Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki Metody przeżyciowego barwienia i obserwacji komórek WSTĘP Postęp w syntezie chemicznej fluorochromów a zwłaszcza dalsze ulepszanie konstrukcji mikroskopów świetlnych pozwala dziś śledzić wiele z procesów komórkowych bezpośrednio w żywej komórce i w czasie rzeczywistym. Pomagają w tym również dynamicznie rozwijające się nowe metody akwizycji i obróbki obrazu w celu polepszenia czułości i ostrości uzyskiwanych w mikroskopii obrazów. Ćwiczenie to ma na celu zapoznanie się częściowo w praktyce a częściowo w ramach pokazu z niektórymi zastosowaniami mikroskopii fluorescencyjnej do badania żywych komórek. Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna Zasadnicza różnica pomiędzy tradycyjną mikroskopią w świetle białym i fluorescencyjnym polega na stosowaniu w tym drugim przypadku światła z ograniczonego zakresu widma (uzyskanego przy użyciu wąskopasmowych filtrów optycznych) bądź w skrajnym przypadku światła o jednej długości fali (przy zastosowaniu światła laserowego). Rysunek przedstawia w sposób uproszczony schematy działania mikroskopu konwencjonalnego i konfokalnego. Lewa część rysunku przedstawia schematycznie konwencjonalny (szerokopolowy) mikroskop, w którym obiekt jest oświetlany na dużej przestrzeni przez źródło światła białego, ogniskowanego przez kondensor. W zależności od położenia oświetlanej części obiektu jego obraz znajduje się z różnym miejscu w stosunku do płaszczyzny ostrości. Obraz obiektu w okularze (lub kamerze) jest sumą wszystkich składowych obrazu z różnych miejsc obiektu i jest z tego względu
tylko częściowo ostry, co jest z kolei zależne od głębi ostrości obiektywu. W mikroskopie konfokalnym (prawa część rysunku) wprowadzono dwie przysłony: między obiektem a źródłem światła w celu ograniczenia oświetlanego pola obrazu oraz przed detektorem, który ogranicza światło docierające do detektora wyłącznie do tej jego części, która pochodzi z punktów pochodzących z płaszczyzny ostrości obiektywu. Barwniki specyficzne do DNA. Poza grupą barwników używanych w testach biochemicznych i barwienia żeli, istnieje coraz szersza grupa barwników używanych do wybarwiania DNA w żywych komórkach. Najczęściej używane to pochodne bis-benzimidazolowe (barwniki Hoechst 33258 i 33342), pochodne akrydyny (oranż akrydynowy). Związki te różnią się długością fali światło emitowanego po związaniu się z DNA ale także często długością fali wzbudzenia (wzbudzenie w świetle UV lub widzialnym). Struktura chemiczna barwników bis-benzimidazolowych Hoechst 33342 (R=CH 2 HCH 3 ) i Hoechst 33528 (R=H). Wykorzystywane są również barwniki, które nie przechodzą przez błonę komórkową w związku z czym barwią wyłącznie komórki z uszkodzoną błoną komórkową (w założeniu martwe). Można więc przy stosowaniu dwóch barwników o różnych długościach fali emitowanego światła, z których tylko jeden barwi żywe a drugi żywe i martwe komórki, określać procentowy udział poszczególnego rodzaju komórek w populacji. Można również wykorzystywać aktywność esteraz w cytoplazmie (zamieniających np. kalceinę-am we fluorescencyjną pochodną barwiącą cytoplazmę na kolor zielony) w połączeniu z barwnikami barwiącymi DNA komórek z uszkodzoną błoną komórkową (np. homodimer bromku etydyny barwiący martwe komórki na kolor pomarańczowoczerwony). Testy żywotności komórek jednokomórkowców a zwłaszcza drożdży oparte są na innej zasadzie i polegają na zastosowaniu barwnika FUN-1 zmieniającego kolor w komórkach żywych z żółto-zielonego na pomarańczowo-czerwony. Barwienie organelli komórkowych Istnieje wiele barwników specyficznie barwiących organelle w żywych komórkach. Ich zastosowanie pozwala na śledzenie zmian morfologii i funkcjonalności (w połączeniu z innymi typami testów np. enzymatycznych) organelli w komórkach poddanych działaniu leków, pochodzących od chorych itp.
