MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 301-309 1 Anna Budzyńska, Agnieszka Kaczmarek, Eugenia Gospodarek ZASTOSOWANIE MULTIPLEKS PCR DO IDENTYFIKACJI SZCZEPÓW MRSA I MRCNS W PODŁOŻU STOSOWANYM W AUTOMATYCZNYM SYSTEMIE DO POSIEWU KRWI Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK Wykrywanie techniką PCR patogenów obecnych w dodatnich posiewach krwi systemu BACTEC lub BacT/Alert sprawia wiele trudności ze względu na obecność licznych inhibitorów amplifikacji. Celem niniejszej pracy było opracowanie skutecznej metody umożliwiającej szybkie wykrycie gronkowców w tego rodzaju próbkach i jednoczesne określenie ich oporności na meticylinę. Rozprzestrzenianie się meticylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus (ang. methicillin-resistant S. aureus, MRSA) i gronkowców koagulazo ujemnych (ang. methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, MRCNS) stanowi poważny problem terapeutyczny i epidemiologiczny (6, 9, 13). Drobnoustroje te niejednokrotnie wykazują oporność również na inne antybiotyki tj. makrolidy, tetracykliny, linkosamidy i aminoglikozydy. Szczepy MRSA oraz MRCNS to jedne z częstszych etiologicznych czynników zakażeń i zgonów u chorych z bakteriemią. Stąd, istotne jest, aby w jak najkrótszym czasie móc zidentyfikować izolowany z badanego materiału szczep do gatunku S. aureus lub do mniej patogennej grupy CNS oraz uzyskać wynik oporności na meticylinę (6, 9, 13). Przed podjęciem decyzji terapeutycznych należy wziąć pod uwagę istniejące ryzyko kontaminacji podczas pobierania próbki krwi gronkowcami stanowiącymi naturalną mikroflorę skóry. Dlatego odróżnienie CNS od S. aureus ma istotne znaczenie w postępowaniu terapeutycznym (13). Dotychczas stosowane konwencjonalne metody identyfikacji gronkowców we krwi są czasochłonne ze względu na konieczność prowadzenia wstępnej hodowli, np. w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC (Becton Dickinson) czy BacT/Alert (Biomérieux), a następnie hodowli na podłożach stałych, wykonania testów biochemicznych i oznaczenia lekooporności (6, 14). Mimo, iż hodowla uważana jest nadal za metodę referencyjną, zastosowanie metod diagnostycznych opartych na biologii molekularnej, takich jak PCR, 1 Praca sfinansowana przez Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu w ramach grantu UMK nr 15/2008.
302 A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek Nr 4 pozwala zwiększyć czułość i ograniczyć czas konieczny do identyfikacji gronkowców we krwi. Skrócenie czasu identyfikacji etiologicznego czynnika zakażenia umożliwia ograniczenie stosowania antybiotyków o szerokim zakresie działania, co z kolei zmniejsza ryzyko pojawiania się szczepów wielolekoopornych (9, 16). Celem pracy było określenie przydatności stosowania metody multipleks PCR do identyfikacji meticylinowrażliwych i meticylinoopornych szczepów S. aureus i CNS oraz sprawdzenie, czy wybór metody izolacji DNA gronkowców z podłoża stosowanego w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC, z dodatkiem krwi ludzkiej może wpływać na wynik amplifikacji. MATERIAŁ I METODY Materiał kliniczny. Badaniem objęto 20 szczepów S. aureus i 20 szczepów CNS izolowanych z krwi pobranej od chorych leczonych w klinikach i poradniach przyklinicznych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. W identyfikacji szczepów wykorzystywano ocenę koagulazy związanej i wolnej oraz testy ID 32 STAPH (biomérieux). Wrażliwość na meticylinę oznaczono metodą krążkowo-dyfuzyjną według Kirby-Bauera zgodnie z rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (5) i Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2). Izolacja DNA chromosomalnego. Bakteryjne DNA izolowano z 500 μl zawiesiny drobnoustrojów w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) (Becton Dickinson) o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, a w dalszym etapie badań z 500 μl zawiesiny tych samych szczepów bakterii w podłożu Standard aerobic systemu BACTEC, o gęstości 0,5 McFarlanda, zawierającym 10 ml