia endothelium. W niniejszej pracy stwierdziłam znamiennie niższe średnie stężenia trombomoduliny u osób z subklinicznym zespołem Cushinga niż u zdrowych ochotników. Trombomodulina jest swoistym receptorem dla trombiny, w kompleksie z którą, aktywuje białko C. A zatem, jej stężenie w osoczu może również zależeć od aktualnie toczącego się procesu trombinogenezy i aktywności układu antykoagulacyjnego. Niższe stężenia trombomoduliny u chorych z subklinicznym zespołem Cushinga mogą być zatem wynikiem zwiększonej aktywności proteiny C w tej grupie chorych. Należy również podkreślić, że trombina po przyłączeniu do trombomoduliny na Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 8

powierzchni śródbłonka, traci zdolność do wykrzepiania fibrynogenu i aktywacji pytek krwi. A zatem niskie stężenie trombomoduliny, która jest białkiem receptorowym dla trombiny, może pośrednio wpływać prokoagulacyjnie. W prezentowanej pracy nie wykazałam znamiennych zależności pomiędzy aktywnością proteiny C, wolnego białka S, antytrombiny, APC-R, stężeniami trombomoduliny a wykładnikami hormonalnymi hiperkortyzolemii: porannym i późnowieczorym stężeniem kortyzolu, dobowym wydalaniem kortyzolu z moczem czy kortyzolemią w teście overnight. Na podstawie uzyskanych przeze mnie wyników badań można wnioskować, iż u chorych z subklinicznym zespołem Cushinga dochodzi do zmian w endogennym układzie antykoagulacyjnym. Zwiększona aktywność białka S i wolnej proteiny C przemawia przeciwko ich pierwotnej roli w wysokim ryzyku rozwoju zmian zakrzepowych w tej grupie chorych a może stanowić pewnego rodzaju mechanizm chroniący przed nadmierną aktywacją krzepnięcia w hiperkortyzolemii. Natomiast obniżone stężenie trombomoduliny może świadczyć o jej udziale w rozwoju zmian zakrzepowych w badanej grupie chorych. Kolejna przedstawiona praca [Świątkowska-Stodulska R i wsp. Homocysteine and alpha-1 antitrypsin concentration in patients with subclinical hypercortisolemia. Adv Med Sci. 2012;57(2):302-307] była wynikiem kontynuacji badań układu hemostazy u osób z subkliniczną hiperkortyzolemią, które obejmowały ocenę stężeń homocysteiny oraz α1 antytrypsyny w tej grupie chorych. Obecnie hiperhomocysteinemia jest niekwestionowanym czynnikiem ryzyka zakrzepicy zarówno tętniczej jak i żylnej. Prozakrzepowe działanie tego aminokwasu jest wielokierunkowe. Wielokrotnie potwierdzono jego wpływ na aktywację toru krzepnięcia, zahamowanie fibrynolizy czy dysfunkcję endotelium z nasileniem adhezji i agregacji płytek krwi, co dodatkowo nasila trombinogenezę. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 9

Badania przeze mnie prowadzone obejmowały pacjentów z subkliniczną hiperkortyzolemią co stanowiło o ich pionierskim charakterze. W badaniach tych wykazałam znamiennie wyższe stężenia homocysteiny w grupie chorych z subkliniczną hiperkortyzolemią niż w grupie kontrolnej zdrowych ochotników, dobranej odpowiednio pod względem wieku i BMI. Nie stwierdziłam natomiast znamiennych zależności pomiędzy stężeniem homocysteiny a wykładnikami hormonalnymi hiperkortyzolemii w grupie chorych z subklinicznym zespołem Cushinga. Uzyskane przeze mnie wyniki po raz pierwszy wskazują na zwiększone ryzyko rozwoju powikłań naczyniowych u chorych z subklinicznym zespołem Cushinga. Wysokie stężenie homocysteiny zwiększa ekspresję czynnika tkankowego, aktywację V czynnika krzepnięcia, hamuje aktywność trombomoduliny oraz fibrynolizę. Dodatkowo homocysteina zmniejsza również aktywność dysmutazy nadtlenkowej i powoduje gromadzenie toksycznych nadtenków, co prowadzi do uszkodzenia śródbłonka, stymulacji hemostazy pierwotnej i proliferacji komórek mięśni gładkich w ścianie naczyń krwionośnych. Kolejnym parametrem ocenianym w niniejszej pracy było stężenie α1 antytrypsyny, która poza udziałem w