Wybrane, współczesne metody badań struktury i funkcji komórek Materiał do badań biologii komórek (organizmów) Chemiczne składniki komórek Metody badań struktury i funkcji komórek Współczesne badania mikroskopowe Barwienia cytochemiczne Wizualizacja cząsteczek w Ŝywej komórce Autoradiografia Badania biochemiczne i molekularne w biologii komórki 1
Mikroskopy świetlne Zespół mechaniczny: podstawa statyw stolik przedmiotowy tubus rewolwer śruba makro- i mikrometryczna Mikroskopy świetlne wykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych źródło światła przesłona kondensor obiektyw Zespół optyczny: oświetlacz pośrednie układy optyczne okular obraz mikroskopowy: pozorny, silnie powiększony, odwrócony 2
Mikroskopy świetlne Zdolność rozdzielcza mikroskopu λ d = κ --------- 2 A A = n x sin α A = apertura numeryczna λ = długość fali światła tworzącego obraz κ = współczynnik zaleŝny od stosunku A kondensora do A obiektywu α = kąt między osią optyczną a skrajnym promieniem wpadającym do obiektywu n = współczynnik załamania fali w środowisku 2α Ob K gdy A = 1,4 i λ = 0,45µm d = 0,2 µm Wizualizacja komórek przejrzystych Kontrastowanie komórek: barwienia specjalne odmiany mikroskopów Mikroskopy: kontrastowo-fazowe interferencyjne polaryzacyjno-interferencyjne z układem optycznym Nomarskiego 3
Mikroskop kontrastowo-fazowy Fizyk holenderski Frits Zernike 1931-35 -opracował zasadę kontrastu-faz; 1953 - nagroda Nobla bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natęŝenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu przesłona pierścieniowa kondensora płytka fazowa w obiektywie Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy Mikroskopy świetlne specjalne odmiany mikroskopów B A C Komórki epitelialne z hodowli in vitro: A) mikroskopia jasnego pola, B) kontrastowo--fazowa, C) kontrastu róŝnicowego Nomarskiego, 4
Mikroskopy świetlne specjalne odmiany mikroskopów Fibroblast (HSF) z hodowli; zdjęcie spod mikroskopu: A) jasnego pola, B) kontrastu-faz, C) kontrastu róŝnicowego Nomarskiego, D) ciemnego pola Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje zjawisko fluorescencji substancji : obecnych w komórce: chlorofil, witamina A, porfiryny, lipofuscyny wprowadzonych (znaczniki fluorescencyjne): fluoresceina, rodamina, oranŝ akrydyny, DAPI, Hoechst, bromek etydyny, Alexa, Cyto... 5
Mikroskop fluorescencyjny oświetlenie epi Mikroskop fluorescencyjny Wrzeciona mitotyczne w metafazie u embriona muszki owocowej Drosophila (DNA wybarwione na zielono; mikrotubule wrzeciona na czerwono). Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli (DNA wybarwione na niebiesko; mikrotubule wrzeciona na zielono). 6
uniwersalny mikroskop badawczy wykorzystanie róŝnych odmian mikroskopii świetlnej przy uŝyciu 1 przyrządu wizualizacja i analiza procesów biologicznych z wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów mikroskopowych (chłodzone kamery CCD); moŝliwości poklatkowej rejestracji obrazów; cyfrowy zapis obrazów i analiza. Mikroskopy elektronowe transmisyjny mikroskop elektronowy (TME) cewki magnetyczne próŝnia TME dla preparatów biologicznych: d- 2nm, pow. do 1mln razy 7
Mikroskopy elektronowe transmisyjny mikroskop elektronowy Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy SME dla preparatów biologicznych: d - od 3 do 20 nm 8