pełnej krwi ludzkiej. Izolację DNA prowadzono stosując zestaw High Template Preparation Kit (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta, metodę wykorzystującą do lizy Triton X-100 i lizostafinę (9) oraz metodę opartą na lizie alkalicznej (15). Amplifikacja DNA. W reakcji multipleks PCR stosowano startery kodujące fragment genu 16S rrna specyficznego dla gronkowców zaliczanych do rodzaju Staphylococcus, genu clfa swoistego dla drobnoustrojów z gatunku S. aureus oraz genu meca, kodującego oporność na meticylinę. Startery zostały zsyntetyzowane przez Pracownię Sekwencjonowania DNA IBB PAN i charakteryzowały się następującą kolejnością nukleotydów (13): clfa 5 - GCA AAA TCC AGC ACA ACA GGA AAC GA 3, clfa 5 - CTT GAT CTC CAG CCA TAA TTG GTG G 3, meca 5 - TCC AGG AAT GCA GAA AGA CCA AAG C 3, meca 5 - GAC ACG ATA GCC ATC TTC ATG TTG G 3, 16S rrna 5 - CCT ATA AGA CTG GGA TAA CTT CGG G 3, 16S rrna 5 - CTT TGA GTT TCA ACC TTG CGG TCG 3. Reakcję optymalizowano przy użyciu DNA izolowanym przy użyciu zestawu High Template Preparation Kit z hodowli w podłożu TSB szczepu kontrolnego S. aureus ATTC 43300 MRSA. Stanowiło ono w dalszych etapach badań kontrolę dodatnią wszystkich analizowanych genów. W skład każdej próbki mieszaniny reakcyjnej wchodził: bufor inkubacyjny 1x, 2,0 mm MgCl 2, 0,2 mm dntps, sześć starterów, każdego w stężeniu 0,1 μm, 2,5 U polimerazy termostabilnej GoTaq (Promega), 200 ng BSA (ang. Bovine Serum Albumine) (Roche) oraz 5,0 μl izolowanego DNA. Kontrolę ujemną PCR stanowiła mieszanina reakcyjna z wodą zamiast DNA. Amplifikację prowadzono w objętości 25 μl w termocyklerze
Nr 4 PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS 303 GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), zachowując następujące warunki reakcji: początkowa denaturacja w temp. 94 C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli o profilu: denaturacja w temp. 94 C przez 30 sekund, przyłączanie starterów w temp. 53 C przez 30 sekund, synteza nici DNA w temp. 62 C przez minutę oraz końcowe wydłużanie nici przez 7 minut w temperaturze 72 C. Obecność zamplifikowanych fragmentów sprawdzano wykonując rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym (Sigma) wybarwionym bromkiem etydyny (10 mg/ml). Elektroforezę prowadzono w buforze 1xTBE (BioRad) w obecności wzorca wielkości GeneRulerTM100bp (Fermentas). Wyniki dokumentowano w świetle UV za pomocą systemu GelDoc 2000 (BioRad). WYNIKI W pierwszym etapie badań oceniano zastosowanie techniki multipleks PCR w identyfikacji meticylinowrażliwych i meticylinoopornych gronkowców izolowanych z zawiesiny drobnoustrojów w TSB każdą z wymienionych metod ekstrakcji DNA. O wykryciu drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus świadczyła obecność produktu reakcji PCR o wielkości 791 par zasad, o identyfikacji szczepu S. aureus - drobnoustrojów z 638 par zasad, a o oporności na meticylinę - produkt o wielkości 499 par zasad (Ryc. 1). W tabeli I przedstawiono wyniki klasycznej i molekularnej metody wykrywania drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus i identyfikacji gronkowców zaliczanych do gatunku S. aureus oraz oznaczania meticylinooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną i techniką PCR. Zgodność wyników porównywanych metod dotyczyła 100% badanych szczepów. Prawidłowe wyniki amplifikacji uzyskano dla DNA po ekstrakcji każdą z trzech wymienionych wcześniej metod. W drugim etapie badań określano możliwość zastosowania w reakcji PCR materiału genetycznego izolowanego przy użyciu każdej z metod z zawiesiny w podłożu Standard (+) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-) M 16S rrna clfa meca 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 Ryc. 1. Elektroforegram produktów amplifikacji regionu 16S rrna (791 par zasad), genu clfa (638 par zasad) i genu meca (499 par zasad). Ścieżki 2-10 badane próby (2 MRSA; 3-4 MSSA; 5-7 MRCNS; 8-10 MSCNS); (+) kontrola dodatnia; (-) kontrola ujemna; M wzorzec wielkości DNA GeneRuler 100bp (Fermentas).