procesach zapalnych, wpływa również na układ hemostazy. W dostępnym piśmiennictwie istnieją doniesienia, potwierdzające zwiększone stężenia białek ostrej fazy, takich jak: prozapalnych cytokin czy fibrynogenu u chorych z hiperkortyzolemią. Wiele niejasności w rozwoju powikłań naczyniowych w tej grupie chorych budzi jednak zachowanie się endogennych inhibitorów proteaz, należących również do białek ostrej fazy, takich jak α1 antytrypsyna. Oceniając stężenia α1 antytrypsyny, stwierdziłam znamiennie wyższe jej wartości w grupie chorych z subklinicznym zespołem Cushinga niż w grupie zdrowych ochotników. Co więcej stwierdziłam znamienne zależności pomiędzy stężeniami α1 antytrypsyny i kortyzolu w teście z 1 mg deksametazonu. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 10

Jak już wcześniej wspomniano, α1 antytrypsyna poza udziałem w procesach zapalnych, wpływa również na układ hemostazy. Poprzez inaktywację elastazy znosi jej działanie na poszczególne parametry układu krzepnięcia i fibrynolizy, obejmujące zmniejszenie aktywności czynników krzepnięcia: II, V, VIII, XII, XIII, oraz wpływ profibrynolityczny. Co więcej, stwierdzono iż α1 antytrypsyna bezpośrednio hamuje aktywne białko C, należące do endogennego układu antykoagulacyjnego, a stężenia kompleksów aktywnej proteiny C i α1 antytrypsyny mogą służyć jako wykładnik dużego ryzyka zakrzepicy. A zatem α1 antytrypsyna pośrednio, inaktywując elastazę, oraz bezpośrednio, stymuluje trombinogenezę oraz hamuje fibrynolizę, co z kolei nasila procesy krzepnięcia. Podsumowując wyniki przedstawionych badań można stwierdzić, iż u chorych z subkliniczną hiperkortyzolemią, dochodzi do zwiększonego stężenia zarówno homocysteiny jak i α1 antytrypsyny, co może skutkować zwiększonym ryzykiem powikłań naczyniowych w tej grupie chorych. Dalsza część moich badań poświęcona była ocenie aktywności czynników krzepnięcia u chorych z hiperkortyzolemią. Badania te stały się podstawą do opublikowania dwóch prac oryginalnych wchodzących w skład osiągnięcia naukowego [Świątkowska-Stodulska R i wsp. Activity of selected coagulation factors in overt and subclinical hypercortisolism, doi:10.1507/endocrj. EJ14-0539 oraz Świątkowska-Stodulska R i wsp. Hageman factor C46T promoter gene polymorphism in patients with hypercortisolism. Horm Metab Res. 2014;46(7):510-514]. Jak już wcześniej wspomniałam zaburzenia układu hemostazy u osób z hiperkortyzolemią mają charakter wielokierunkowy. Osoczowy układ krzepnięcia należy do hemostazy wtórnej, którego istotę stanowi przejście fibrynogenu w sieć przestrzenną fibryny co jest podstawą stabilizacji skrzepu. Zwiększona aktywność osoczowych czynników krzepnięcia stanowi jedną z przyczyn rozwoju zakrzepicy. Podobnie jak w przypadku innych składowych układu krzepnięcia, szczególnie wiele niejasności budzą chorzy z subklinicznym zespołem Cushinga. Dotychczas nie oceniano również zależności pomiędzy aktywnością czynników krzepnięcia a stopniem nasilenia hiperkortyzolemii. W badaniach Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 11

przeze mnie prowadzonych oceniałam aktywności następujących czynników krzepnięcia: VIII, IX, X, XI oraz von Willebranda u pacjentów z pełnoobjawową i subkliniczna hiperkortyzolemią. Porównując aktywności czynników krzepnięcia pomiędzy całą grupą pacjentów z hiperkortyzolemią, obejmującą chorych z subklinicznymym i jawnym zespołem Cushinga, a grupą kontrolną, wykazałam znamienne różnice w zakresie wszystkich badanych parametrów. Znamiennie wyższe średnie aktywności czynników krzepnięcia VIII, IX, X, XI oraz von Willebranda występowały w grupie pacjentów z hiperkortyzolemią. Analizując aktywności badanych czynników krzepnięcia w zależności od stopnia nasilenia hiperkortyzolemii, stwierdziłam znamiennie wyższe średnie aktywności czynników