Mikroskopy elektronowe skaningowy mikroskop elektronowy 10µm Mikrografia szczurzych fibroblastów z hodowli in vitro ( na podłoŝu plastikowym) 10µm Mikrografia komórek droŝdŝy piekarskich 1. Utrwalanie Mikroskopy elektronowe przygotowanie materiału do mikroskopii - aldehyd glutarowy, utrwalacze złoŝone (ph i osmolarność) 2. Osmowanie (utrwalanie wtórne) - czterotlenek osmu (0,5%-2,5%) 3. Odwadnianie - roztwory alkoholu lub acetonu o wzrastających stęŝeniach 4. Zatapianie -Ŝywice epoksydowe -Ŝywice akrylowe (polarne) 9
Mikroskopy elektronowe przygotowanie materiału do mikroskopii 5. Krojenie skrawków - krojenie na ultramikrotomie grubość:20-60 nm noŝe szklane lub diamentowe 6. Montowanie skrawków - siatki (śr. 3mm) z miedzi, niklu, złota 7. Kontrastowanie skrawków - octan uranylu (białka, kwasy nukleinowe) cytrynian ołowiu (lipidy, wielocukry) Wizualizacja struktur komórki Klasyczne barwienia cytologiczne (histologiczne) Metody immunocytochemiczne oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem Autoradiografia metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych dzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej 10
Barwienia cytologiczne (histologiczne) Hematoksylina jądra powinowactwo do cząsteczek ujemnie naładowanych (DNA, RNA, kwaśne białka) Eozyna- substancja międzykomórkowa Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki Immunocytochemia Znaczniki: fluorochromy enzymy metale cięzkie antygen -kaŝda substancja w komórce, która ma właściwości immunogenne przeciwciało - immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi róŝnorodność swoistość przeciwciał 11
Immunocytochemia Metody wizualizacji białek w Ŝywej komórce Aequorea vicotria Genetyczne znakowanie białek - białka fuzyjne wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genem kodującym badane białko (technika rekombinacji DNA) śledzenie znakowanych białek w Ŝywych komórkach egff; BFP, RFP, YFP 238 aa GFP (green fluorescent protein) - zielono białko fluoryzujące (cykliczny trójpeptyd: ser-tyr-glic ) 12
Materiał do badań biologii komórki Pobieranie materiału z organizmów Hodowle komórkowe Organizmy modelowe Hodowla komórek i tkanek utrzymanie przy Ŝyciu oddzielonych od organizmu komórek (w warunkach sztucznych), in vitro hodowla dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju - poŝywki: odpowiedni skład, ph, osmolarność poŝywki naturalne (osocze, wyciągi tkankowe) poŝywki sztuczne (zdefiniowane; z dodatkiem surowicy) - temperatura, %CO 2 13
zachowanie jałowości - jałowość całej procedury hodowli - naczynia hodowlane - antybiotyki Hodowla komórek i tkanek mioblasty w hodowli Fibroblasty w hodowli komórek prekursorowych oligodendrocytów 14
Organizmy modelowe w badaniach Cecha małe rozmiary i proste poŝywienie duŝa liczba potomstwa krótki cykl Ŝyciowy mały genom duŝe chromosomy dostępność informacji i technik badawczych Zalety hodowla nie wymaga duŝo miejsca, jest łatwa i tania w utrzymaniu pozwala na wiarygodną analizę statystyczną wzorów dziedziczenia umoŝliwia obserwację wzorów dziedziczenia w kolejnych pokoleniach mała ilość DNA do analizy; łatwiej badać chromosomy w mikroskopie świetlnym wiele genetycznych mutantów jest dostępnych do analiz Organizmy modelowe -Prokarionty Escherichia coli (pałaczka okręŝnicy) (Enterobacteriaceae) Gram-ujemna bakteria flora bakteryjna jelita grubego symbiont podział co 20min Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i 2µm; 0,8µm translacji 1 kolista cząsteczka DNA 4,6 mln par zasad; 4300 białek od 15 tys. do 30 tys. rybosomów 15