(A) Komórki nerki psa wybarwione Bodipy FLC 5 -ceramid, kolor zielony (aparat Golgiego), LysoTracker Red, kolor czerwony (lizosomy), Hoechst 33258, kolor niebieski (jądro komórkowe). (B) Komórki tętnicy płuc wołu barwione LysoTracker Red, kolor czerwony (lizosomy), MitoTracker Green FM, kolor zielony (mitochondria). Zmiany w potencjale błon komórkowych Błony mogą poprawnie funkcjonować w komórce jedynie gdy utrzymywany jest na nich potencjał elektryczny. Najwyższy taki potencjał jest na błonie wewnętrznej mitochondriów i istnieje duża grupa fluorochromów wiążących się specyficznie z błonami mitochondriów i zmieniających długość fali emitowanego światła w zależności od wielkości potencjału błonowego. Takie barwniki stosowane są w badaniach stanu metabolizmu mitochondriów (np. przy określaniu zmian w żywotności komórek) czy w sytuacji gdy komórki umierają w wyniku uruchomienia procesu apoptozy, gdyż w tym przypadku jednym z wczesnych etapów śmierci komórkowej jest spadek potencjału błonowego mitochondriów. Komórki fibroblastów mysich NIH/3T3, spadek potencjału po traktowaniu nadtlenkiem wodoru przez podany czas. Barwienie związkiem JC-1, zmiana koloru z pomarańczowego na zielony świadczy o spadającym potencjale na błonie mitochondriów. Pomiar ph wewnątrz komórki
Istnieje grupa bardzo użytecznych fluorochromów służących do pomiaru za pomocą analizy obrazu mikroskopowego wartości ph wewnątrz żywej komórki. Wartości ph wewnątrz komórki wahają się w zakresie od 5 do 8 stąd na różne zakresy ph stosuje się różne barwniki. Najczęściej używane to: barwniki SNARF (zakres ph 7-8), BCECF (zakres ph 6.5-7.5), barwniki LysoSensor (zakres ph 3.5-8.0). Najczęściej pomiar ph za pomocą fluorochromów opiera się na zasadzie porównawczej, gdzie mierzy się jednocześnie fluorescencję przy dwóch różnych długościach fali i stosunek wielkości sygnałów fluorescencji związany jest z określonym ph wewnątrz komórki. W badaniach tych wykonuje się zwykle skalowanie danego układu komórkowego poprzez wyznaczanie krzywych wzorcowych z użyciem komórek permeabilizowanych za pomocą jonoforów (zwykle nigerycyna) i tzw. fizjologicznych buforów o znanych wartościach ph. Rozwinięciem metod pomiaru ph wewnątrz komórki z użyciem fluorochromów jest zastosowanie tzw. mikrospektrofluorymetrii, która jest połączeniem mikroskopu i spektroskopu luminescencyjnego. Po wybarwieniu fluorochromami komórek można za pomocą mikrospektrofluorymetru mierzyć widma fluorescencyjne w małych przekrojach subkomórkowych i mierzyć w ten sposób np. wartości ph w różnych obszarach komórki (jądro, pęcherzyki aparatu Golgiego, siateczki śródplazmatycznej, pojedyncze lizosomy itp.). Obecność reaktywnych form tlenu w komórce W szeregu procesach komórkowych, zarówno fizjologicznych jak i patologicznych, produkowanych jest wiele różnych rodzajów reaktywnych form tlenu. Należą do nich tlen singletowy ( 1 O 2 ), rodnik hydroksylowy (OH. ), różnego rodzaju nadtlenki (ROOR ) i wodoronadtlenki (ROOH). Istnieje wiele barwników pozwalających wykrywać ich zawartość w komórce. Są one utleniane przez te formy tlenu co wiąże się ze zmianą własności fluorescencyjnych. Do częściej używanych fluorochromów służących do wykrywania wolnych rodników tlenowych to: estry dichlorodihydrofluoresceiny (np. H 2 DCFDA), dihydrorodamina 123, dihydroetydyna (hydroetydyna). Ekspresja białek fluorescencyjnych (GFP, RFP, YFP, BFP) Szczególnie popularnym staje się w ostatnich latach stosowanie ekspresji indukowanej białek zawierających sekwencje fluoryzujące w kolorze niebieskim (BFP), zielonym (GFP), żółtym (YFP) czy czerwonym (mcherry, DsRed). Widma wzbudzenia i emisji różnych typów białek fluorescencyjnych (egfp - ang. enhanced green fluorescent protein, białko o wzmocnionej zielonej fluorescencji). Ekspresja białek zawierających sekwencje fluorescencyjne pozwala śledzić zmiany w lokalizacji białek w różnych fazach cyklu komórkowego, interakcję z innymi białkami (przy zastosowaniu jednoczesnej ekspresji białek o sekwencjach fluoryzujących w
różnych zakresach długości fali emisji). W tym drugim przypadku wykorzystuje się też często dodatkowo zjawisko tzw. fotowybielania (gaszenie sygnału fluorescencji) za pomocą wiązki laserowej co pozwala określić dynamikę zmian w lokalizacji danego białka. Zastosowanie białek fluorescencyjnych wraz z wysokorozdzielczą mikroskopią i techniką FRET (ang. fluorescence resonance emission transfer czyli rezonansowe przeniesienie sygnału emisji fluorescencji) pozwala obserwować oddziaływania pomiędzy pojedynczymi cząsteczkami białek w żywych komórkach. Komórki chomika CHO-K1 z ekspresją wektora kodującego GFP (obserwacja mikroskopowa 72h po transfekcji, fluorescencja w kolorze zielonym). PRZEBIEG ĆWICZENIA Ze względu na ograniczenia sprzętowe ćwiczenie ma charakter pokazowy i ma na celu zapoznanie studentów z technikami obserwacji funkcji żywych komórek za pomocą technik mikroskopii fluorescencyjnej a w szczególności. W ramach ćwiczenia studenci otrzymają preparaty, na których wybarwione fluorescencyjnie zostaną organella komórkowe (jądro, mitochondria, lizosomy, aparat Golgiego). Studenci zapoznają się z działaniem mikroskopu fluorescencyjnego i układu analizy obrazu oraz samodzielnie wykonają zdjęcia preparatów.
Mikroskop epifluorescencyjny Olympus BX60, który będzie wykorzystany w trakcie ćwiczeń laboratoryjnych. SPRAWOZDANIE Opisać obserwowane preparaty ze szczególnym uwzględnieniem morfologii i lokalizacji wybarwionych organelli w komórkach. Odnaleźć w literaturze np. w książkach, Internecie itp. ciekawe zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej i opisać je w sprawozdaniu z podaniem źródła zdobytych informacji. Zamieścić i opisać wybrane zdjęcie preparatu przeżyciowego wykonanego na zajęciach. Omówić krótko rolę wybarwionego organellum i możliwe zastosowanie praktyczne takiego barwienia. Zawarte w instrukcji fotografie pochodzą z materiałów firmy Molecular Probes Inc (Eugene, OR, USA) dostępnych na stronie internetowej www.probes.com