VIII, IX, X, XI i von Willebranda u chorych z pełnoobjawową hiperkortyzolemią niż w grupie kontrolnej. Natomiast pacjenci z subklinicznym zespołem Cushinga prezentowali znamiennie wyższe aktywności czynnika von Willebranda niż osoby z grupy kontrolnej. Obserwowano jednak wyraźną tendencję w kierunku wyższych aktywności wszystkich pozostałych badanych czynników krzepnięcia u pacjentów z subklinicznym zespołem Cushinga. Porównanie aktywności czynników pomiędzy grupą chorych z pełnoobjawową a subkliniczną hiperkortyzolemią wykazało znamienną statystycznie różnicę pomiędzy badanymi grupami dla czynnika IX. Istotnie wyższe jego aktywności występowały u chorych z klinicznie jawną hiperkortyzolemią. W analizie zależności pomiędzy badanymi czynnikami krzepnięcia a wynikami testów hormonalnych, oceniających stopień nasilenia hiperkortyzolemii stwierdziłam znamienne zależności pomiędzy: aktywnością czynnika IX a porannym stężeniem kortyzolu w surowicy, jego dobowym wydalaniem z moczem, oraz wartościami kortyzolu w teście overnight. Z kolei aktywności czynnika X i XI korelowały ze stężeniami kortyzolu w teście overnight. Pozytywne korelacje aktywności czynników krzepnięcia z parametrami hormonalnymi potwierdzają ich zależność od stopnia nasilenia hiperkortyzolemii. Przyczyna podwyższonych stężeń czy aktywności czynników krzepnięcia w hiperkortyzolemii jest złożona. Prozakrzepowe działanie glikokortykoidów wynika z bezpośredniego wpływu tej grupy hormonów na poszczególne parametry hemostazy, jak również ze współistniejących Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 12

zaburzeń metabolicznych. Wiadomo, że otyłość, zaburzenia gospodarki węglowodanowej, nadciśnienie tętnicze czy hiperlipidemia zaburzają hemostazę na wielu poziomach. Decydujący wpływ wydaje się mieć tu insulinooporność z wtórną hiperinsulinemią. Biorąc pod uwagę możliwy wpływ zaburzeń metabolicznych na osoczowy układ hemostazy, w grupie pacjentów z hiperkortyzolemią przeprowadziłam ocenę korelacji pomiędzy BMI, stężeniem cholesterolu całkowitego, poranną glikemią a aktywnościami badanych czynników krzepnięcia. Pomimo znamiennej zależności pomiędzy aktywnością czynnika von Willebranda a stężeniem cholesterolu całkowitego w analizie jednoczynnikowej, uwzględnienie badanych parametrów metabolicznych w analizie wieloczynnikowej nie zmieniło wcześniejszych wyników dotyczących różnic w aktywnościach badanych czynników krzepnięcia pomiędzy grupą chorych z pełnoobjawowym a subklinicznym zespołem Cushinga. Na podstawie wyników przeprowadzonych przeze mnie badań, można stwierdzić, iż u pacjentów z hiperkortyzolemią endogenną stwierdza się wzrost aktywności czynników krzepnięcia VII, IX, X, XI oraz von Willebranda, co świadczy pośrednio o pobudzeniu osoczowego układu krzepnięcia. Stopień tej zwiększonej aktywacji zależy od zaawansowania hiperkortyzolemii. Druga z prezentowanych przeze mnie prac, dotyczących osoczowego układu krzepnięcia jest wynikiem oceny aktywności czynnika Hagemana czyli XII czynnika krzepnięcia, z uwzględnieniem polimorfizmu C46T promotora jego genu. W przeciwieństwie do innych czynników krzepnięcia, jego wysokie stężenie czy aktywność nie koreluje ze wzrostem ryzyka zakrzepicy. Ta proteaza serynowa ma wielokierunkowy wpływ na mechanizmy krzepnięcia i fibrynolizy. W obecności aktywnej formy czynnika XII (αxiia) dochodzi do aktywacji czynnika XI, co inicjuje hemostazę w układzie krzepnięcia. Pod wpływem αxiia aktywacji ulega również prekalikreina do kalikreiny, powodując uwolnienie bradykinin z wielkocząsteczkowego kininogenu, odpowiedzialnych za wazodylatację oraz przepuszczalność naczyń krwionośnych. Osoby z niedoborem czynnika XII wykazują przedłużony czas częściowej aktywacji tromboplastyny (aptt) bez ewidentnych objawów skazy krwotocznej. Obecnie wiadomo, że czynnik Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 13

