Labowe know-how : ELISA Test immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) jest jedną z najpowszechniejszych metod stosowanych w badaniach diagnostycznych i naukowych. Jej zadaniem jest wykrycie i oszacowanie stężenia badanego białka poprzez użycie odpowiednich przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych. Podstawą metody jest tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało, których wykrycie umożliwia sprzężona reakcja enzymatyczna. Technika została po raz pierwszy opisana przez Petera Perlmana i Eve Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie w roku 1971 i doczekała się licznych modyfikacji. Mechanizm działania krok po kroku 1. Do badania używa się płytek, najczęściej polistyrenowych lub pleksiglasowych (szkło akrylowe). Każda płyta składa się ze studzienek (dołków), do których
nakładane są próbki antygenu (w testach pośrednich i bezpośrednich) bądź przeciwciała (w teście kanapkowym i bardziej złożonych wariantach ELISy). Proces ten nazywany jest opłaszczaniem fazy stałej i jest niezbędny na początkowym etapie reakcji. 2. Po opłaszczaniu musimy zablokować miejsca niezwiązane z opłaczającym antygenem/przeciwciałem, a niespecyficznie wiążące białka. W tym celu stosujemy czynniki blokujące takie jak na przykład roztwór owoalbuminy, kazeina (odtłuszczone mleko w proszku), albumina (najczęściej BSA) lub żelatyna. 3. Kolejnym etapem jest dodanie specyficznego dla antygenu przeciwciała lub antygenu (w teście kanapkowym). W tym momencie tworzy się kompleks immunologiczny. 4. By uniknąć niespecyficznego tła reakcji odpłukujemy pozostałe niezwiązane przeciwciała/antygeny. 5. W testach wymagających dodania przeciwciał drugorzędowych wykonujemy kolejną inkubację i odpłukiwanie. 6. Po dodaniu do każdej studzienki odpowiedniego substratu chromogennego dla enzymu, dochodzi do reakcji enzymatycznej, co charakteryzuje się powstaniem barwnego produktu. Intensywność koloru jest sczytywana spektrofotometrycznie przy odpowiedniej długości fali (obecnie stosuje się automatyczne czytniki) i porównywana z krzywą wzorcową, sporządzaną dla znanych stężeń antygenu. Znakowanie przeciwciał: do znakowania przeciwciał używa się najczęściej peroksydazy chrzanowej, rzadziej fosfatazy alkalicznej, oksydazy glukozowej czy beta-galaktozydazy. Każdy z tych enzymów katalizuje in vitro przekształcenie substratu w barwny produkt. Enzymy są koniugowane z przeciwciałem i w tej formie sprzedawane przez producentów. Sprzęganie może być kowalencyjne (mostki disiarczkowe), poprzez łączniki dekstranowe lub wiązanie streptawidynabiotyna. Rodzaje testów Bezpośredni test ELISA
jest to bardzo szybka metoda wykrycia obecności antygenu, aczkolwiek droga i dziś prawie już nie stosowana. Z fazą stałą wiązany jest antygen, natomiast specyficzne przeciwciało, skoniugowane z enzymem znajduje się w roztworze. Konieczność koniugowania z enzymem każdego przeciwciała z osobna spowodowała, że metoda została wyparta przez techniki pośrednie. Pośredni test ELISA -antygen opłaszczający płytkę wykrywany jest przez swoiste, nieznakowane przeciwciało i tworzy z nim kompleks immunologiczny. W kolejnym etapie do studzienek dodawane są skoniugowane z enzymem przeciwciała drugorzędowe, nacelowane na część stałą łańcucha przeciwciała pierwszorzędowego. Jest to genialne posunięcie, pozwala bowiem na dowolny dobór przeciwciał drugorzędowych, które są uniwersalne dla organizmu, z którego pochodzą przeciwciała pierwszorzędowe. Tak więc przeciwciało anty-królicze wykryje każde przeciwciało królicze, a anty-mysie, każde przeciwciało mysie. Jest to typowy test ELISA używany w badaniach naukowych oraz w badaniach jakościowych. Metoda nie grzeszy jednak czułością, dlatego została udoskonalona w postaci testu typu Sandwich. Test kanapkowy (sandwich ELISA)
-służy przede wszystkim do wykrywania i ilościowego oznaczania interesującego nas antygenu w diagnostyce medycznej. Tym razem w fazie stałej znajduje się przeciwciało monoklonalne zerowego rzędu. Z nim łączy się antygen, a następnie po jego odpłukaniu używa się przeciwciała pierwszorzędowego także monoklonalnego,ale nakierowanego na inny epitop badanego białka. Pozwala to na maksymalne zwiększenie specyficzności reakcji. Zwiększenie czułości zapewnia przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem. Zalety metody ELISA jest z pewnością jedną z najważniejszych technik immunoenzymatycznych. Jej zalety to wysoka czułość, duża przepustowość, możliwość półautomatyzacji, a przede wszystkim wynik ilościowy. ELISA w rutynowej diagnostyce znalazła zastosowanie głównie w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej (wykrywanie i monitoring leczenia patogenów), immunologii i serologii (wykrywanie przeciwciał i autoprzeciwciał), toksykologii, onkologii, a także w przemyśle (typowanie szczepów, wykrywanie zanieczyszczeń grzybowych produktów spożywczych) i rolnictwie. Literatura 1. Lequin R (2005), Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Clin. Chem. 51 (12): 2415 8. doi:10.1373/clinchem.2005.051532 2. S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October 2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879 84. PMC 2562869. PMID 18772478.
Paulina Kłos-Wojtczak, Marzena Pieronkiewicz Data publikacji: 16.04.2015r.