304 A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek Nr 4 Tabela I. Porównanie fenotypowej i genotypowej metody wykrywania drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus, identyfikacji gronkowców S. aureus oraz określania meticylinooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną i techniką PCR. Gatunek Liczba szczepów Wynik testu na katalazę Obecność genu 16S rrna Obecność koagulazy związanej (CF) Obecność genu clfa Metoda krążkowodyfuzyjna z cefoksytyną (30µg) Obecność genu meca S. aureus 4 + + + + S - 4 + + + + R + CNS 6 + + - - S - 6 + + - - R + S. aureus ATTC 43300 1 + + + + R + S wrażliwy, R - oporny Tabela II. Porównanie skuteczności trzech metod izolacji DNA gronkowców z TSB i podłoża stosowanego w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC z dodatkiem krwi ludzkiej. Metoda izolacji High Template Preparation Kit Z użyciem Triton X-100 i lizostafiny Oparta na lizie alkalicznej Obecność produktów amplifikacji DNA izolowanego z zawiesiny bakterii Liczba szczepów w podłożu Standard aerobic w TSB systemu Bactec z dodatkiem pełnej krwi ludzkiej 4 MSSA + - 4 MRSA + - 6 MSCNS + - 6 MRCNS + - 4 MSSA + + 4 MRSA + + 6 MSCNS + + 6 MRCNS + + 4 MSSA + + 4 MRSA + + 6 MSCNS + - 6 MRCNS + - aerobic systemu Bactec z dodatkiem pełnej krwi ludzkiej (Tabela II). W przypadku metody izolacji z użyciem Triton X-100 i lizostafiny uzyskano prawidłowy profil amplifikacji dla wszystkich badanych szczepów. Wykorzystując metodę izolacji opartą na lizie alkalicznej dodatnie wyniki reakcji PCR uzyskano dla szczepów należących do gatunku S. aureus. W przypadku próbek DNA izolowanych od CNS stwierdzono brak produktów amplifikacji. Wyniki fałszywie ujemne otrzymano dla wszystkich próbek DNA izolowanych zestawem
Nr 4 PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS 305 High Template Preparation Kit. Zastosowanie kontroli dodatniej reakcji PCR wykluczało możliwość popełnienia błędu podczas nastawiania reakcji. DYSKUSJA Możliwość stosowania szybkiej i czułej techniki multipleks PCR do wykrywania i różnicowania meticylinowrażliwych i meticylinoopornych gronkowców odgrywa duże znaczenie w dobie narastania oporności na antybiotyki betalaktamowe. Standardowe metody mikrobiologiczne umożliwiają identyfikację tych drobnoustrojów w dodatnim posiewie krwi w ciągu 24-48 godzin, podczas gdy reakcja amplifikacji skraca ten czas do około 4-6 godzin i pozwala jednocześnie uzyskać informację dotyczącą oporności na meticylinę na podstawie obecności genu meca w materiale genetycznym wykrytych bakterii. Wielu autorów opisuje wykorzystanie techniki PCR do identyfikacji drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus i oceny ich meticylinooporności (6, 9, 10, 17, 19). Większość protokołów skierowana jest na wykrycie S. aureus na podstawie obecności genów kodujących nukleazę (nuc) lub koagulazę (coa) bez możliwości potwierdzenia zakażenia, którego czynnikiem etiologicznym są CNS. Wykorzystanie starterów komplementarnych do fragmentu drugiego z wymienionych genów niesie ze sobą ryzyko pojawienia się błędów podczas amplifikacji i/lub interpretacji wyniku, ponieważ badania wykazały polimorfizm genu coa (4, 18). Maes i wsp. (10) w reakcji tripleks PCR wykrywali gen 16S rrna specyficzny dla rodzaju Staphylococcus, gen nuc oraz meca. Pierwszy z wymienionych genów wykryto u wszystkich badanych szczepów gronkowców, z wyjątkiem gatunku S. sciuri, u którego w przypadku jednego spośród trzech badanych szczepów uzyskano również wynik fałszywie ujemny dotyczący oporności na meticylinę. Może to wskazywać na różnice w genomie na odcinku sekwencji docelowej S. sciuri i konieczność zaprojektowania nowych starterów. Vannuffel i wsp. (19) do tego samego celu zastosowali reakcję multipleks PCR z użyciem starterów flankujących oprócz sekwencji genu meca, gen fema, swoisty dla S. aureus oraz region IS431 występujący w dużej liczbie kopii w genomie wyłącznie gronkowców. Późniejsze badania (8) wykazały brak sekwencji inercyjnej IS431 u dużego odsetka (80%) szczepów MSSA, co wyklucza stosowanie jej jako markera