XI może być aktywowany przez trombinę, niezależnie od αxiia. Wydaje się, że niedobór czynnika XII może jednak znacząco wpływać na zaburzenie fibrynolizy i w konsekwencji zwiększać ryzyko zakrzepowo-zatorowe. W dotychczasowych badaniach potwierdzono zależność aktywności czynnika Hagemana od polimorfizmu jego genu. Istnieją doniesienia, iż homozygoty 46T promotora genu czynnika XII wykazują zmniejszenie jego osoczowego poziomu. Substytucja cytozyny w pozycji 46 na tymidynę w pobliżu inicjującego translację kodonu ATG, powoduje zaburzenie translacji i transkrypcji w hepatocytach miejscu syntezy czynników krzepnięcia. Celem moich badań była ocena polimorfizmu C46T promotora genu czynnika XII oraz ocena aktywności czynnika XII u pacjentów z hiperkortyzolemią endogenną. Analizując częstość występowania polimorfizmu FXII C46T, nie stwierdziłam znamiennych statystycznie różnic pomiędzy grupą osób z hiperkortyzolemią (obejmującą chorych z jawnym i subklinicznym zespołem Cushinga) a grupą kontrolną, obejmującą zdrowych ochotników. Następnie oceniłam zależność pomiędzy aktywnością czynnika XII a rodzajem genotypu FXII C46T. Choć w obu grupach wykazano wyraźną tendencję do najwyższych aktywności czynnika XII u homozygot 46C i do najniższych u homozygot 46T, w analizie statystycznej po uwzględnieniu wpływu płci i wieku, znamienne różnice w zakresie badanego parametru potwierdziłam tylko w grupie kontrolnej. Porównanie średnich aktywności czynnika XII pomiędzy grupą chorych z hiperkortyzolemią i zdrowych nie wykazało znamiennych różnic pomiędzy badanymi grupami. Następnie oceniłam zależności pomiędzy rodzajem genotypu a parametrami hormonalnymi w grupie pacjentów z takimi jak stężenie ACTH, kortyzolu, dobowe wydalanie kortyzolu z moczem, stężenie kortyzolu po 1 mg deksametazonu, nie stwierdzając znamiennych statystycznie korelacji. Na podstawie przeprowadzonych przeze mnie badań wydaje się, iż u pacjentów z hiperkortyzolemią nie dochodzi do istotnych zaburzeń w zakresie stężenia czynnika XII wynikającego z polimorfizmu C46T promotora jego genu. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 14

Dążąc do pełnego wyjaśnienia zaburzeń w układzie krzepnięcia u chorych z zespołem Cushinga, dalszym etapem moich badań była ocena funkcji płytek krwi, biorących udział w hemostazie pierwotnej. Badania te zaowocowały publikacją kolejnej pracy [Świątkowska-Stodulska R. i wsp. Assessment of platelet function in endogenous hypercortisolism. Endocrinol Pol, doi:10.5603/ep.2015.0014]. Płytki krwi pełnią dwie zasadnicze funkcje w hemostazie. Pierwszą z nich jest tworzenie hemostatycznego czopu płytkowego, a drugą udział w aktywacji osoczowego toru krzepnięcia, poprzez dostarczenie ujemnie naładowanych fosfolipidów z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony trombocytów. W procesie krzepnięcia można wyróżnić 3-etapowe działanie trombocytów: adhezję, sekrecję i agregację. Ekspozycja kolagenu w uszkodzonej ścianie wywołuje adhezję płytek, przy pomocy swoistych receptorów kolagenowych w błonie komórkowej płytek oraz czynnika von Willebranda, w przebiegu której dochodzi do ich aktywacji. Proces ten z kolei prowadzi do sekrecji substancji biologicznie czynnych, takich jak: trombina, kolagen, czynnik aktywujący płytki (PAF), difosforan adenylowy (ADP), tromboksan A2, serotonina, promujących agregację płytek krwi i hamujących naturalne czynniki antykoagulacyjne komórek śródbłonka. Pod wpływem czynników aktywujących dochodzi do odsłonięcia fosfatydyloseryny i fosfatydyloetanolaminy- ujemnie naładowanych fosfolipidów, które przyłączają jony wapnia oraz grupy karbonylowe czynników krzepnięcia i w ten sposób biorą udział w hemostazie wtórnej. W pracy oceniałam