Organizmy modelowe -Eukarionty Organizmy jednokomórkowe Saccharomyces cerevisiae - droŝdŝe piekarskie DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej) 6 275 genów (5800 funkcjonalnych) 23% genomu droŝdŝy - jak u ludzi kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont) Poznanie mechanizmów cyklu komórkowego komórki eukariotycznej Rośliny modelowe bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin kwiatowych (200mln lat) z 300 000 gatunków Arabidopis thaliana - rzodkiewnik pospolity 5-30 cm Łatwość hodowli w szklarniach hydroponiczna Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja Badania mechanizmów rozwoju i róŝnicowania roślin kwiatowych 16
Zwierzęta modelowe Caenorhabditis elegans - nicień Genom 97 mln par zasad 19 000 genów sekwencja znana 959 komórek 70% białek człowieka ma odpowiedniki u C. elegans Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów (apoptozy) Drosophila melanogaster - muszka owocowa Samiec i samica genom (4 chromosomy) 185 mln par zasad 13 000 białek Poznanie podstaw genetyki klasycznej i mechanizmów rozwoju zarodkowego i larwalnego 17
Kręgowce modelowe Danio rerio Danio pręgowany (ryby) Genom 1,527,000,581par zasad 17 330 genów białek sekwencja znana Szybki rozwój Łatwość uzyskiwania mutantów Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów kręgowców Mus musculus Mysz domowa (ssaki) Prosta i tania hodowla DuŜa liczba potomstwa Zarodki myszy moŝna łatwo hodować in vitro Zarodki hodowane in vitro moŝna poddawać licznym manipulacjom np. nokauty genowe Uzyskiwanie myszy transgenicznych (z ekspresją obcego genu) Linie myszy z mutacjami genowymi lub skonstruowanymi genami Izolacja i hodowla in vitro komórek ES Genom: sekwencja poznana mysz ma 2,7 mld par zasad, człowiek ok. 3,1 mld par zasad, mysz ma 20 par chromosomów, człowiek - 23 pary Poznanie mechanizmów działania wielu genów na poziomie komórki i całego organizmu 18
Homo sapiens człowiek (ssaki) Badania na róŝnorodnych komórkach ludzkich w hodowlach in vitro ( defekt w genie kit - komórki barwnikowe) PoniewaŜ geny człowieka mają ścisłe odpowiedniki u organizmów prostszych, to badania tych organizmów (modelowych) mogą być kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują organizmy zwierzęce i organizm człowieka. Chemiczne składniki komórek Zbudowane z takich samych pierwiastków jak materia nieoŝywiona 65% 96,5% masy komórek H, O, C i N Pierwiastki chemiczne w komórkach: - makroelementy (pierwiastki biogenne) H, O, C, N, S, P Ca, Mg, K, Na, Cl >1% suchej masy - mikroelementy Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F 0,01% - 0,00001% suchej masy 18% - ultraelementy Ra, Au, Ag, Pt, Se <10-6 % suchej masy 3% 19
Komórki wykorzystują prawa fizyki i chemii, aby przeŝyć Chemia komórki opiera się na związkach C (związki organiczne) zaleŝy od reakcji przebiegających w środowisku wodnym, wąskim zakresie temperatur wykazuje ogromną złoŝoność zdominowana przez cząsteczki polimerowe zachodzące reakcje są ściśle kontrolowane (miejsce, czas) Chemiczne składniki komórek DNA RNA białka jony nieorganiczne 1% małe cząsteczki organiczne 3% makrocząsteczki 26% polisacharydy ogromne zagęszczenie cząsteczek dynamika ruchu i oddziaływań cząsteczek 20
Skład chemiczny komórki bakteryjnej % masy komórki liczba rodzajów cząsteczek jony nieorganiczne 1 20 małe cząsteczki organiczne 3 800 cukry i ich prekursory 1 250 aminokwasy i prekursory 0,4 100 nukleotydy i prekursory 0,4 100 kwasy tłuszczowe i prekur. 1 50 inne 0,2 300 makrocząsteczki 26 3000 Małocząsteczkowe związki organiczne: masa cząst. 100 1000 do ok. 30 atomów C cukry, aminokwasy, nukleotydy, kwasy tłuszczowe ok. 1000 rodzajów cząsteczek w komórce eukariotycznej wolne cząsteczki w cytoplazmie jednostki monomeryczne makrocząsteczek elementy konstrukcyjne makrocząsteczek i struktur komórkowych źródło energii inne funkcje (sygnałowe) 21