zakażeń gronkowcowych. Jaffe i wsp. (6) skupili się na wykrywaniu obecności bakterii w badanej próbce materiału, rozpoznaniu drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus i określeniu ich meticylinooporności, bez identyfikacji gronkowców zaliczanych do gatunku S. aureus, które mają dla klinicysty istotne znaczenie. Wykorzystanie zaproponowanych starterów znacznie ogranicza dodatkowo fakt, że amplifikacja genów kodujących poszczególne cechy dokonywana była oddzielnie. Louie i wsp. (9) na podstawie obecności lub braku genów nuc, meca oraz bakteryjnego 16S rrna, stanowiącego wewnętrzną kontrolę reakcji PCR, prawidłowo identyfikowali gatunek S. aureus i określali lekowrażliwość wszystkich szczepów gronkowców obecnych w badanych próbkach materiału. Brak starterów amplifikujących fragment DNA swoisty dla rodzaju Staphylococcus uniemożliwił jednak odróżnienie MSCNS od innych bakterii. W badaniach własnych do identyfikacji S. aureus wybrano startery komplementarne do fragmentu genu clfa, kodującego czynnik clumping factor A, białko wiążące fibrynogen, obecne wyłącznie u tego gatunku. Amplifikacja konserwatywnego wśród gronkowców z rodzaju Staphylococcus i unikalnego dla tego rodzaju regionu 16S rrna umożliwiała
306 A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek Nr 4 wykrywanie CNS, a odcinka genu meca rozpoznanie szczepów opornych na meticylinę. Zastosowanie reakcji multipleks PCR pozwoliło skrócić czas oczekiwania na wynik do około 6 godzin. Specyficzność w niniejszej pracy została oceniona na 100%. Prawidłowe wyniki amplifikacji uzyskali również Schmitz i wsp. (17), którzy wykorzystali w reakcji multipleks PCR 4 pary starterów komplementarnych do sekwencji flankujących fragmenty genów: specyficzny dla gronkowców 16S rrna, coa, meca oraz konserwatywny region bakteryjnego 16S rrna. Badania prowadzone na 686 szczepach gronkowców i 100 szczepach bakterii należących do innych rodzajów, wykazały 100% korelacji pomiędzy metodą molekularną a fenotypową, z wyjątkiem danych dotyczących obecności genu meca, które dały odmienne wyniki dla 10 szczepów. Metodę amplifikacji fragmentu genu kodującego białko PBP-2a uważa się jednak za złoty standard ze względu na trudności w wykrywaniu szczepów meticylinoopornych wynikające z heterogennej natury tej oporności (6). Mimo, że w badaniach własnych nie stwierdzono niezgodności metody fenotypowej i genotypowej, należy uwzględnić możliwość pojawienia się niskiego odsetka szczepów opornych na antybiotyki beta-laktamowe, u których dochodzi do nadprodukcji beta-laktamaz, niezwiązanej z wytwarzaniem białka PBP-2a. Badanie genetyczne ukierunkowane wyłącznie na wykrywanie genu meca nie umożliwia detekcji tego typu mechanizmu oporności i w związku z tym nie jest wystarczającym dowodem wrażliwości badanego szczepu na beta-laktamy. Jedną z ważniejszych przyczyn niepowodzeń w wykorzystaniu techniki PCR do identyfikacji drobnoustrojów w dodatnich próbkach sygnalizowanych przez automatyczny system do hodowli drobnoustrojów z krwi jest wybór niewłaściwej metody izolacji bakteryjnego DNA. W próbce krwi obecne są inhibitory amplifikacji, takie jak związki hemu i DNA leukocytów (1), które powinny być zinaktywowane lub usunięte z pobranego materiału. Standardowe techniki oczyszczania DNA nie umożliwiają usunięcia inhibitorów reakcji PCR, takich jak polianetosulfonian sodowy (SPS), antykoagulant dodawany do podłoży namnażających. Ze względu na podobieństwo chemiczne tego związku z DNA (rozpuszczalność w wodzie i nierozpuszczalność w alkoholach) w wyniku działania mieszaniny fenol-chloroform oczyszcza się wraz z kwasem nukleinowym. Dlatego opracowuje się szereg metod mających na celu pozbawienie próbki wpływu inhibicyjnego tej substancji (3, 15, 16). Jaffe i wsp. (6) porównywali dwie techniki izolacji bakteryjnego DNA z dodatnich hodowli krwi sygnalizowanych w systemie BACTEC: z użyciem kulek szklanych i Chelex-100 oraz komercyjny zestaw QIAamp blood and tissue kit (QIAGEN). Obie metody okazały się skuteczne, a podstawowe różnice dotyczyły, m.in. ich czułości i czasu