u pacjentów z hiperkortyzolemią endogenną czynności płytek krwi poprzez ocenę agregacji płytek po stymulacji ADP, kolagenem (odpowiednio ADP-IPA, Col-IPA), IMPACT R (wyrażony jako odsetek powierzchni płyty testowej pokryty płytkami krwi (SC) oraz średnią wielkością (AS) agregatów płytkowych w µm 2 ), będący miarą adhezji płytek krwi oraz czas okluzji (CT) w systemie PFA 100 (Platelet Function Analyser) po aktywacji kolagenem i ADP lub kolagenem i epinefryną (EPI) (odpowiednio Col/ADP CT, Col/EPI CT). Prezentowana praca jest pierwszą oceniającą adhezję płytek w warunkach przepływu naczyniowego (Impact R) jak również czas okluzji, będący wykładnikiem procesów adhezji i agregacji, w pełnej krwi u pacjentów z endogenną hiperkortyzolemią. Należy również podkreślić, że agregacja płytek krwi stymulowana Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 15

ADP i kolagenem oceniana była metodą impedancyjną, odzwierciedlającą warunki fizjologiczne. Pozwala to na ocenę agregacji płytek w obecności, jak już wcześniej wspomniano, innych elementów morfotycznych krwi. W prezentowanej pracy nie stwierdziłam znamiennych różnic pomiędzy pacjentami z hiperkortyzolemią i osobami zdrowymi jak również pomiędzy pełnoobjawowym i subklinicznym zespołem Cushinga w średnich wartościach badanych parametrów (ADP-IPA, Col-IPA, Col/ADP CT, Col/EPI CT, SC i AS). Nie wykazałam również zależności pomiędzy parametrami oceniającymi czynność płytek krwi a wykładnikami hormonalnymi hiperkortyzolemii, takimi jak stężenie kortyzolu w surowicy w godzinach porannych, późnowieczornych, po 1 mg deksametazonu oraz dobowe wydalanie kortyzolu z moczem. Potwierdza to brak wpływu hiperkortyzolemii na badane parametry. Biorąc pod uwagę wyniki moich badań wydaje się, iż agregacja płytek krwi po stymulacji ADP i kolagenem, jak również adhezja oceniana w systemie PFA i Impact R nie ulegają zaburzeniu w endogennej hiperkortyzolemii. W pracy poglądowej [Świątkowska-Stodulska R, Sworczak K. Disorders of hemostasis in overt and subclinical hypercortisolism. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2013;121(10):588-594], opublikowanej w indeksowanym czasopiśmie Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes, dokonałam podsumowania aktualnej wiedzy na temat wpływu glikokortykoidów na układ krzepnięcia i fibrynolizy. Praca odwołuje się do badań i metaanaliz opublikowanych w przodujących na świecie czasopismach z zakresu endokrynologii i koagulologii. W znacznej mierze opierała się także na doświadczeniach i wynikach badań prowadzonych w Klinice Endokrynologii i Chorób Wewnętrznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (wcześniej Klinika Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy). Poza szczegółowym omówieniem zaburzeń w układzie hemostazy u chorych z zespołem Cushinga, w pracy poruszam ważny problem profilaktyki przeciwzakrzepowej w tej grupie pacjentów. Jak już wcześniej wspomniałam dotychczas nie opublikowano standardów profilaktyki w tej grupie chorych. Na podstawie dotychczasowych badań i obserwacji, można stwierdzić, iż u pacjentów z endogenną hiperkortyzolemią wskazane jest włączenie profilaktyki przeciwzakrzepowej Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 16

w okresie okołooperacyjnym oraz w sytuacjach zwiększających ryzyko rozwoju żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Natomiast u chorych z ACTH-zależnym zespołem Cushinga poddanych zabiegowi adenomectomii, sugeruje się wydłużenie okresu profilaktyki przeciwzakrzepowej nawet od 10 do 35 dni po zabiegu. W decyzji o okresie jej stosowania należy wziąć pod uwagę stopień nasilenia i czas trwania hiperkortyzolemii, radykalność leczenia operacyjnego, współwystępowanie innych czynników ryzyka zakrzepicy takich jak: cukrzyca, otyłość, choroba nowotworowa oraz nieprawidłowości w parametrach układu krzepnięcia. Na podstawie przeprowadzonych i opublikowanych przeze mnie badań można wysunąć następujące wnioski: Zaburzenia w układzie hemostazy dotyczą nie tylko chorych z pełnoobjawową ale również subkliniczną hiperkortyzolemią. U chorych z subklinicznym zespołem Cushinga niskie stężenie trombomoduliny może stanowić czynnik zwiększający ryzyko rozwoju zmian zakrzepowych. U chorych z subkliniczną hiperkortyzolemią dochodzi do zmian w endogennym układzie antykoagulacyjnym poprzez wzrost aktywności białka C i wolnej proteiny S. Kierunek tych zmian przemawia przeciwko ich pierwotnej roli w zwiększonym ryzyku rozwoju zmian zakrzepowych. U podstaw wzrostu ryzyka zakrzepicy w tej grupie chorych wydają się nie leżeć również zmiany APC-R czy aktywności antytrombiny. U chorych z subkliniczną hiperkortyzolemią, dochodzi do zwiększonego stężenia zarówno homocysteiny, jak i α1 antytrypsyny, co może skutkować zwiększonym ryzykiem powikłań naczyniowych w tej grupie chorych. U chorych z endogenną hiperkortyzolemią dochodzi do pobudzenia osoczowego układu krzepnięcia. Stopień tej zwiększonej aktywności zależy od stopnia nasilenia hiperkortyzolemii. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 17

U chorych z endogenną hiperkortyzolemią nie stwierdza się zaburzenia hemostazy pierwotnej wyrażonej agregacją płytek krwi po stymulacji ADP i kolagenem, jak również adhezją ocenianą w systemie PFA i Impact R. U chorych z endogenną hiperkortyzolemią należy włączyć profilaktykę przeciwzakrzepową w okresie okołooperacyjnym oraz w innych sytuacjach zwiększających ryzyko rozwoju żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych a) Analiza bibliometryczna Mój dorobek naukowy obejmuje 38 opublikowanych prac o łącznej wartości IF 21,737 liczbie punktów KBN/MNiSzW 339 (włączając publikacje stanowiące osiągnięcie naukowe), Liczba cytowań wg bazy Scopus wynosi 77. Liczba cytowań wg bazy Web of Science wynosi 23. Indeks Hirscha: wg bazy Scopus wynosi 4, wg bazy Web of Science wynosi 3. Listę publikacji nie wchodzących w skład osiągnięcia w rozumieniu art.16 ust.2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym załączono jako odrębny dokument (załącznik 3). Łączna liczba doniesień zjazdowych wynosi 37 Wykaz doniesień zjazdowych znajduje się w załączniku 3. Podsumowanie działalności naukowo-badawczej przedstawia analiza bibliometryczna z dnia 26.05.2015 roku opracowana przez Pracownię Bibliograficzną Biblioteki Głównej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego zgodnie z zasadami przyjętymi przy obliczaniu punktacji na potrzeby analizy bibliometrycznej wymaganej przez Centralną Komisję ds. Stopni i Tytułów, którą zamieszczono w załączniku 6. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 18

b) Tematyka pozostałych prac badawczych Pierwszym krokiem mojej samodzielnej działalności naukowej były studia doktoranckie, które rozpoczęłam w Klinice Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Hemostazy Akademii Medycznej w Gdańsku bezpośrednio po stażu podyplomowym. Początkowo, moją pasją była hepatologia. Po odbyciu stażu w Klinice Gastroenterologii Radcliffe Hospital w Oxfordzie w 1998 roku, rozpoczęłam badania nad rolą układu immunologicznego w patogenezie alkoholowej choroby wątroby, które w 2002 roku zaowocowały pracą doktorską pt.: Interleukiny 6 i 8 w surowicy chorych z alkoholową chorobą wątroby. Po zakończeniu badań stanowiących podstawę rozprawy doktorskiej, oceniałam układ antyoksydacyjny w alkoholowej chorobie wątroby oraz w chorobie Wilsona. Badania te wykazały zwiększoną aktywność układu antyoksydacyjnego wyrażoną: aktywnością enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy nadtlenkowej, peroksydazy glutationu, całkowitego stanu antyoksydacyjnego osocza oraz zwiększonym stężeniem selenu w erytrocytach u pacjentów z chorobą Wilsona. Te enzymy antyoksydacyjne zaliczane są do tzw. zmiataczy wolnych rodników. Poprzez hamowanie działania wolnych rodników, chronią one komórki przed zniszczeniem, utrzymując integralność ich błon komórkowych. Jednymi z głównych enzymów układu antyoksydacyjnego są: dysmutaza nadtlenkowa i peroksydaza glutationu. Oba enzymy, wraz z katalazą, należą do pierwszej linii ochrony komórki przed uszkodzeniem jej przez reaktywne formy tlenu. Wyniki badań opublikowałam w recenzowanych czasopismach zagranicznych i polskich [Świątkowska-Stodulska R, Bąkowska A. Interleukina 6 w surowicy chorych z alkoholową chorobą wątroby. Pol. Merk. Lek. 2004;17:255-259, Świątkowska-Stodulska R i wsp. Interleukin-8 in the blood serum of patients with alcoholic liver disease. Med. Sci. Monit. 2006;12:s.CR215-CR220, Świątkowska-Stodulska R i wsp. Serum selenium concentration in patients with Wilson's disease. Hepatogastroenterology 2007;54:1788-1790, Świątkowska-Stodulska R i wsp. Assessment of selected oxidative stress parameters in patients with Wilson's disease Arch. Med. Sci. 2009;5:465-470]. Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 19

Zmiana profilu Kliniki, w której byłam zatrudniona wpłynęła na podjęcie przeze mnie nowego kierunku badań. Od 2004 roku rozpoczęłam badania nad zaburzeniami układu hemostazy u osób otyłych, które stanowiły wstęp do oceny układu krzepnięcia u chorych z hiperkortyzolemią. Badania prowadziłam początkowo pod kierunkiem Prof. dr hab. med. Eugenii Częstochowskiej, a następnie od 2005 roku pod kierunkiem Prof. dr hab. med. Krzysztofa Sworczaka. W ramach prowadzonych przeze mnie projektów badawczych oceniałam składowe endogennego układu antykoagulacyjnego u osób otyłych: proteiny C, która degraduje i inaktywuje czynniki krzepnięcia Va i VIIIa, poprzez częściową ich proteolizę, antytrombiny inaktywującą czynnik Xa i trombinę, w mniejszym stopniu również czynniki XIIa, XIa i IXa. Oceniałam również aktywność α2 antyplazminy, będącą głównym inhibitorem plazminy, hamującą spontaniczną lizę skrzepów oraz endogennych inhibitorów proteaz, należących do białek ostrej fazy: α1 antytrypsyny czy α2 makroglobuliny. α1 Antytrypsyna jest jednym z najsilniej działających krążących inhibitorów wielu proteaz serynowych, ma zdolność inaktywacji szeregu enzymów proteolitycznych, podobnie jak α2 makroglobulina. Poprzez wiązanie cytokin, czynników wzrostu czy hormonów biorą one bezpośredni i pośredni udział w regulacji różnorodnych procesów biologicznych. Poprzez inaktywację trombiny, kalikreiny, plazminy oraz urokinazy wpływają również na układ krzepnięcia i fibrynolizy. Wyniki badań opublikowałam w recenzowanych czasopismach polskich [Świątkowska-Stodulska R i wsp. Ocena wybranych parametrów układu hemostazy u osób otyłych. Endokrynol Pol 2007;58:505-509; Świątkowska- Stodulska R. i wsp., Assessment of α1 antitrypsin and α2 macroglobulin levels in obese patients. Pol Arch Med Wew 2008;118:712-716]. Porównanie stężeń α1 antytrypsyny, α2 makroglobuliny, aktywności białka C, antytrombiny oraz α2 antyplazminy u otyłych i zdrowych nie wykazało istotnie statystycznych różnic pomiędzy analizowanymi grupami. Oceniając natomiast badane parametry w podgrupach z uwzględnieniem występujących zaburzeń metabolicznych stwierdziłam znamiennie wyższe stężenia α1 antytrypsyny u pacjentów spełniających kryteria zespołu metabolicznego w porównaniu z osobami otyłymi bez współistniejących zaburzeń metabolicznych. Zależności takiej nie wykazałam dla innych badanych parametrów. Może to pośrednio świadczyć o roli procesu zapalnego w rozwoju powikłań naczyniowych w tej grupie pacjentów. Wydaje się natomiast, że za wysokie Renata Świątkowska-Stodulska: Załącznik 2 Strona 20