Cukry - małocząsteczkowe związki Monosacharydy (CH 2 O) n n = 3 7 C 6 H 12 O 6 - róŝnorodność stereoizomeria n- liczba C 2 n - stereoizomerów D- galaktoza D- glukoza D-mannoza izomeria optyczna L- glukoza D- glukoza Monosacharydy - pochodne cukrów glukozy kwas glukuronowy glukozoamina N-acetyloglukozoamina Disacharydy (dwucukry) - róŝnorodność 11 róŝnych disacharydów z kondensacji 2 cząsteczek glukozy 22
Małocząsteczkowe związki organiczne - aminokwasy R łańcuch boczny forma niezjonizowana forma zjonizowana 20 aminokwasów powszechnych (α-amiokwasów) biogennych kwaśne (Asp, Glu) zasadowe (Lys, Arg, His) polarne bez ładunku (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr) niepolarne (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp, Cys) aminokwasy izomeria optyczna formy D- i L- aminokwasów D i L-alanina L- aminokwasy białka D- aminokwasy ściany komórek bakterii antybiotyki jednostki monomeryczne peptydów, polipeptydów, białek 23
Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy adenina Nukleotydy: rybonukleotydy deoksyrybonukleotydy film ryboza adenozyna ATP trifosforan Zasady azotowe: pirymidynowe: cytozyna (C), tymina, (T) uracyl (U) Purynowe: adenina (A), guanina (G) Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy krótkotrwałe nośniki energii chemicznej (ATP, GTP) nośniki innych grup chemicznych cząsteczki sygnałowe (camp) połączone z innymi cząsteczki (CoA) monomery kwasów nukleinowych (przekaz informacji biologicznej) 24
Małocząsteczkowe związki organiczne kwasy tłuszczowe R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy), C: 14-24 zwykle 16-18 łańcuchy nasycone łańcuchy nienasycone (cis) cząsteczka amfipatyczna kwasu palmitynowego kwasy tłuszczowe C 18; 1= C 18 kwas oleinowy kwas stearynowy C 18; 2= kwas linolenowy C18; 3= w komórkach (zwykle) : estry lub amidy; kwas linolowy 25
Pochodne kwasów tłuszczowych triacyloglicerole (tłuszcze obojętne) estry kwasów tłuszczowych i glicerolu materiał energetyczny fosfolipidy glikolipidy Inne lipidy steroidy pochodne glicerolu lub sfingozyny składniki błon plazmatycznych terpenoidy (poliizoprenoidy) Makrocząsteczki Ogólna reakcja uzyskiwania/degradacji makrocząsteczek H- -OH + H- - - - +H 2 O hydroliza - H 2 O kondensacja H - - - - - wiązania kowalencyjne glikozydowe peptydowe fosfodiestrowe podjednostka - makrocząsteczka 26
Makrocząsteczki róŝnorodność sekwencji Białko o łańcuchu 150 aminokwasów - 20 150 kombinacji DNA o łańcuchu 10 000 nukleotydów - 4 10 000 kombinacji Trisacharyd - setki kombinacji (łańcuchy rozgałęzione) róŝnorodność konformacji (elastycznośc łańcuchów) łączenie podjednostek w odpowiedniej kolejności = sekwencja reakcje katalizowane przez enzymy unikatowy układ przestrzenny makrocząsteczek - wiązania niekowalencyjne: wodorowe jonowe van der Waalsa hydrofobowe własności biologiczne 27
Makrocząsteczki wiązania niekowalencyjne -wybiórcze wiązanie innych cząsteczek powierzchnie nie pasują, ruchy termiczne rozdzielają cząsteczki powierzchnie pasują, cząsteczki związane - wiązania niekowalencyjne aminokwasy - peptydy/ polipeptydy/ białka polarność strukturalna wiązanie peptydowe α-helisa; β-harmonijka; superhelisa; oligomeryzacja Filmy sekwencja peptydu: Phe-Ser-Glu-Lys 28
kwasy nukleinowe wiązanie fosfodiestrowe DNA; RNA filmy peptyd G-A-T-C 29