trwania. Pierwszą z wymienionych technik cechował krótki czas (około 20 min) niezbędny do wyekstrahowania DNA, ale jednocześnie niska czułość (10 9 jtk/ml), nie zawsze osiągana w czasie sygnalizowania wyniku dodatniego przez automatyczny system do posiewu krwi. Louie i wsp. (9) wykorzystali prostą, szybką i tanią technikę ekstrakcji DNA gronkowców z 236 dodatnich hodowli w podłożach stosowanych w systemie BacT/Alert. Badania własne potwierdzają skuteczność zastosowanej przez badaczy metody izolacji, bowiem jako jedyna spośród porównywanych, pozwoliła otrzymać DNA pozbawione inhibitorów reakcji PCR. Amplifikacja wybranych genów po ekstrakcji DNA opartej na lizie alkalicznej możliwa była tylko w przypadku S. aureus. Izolacja materiału genetycznego z zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda dla wszystkich badanych szczepów wyklucza fałszywie ujemne wyniki spowodowane zbyt niskim inokulum. Natomiast technikę tę z powodzeniem zastosowali Wellinghausen i wsp. (20) do identyfikacji, przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym,
Nr 4 PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS 307 patogenów będących najczęstszą przyczyną sepsy oraz Karahan i wsp. (7) do wykrywania DNA bakterii lub grzybów techniką PCR w dodatnich posiewach krwi uzyskanych w systemach zarówno BacT/Alert, jak i BACTEC. Millar i wsp. (15) ekstrahowali DNA jednego szczepu S. aureus z podłoża stosowanego w systemie BacT/Alert z dodatkiem krwi ludzkiej. Spośród 10 porównywanych przez badaczy metod izolacji tylko wspomniana wyżej, wykorzystująca lizę alkaliczną dała dodatnie wyniki. Istotne jest więc, aby podczas amplifikacji DNA izolowanego z hodowli z dodatkiem krwi każdorazowo stosować kontrolę dodatnią reakcji PCR. Podobnie jak w niniejszej pracy, autorzy ci udowodnili brak skuteczności zestawu High Template Preparation Kit. Może być on jednak z powodzeniem wykorzystywany do izolacji DNA bezpośrednio z krwi, o czym świadczą wcześniejsze doniesienia (11, 12). Na ich podstawie wnioskować można, że inhibitory reakcji PCR obecne w roztworze wyizolowanego tą techniką DNA pochodzą nie z samej krwi, ale z podłoży stosowanych w systemach BacT/Alert, czy BACTEC. WNIOSKI 1. Technika multipleks PCR jest dobrym narzędziem diagnostycznym umożliwiającym szybką identyfikację meticylinowrażliwych i meticylinoopornych szczepów S. aureus i CNS. 2. W przypadku dodatnich hodowli uzyskanych w automatycznym systemie do posiewu krwi kluczową rolę odgrywa wybór właściwej metody izolacji DNA, który ma być wykorzystany w dalszej analizie molekularnej. A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek APPLICATION OF MULTIPLEX PCR FOR IDENTIFICATION OF MRSA AND MRCNS STRAINS IN MEDIUM OF AUTOMATIC BLOOD CULTURE SYSTEM SUMMARY Rapid detection and identification of methicillin-resistant staphylococci in patient s blood is essential for the prompt antimicrobial therapy of infection. Molecular-based diagnosis, in comparison to conventional methods, allows to increase sensitivity and to reduce time necessary to achieve positive results and also enable to test susceptibility. The aim of the study was the use of multiplex PCR to detect region of the 16S rrna that is unique to staphylococci, the S. aureus-specific clfa gene and the meca gene which is a determinant of methicillin resistance, in a medium of the BACTEC blood culture system. Three different extraction methods were examined in order to ascertain the most suitable method to isolate staphylococcal DNA. The only method which removed PCR inhibitors contained in BACTEC blood culture material use Triton X-100 and lysostaphyin to lysis bacterial cells. The use of High Template Preparation Kit failed to yield a positive result in all investigated probes. Third of the methods, based on alkali lysis, resulted in DNA which could be amplified by PCR only in case of S. aureus blood culture. The findings of our study suggest that not all DNA extraction methods are appropriate because some of them may not remove potent amplification inhibitors found in blood and medium of system BACTEC.
308 A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek Nr 4 PIŚMIENNICTWO 1. Akane A, Matsubara K, Nakamura H i inni. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. Forensic Sci. 1994; 39: 362-72. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing; seventeenth informational supplement. Document M100-S17. Wayne, PA: CLSI (2007). 3. Fredricks DN, Relman DA. Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol 2003; 36: 2810-6. 4. Hookey JV, Richardson JF, Cookson BD. Molecular Typing of Staphylococcus aureus based on PCR restriction fragment length polymorphism and DNA sequence analysis of the coagulase gene. J Clin Microbiol 1998; 36: 1083-9. 5. Hryniewicz W, Sulikowska A., Szczypa K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2006 (ze zmianami wprowadzonymi w 2007 roku: http://www.korld.edu.pl/pdf/zmiany_rekomendacji_11-2007.pdf). 6. Jaffe RI, Lane JD, Albury SV, Niemeyer DM. Rapid extraction from and direct identification in clinical samples of methicillin-resistant staphylococci using the PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 3407-12. 7. Karahan ZC, Mumcuoglu I, Guriz H i inni. PCR evaluation of false-positive signals from two automated blood-culture systems. J Med Microbiol 2006; 55: 53-7. 8. Kobayashi N, Alam M, Urasawa S. Analysis on distribution of insertion sequence IS431 in clinical isolates of staphylococci. Diagn Microbiol Inf Dis 2001; 39: 61-4. 9. Louie L, Goodfellow J, Mathieu P i inni. Rapid detection of methicillin-resisttant staphylococci from blood culture bottles by using a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 2002; 40: 2786-90. 10. Maes N, Magdalena J, Rottiers S i inni. Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from coagulase-negative staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures. J Clin Microbiol 2002; 40: 1514-7. 11. Makhoul IR, Smolkin T, Sujov P i inni. PCR-based diagnosis of neonatal staphylococcal bacteremias. J Clin Microbiol 2005; 43: 4823-5. 12. Makhoul IR, Yacoub A, Smolkin T i inni. Values of C-reactive protein, procalcitonin, and Staphylococcus-specific PCR in neonatal late-onset sepsis. Acta Paediatr 2006; 95: 1218-23. 13. Mason WJ, Blevins JS, Beenken K i inni. Multiplex PCR protocol for the diagnosis of staphylococcal infection. J Clin Microbiol 2001; 39: 3332-8. 14. Mączyńska B, Przondo-Mordarska A. Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń uogólnionych. Sepsis 2008; 1: 73-81. 15. Millar BC, Jiru X, Moore JE, Earle JAP. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast and fungal DNA from blood culture material. J Microbiol Methods 2000; 42: 139-47. 16. Peters RPH, van Agtmael MA, Danner SA i inni. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis 2004; 4: 751-60. 17. Schmitz FJ, MacKenzie CR, Hofmann B i inni. Specific information concerning taxonomy, pathogenicity and methicillin resistance of staphylococci obtained by multiplex PCR. J Med Microbiol 1997; 46: 773-8. 18. Schwarzkopf A, Karch H. Genetic variation in Staphylococcus aureus coagulase gene: potential and limits for use as epidemiological marker. J Clin Microbiol 1994; 32: 2407-12. 19. Vannuffel P, Gigi J, Ezzedine H i inni. Specific detection of methicillin-resistant Staphylococcus species by multiplex PCR. J Clin Microbiol 1995; 33: 2864-7.
Nr 4 PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS 309 20. Wellinghausen N, Wirths B, Franz AR i inni. Algorithm for the identification of bacterial pathogens in positive blood cultures by real-time LightCycler polymerase chain reaction (PCR) with sequence-specific probes. Diagn Microbiol Inf Dis 2004; 48: 229-41. Otrzymano: 18 XI 2009 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu