Reakcje charakterystyczne sacharydów Cel ćwiczenia Ćwiczenie poświęcone jest budowie i właściwościom sacharydów. Stosowane w doświadczeniach sacharydy (glukoza, fruktoza, arabinoza, sacharoza, maltoza, skrobia i glikogen) oraz przewidziane w ćwiczeniu reakcje są tak dobrane, aby na podstawie ich wyników możliwe było zaklasyfikowanie nieznanego sacharydu do określonej grupy strukturalnej. Wprowadzenie Właściwością sacharydów bardzo często wykorzystywaną w ich oznaczeniach jest zdolność do redukowania innych związków, wynikająca z obecności wolnych grup aldehydowej bądź ketonowej w ich cząsteczkach. W środowisku obojętnym i silnie kwaśnym dominuje forma pierścieniowa cukrów natomiast w środowisku zasadowym dochodzi do otwarcia pierścienia cukrowcowego i uwolnienia grupy aldehydowej lub ketonowej. Właściwości redukujące mają wszystkie monosacharydy, natomiast spośród disacharydów te, których wiązanie glikozydowe utworzone jest z udziałem jednego węgla acetalowego. W takiej cząsteczce disacharydu może bowiem nastąpić w roztworze otwarcie pierścienia piranozowego lub furanozowego z odtworzeniem grup: aldehydowej bądź ketonowej. Rys.1. Wzory Hawortha najczęściej występujących mono- i disacharydów
Wszystkie polisacharydy praktycznie nie wykazują właściwości redukujących ze względu na zbyt małą ilość grup redukujących w stosunku do ilości cząsteczek cukru prostego wchodzącego w ich skład. Najbardziej znane próby służące do badania właściwości redukujących polegają na redukcji przez cukier kationów metali, np.: Cu +2 próba Benedicta, Barfoeda. Cukry utleniają się w tej reakcji do hydroksykwasów. Cukry pod wpływem stężonych kwasów nieorganicznych (HCl, H 2 SO 4 ) ulegają odwodnieniu i cyklizacji. W reakcjach tych powstają pochodne furfuralowe. Heksozy tworzą w tych warunkach 5-hydroksymetylofurfural, a pentozy furfural (Rys.2). Powstałe pochodne furfuralowe mogą kondensować z pochodnymi związków fenolowych dając barwne związki (reakcje: Molischa, Biala i Seliwanowa). Reakcje wykorzystujące działanie silnych kwasów na cukry mogą służyć do odróżniania pentoz od heksoz (reakcja Biala), bądź też aldoz od ketoz (reakcja Seliwanowa). Rys.2. Powstawanie pochodnych furfuralowych w reakcjach cukrowców ze stężonymi kwasami nieorganicznymi. Reakcje charakterystyczne cukrowców Molischa - wszystkie cukry proste, oligosacharydy i polisacharydy dają pozytywny wynik reakcji Molischa. Oligosacharydy i polisacharydy ulegają najpierw hydrolizie do monosacharydów. Następnie cukry proste w wyniku odwodnienia przechodzą w furfural lub hydroksymetylofurfural, które kondensują z α-naftolem dając fioletowy produkt kondensacji (Rys.3). Rys.3. Molischa charakterystyczna dla wszystkich cukrowców.
Benedicta zachodzi w środowisku zasadowym, sprzyjającym przesunięciu równowagi między formą pierścieniową i łańcuchową sacharydu w kierunku reaktywnej formy łańcuchowej. W tych warunkach reakcji następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu 2+ redukują się do jonów Cu + wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku miedziawego (Cu 2 O). Obecny w odczynniku Benedicta cytrynian trisodowy zapobiega wytrącaniu się osadu Cu(OH) 2, co może nastąpić przy małej ilości cukru (Rys.4). Wszystkie monosacharydy wykazują właściwości redukujące dając pozytywny wynik reakcji Benedicta. Pozytywny wynik tej reakcji dają tylko te disacharydy, w których jeden z monosacharydów ma wolny atom węgla anomerycznego. Ten monosacharyd może przechodzić wówczas w formę łańcuchową i dzięki temu nadaje właściwości redukujące cząsteczce disacharydu. Disacharydy utworzone z dwóch cukrów prostych połączonych poprzez oba atomy węgli anomerycznych (np. sacharoza) nie wykazują właściwości redukujących ze względu na brak możliwości odtworzenia wolnej grupy karbonylowej. Hydroliza kwasowa sacharozy polega na rozpadzie sacharozy na cukry proste: glukozę i fruktozę pod wpływem jonów H + i i podwyższonej temperatury, dzięki czemu można zaobserwować pozytywny wynik reakcji Benedicta. Benedicta przed hydrolizą skrobi - skrobia jako polisacharyd nie wykazuje właściwości redukujących, dlatego nie można zaobserwować pozytywnego wyniku tej reakcji. Benedicta po hydrolizie skrobi - skrobia pod wpływem kwasów ulega stopniowej hydrolizie przez stadium dekstryn, poprzez maltozę aż do glukozy. W miarę postępu hydrolizy wzrastają właściwości redukujące. Rys.4. Benedicta pozwalająca wykrywać sacharydy redukujące. Barfoeda - redukcja jonów miedziowych Cu +2 do Cu + przeprowadzana jest w środowisku słabo kwaśnym, co powoduje znaczne obniżenie reaktywności sacharydów Czerwony osad Cu 2 O powstaje w reakcji z monosacharydem wkrótce po ogrzaniu mieszaniny reakcyjnej.
ta pozwala na odróżnienie monosacharydów od disacharydów redukujących. Disacharydy redukujące ze względu na niższą reaktywność wolnych grup karbonylowych dają pozytywny wynik tej reakcji po dłuższym ogrzewaniu. Biala służy do odróżniania pentoz od heksoz. Pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej (Rys.5). Rys.5. Biala służąca wykrywaniu pentoz. Seliwanowa służy do odróżniania ketoz od aldoz. W reakcji tej produkt odwodnienia ketoz hydroksymetylofurfural kondensuje z rezorcynolem tworząc produkt o barwie łososiowej (Rys.6). W celu rozróżnienia ketoz od aldoz ważne jest zachowanie odpowiednich warunków tej reakcji: kwasu o odpowiednim stężeniu (12% HCl) oraz odpowiedniego czasu ogrzewania. Przy użyciu bardziej stężonego kwasu oraz wydłużeniu czasu ogrzewania również aldozy dają pozytywny wynik reakcji z rezorcynolem. Rys.6. Seliwanowa charakterystyczna dla ketoz. z jodem - skrobia i glikogen tworzą z jodem barwne połączenia, polegające na adsorpcji jodu na powierzchni koloidowych cząsteczek tych polisacharydów. Skrobia tworzy z jodem połączenie fioletowo-niebieskie, glikogen natomiast brunatno-czerwone. Identyfikacja nieznanego cukru w roztworze W celu identyfikacji nieznanego cukru przeprowadzić kolejno reakcje w oparciu o tabelę nr 1. Odczynniki 1. 1% roztwór L-arabinozy. 2. 1% roztwór D-glukozy. 3. 1% roztwór D-fruktozy. 4. 1% roztwór maltozy. 5. 1% roztwór sacharozy. 6. 0,25% roztwór skrobi
7. 0,25% roztwór glikogenu 8. Stężony kwas solny. 9. Stężony kwas siarkowy. 10. 5% alkoholowy roztwór α-naftolu. 11. Odczynnik Benedicta 12. Odczynnik Barfoeda 13. Odczynnik Biala 14. Odczynnik Seliwanowa 15. Roztwór jodu w jodku potasu 16. 5M HCl 17. 5M NaOH Wykonanie Studenci na ćwiczeniach 3 godzinnych wykonują reakcje charakterystyczne tylko dla mono- i disacharydów, natomiast studenci na ćwiczeniach 4 godzinnych wszystkie reakcje. 1. Molischa. Odmierzyć do dwóch probówek po 0,5 ml dowolnych roztworów sacharydów. Do obydwu probówek dodać po 1 lub 2 krople α-naftolu (10), wymieszać i następnie po ściance pochylonej probówki wprowadzić powoli 1,5 ml stężonego kwasu siarkowego (9) tak, aby spłynął on na dno probówki. Nie mieszać. 2. Benedicta charakterystyczna dla sacharydów redukujących. Odmierzyć do czterech probówek po 0,5 ml: do pierwszej glukozy (2), do drugiej maltozy (4) do trzeciej sacharozy (5) a do czwartej skrobi (6). Do każdej probówki dodać 1,25 ml odczynnika Benedicta (11) i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. 3. Hydroliza kwasowa sacharozy i skrobi (hydrolizę kwasową skrobi wykonują studenci na ćwiczeniach 4 godzinnych). Odmierzyć 0,5ml 0,25% skrobi(6) do jednej probówki i 0,5ml 1% sacharozy (5) do drugiej dodać po 0,1 ml 5M HCl(16) do każdej i ogrzewać 10 min we wrzącej łaźni wodnej. Próby ostudzić i dodać po 0,1ml 5M NaOH (17) do każdej oraz dodać po 1,25ml odczynnika Benedicta (11) i ogrzewać kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. 4. Barfoeda charakterystyczna dla monosacharydów redukujących. Odmierzyć do jednej probówki 0,5 ml glukozy (2), a do drugiej 0,5 ml maltozy (4). Dodać po 1,25 ml odczynnika Barfoeda (12), wymieszać i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej. 5. Seliwanowa charakterystyczna dla ketoz. Odmierzyć do jednej probówki 0,5 ml fruktozy (3), do drugiej 0,5 ml glukozy (2), dodać po 1,5 ml odczynnika Seliwanowa (14) i ogrzewać przez 1 minutę we wrzącej łaźni wodnej. 6. Biala charakterystyczna dla pentoz. Do dwóch probówek odmierzyć po 2 ml odczynnika Biala (13) i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml arabinozy (1), do drugiej 0,5 ml glukozy (2), wymieszać i ogrzewać przez kolejne 5 minut. 7. skrobi i glikogenu z jodem. Do jednej probówki wlać 1ml skrobi (6), a do drugiej 1ml roztworu glikogenu (7). Do obu probówek dodać kroplę roztworu jodu w jodku potasu (15). 8. Identyfikacja nieznanego sacharydu. Pobrać z pokoju laboranta roztwór nieznanego sacharydu (próbę do zbadania), przeprowadzić odpowiednie reakcje charakterystyczne
pozwalające na stwierdzenie, który z badanych poprzednio rodzajów sacharydu znajdował się w tym roztworze. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy podać wnioski wypływające z wykonanych reakcji charakterystycznych oraz ich zasadę. Które z tych reakcji były konieczne dla jednoznacznego określenia sacharydu w nieznanym roztworze, jaki to był sacharyd? Benedicta Barfoeda Biala Seliwanowa z jodem * Glukoza Fruktoza Arabinoza Sacharoza Maltoza Skrobia* + + + _ + _ + + + _ + + _ + _ + Tabela nr 1. Identyfikacja nieznanego sacharydu; + pozytywny wynik reakcji - brak reakcji * identyfikację skrobi wykonują studenci na ćwiczeniach 4 godzinnych Pytania 1. Napisać wzory form α- i β-: glukozy oraz fruktozy; wyjaśnić różnice. 2. Napisać wzory sacharozy i maltozy. Jakie wiązania występują w tych disacharydach? 3. Które z wykonywanych na ćwiczeniu reakcji są wspólne dla roztworów: glukozy, fruktozy i arabinozy, a które pozwolą na ich odróżnienie. Na jakiej zasadzie oparte jest to rozróżnienie? 4. Która z wykonywanych na ćwiczeniu reakcji pozwoli na odróżnienie roztworów sacharozy i maltozy? Na czym polega ta reakcja? 5. Wyjaśnić, dlaczego w reakcji z odczynnikiem Seliwanowa uzyskuje się łososiowe zabarwienie próby nie tylko w roztworze fruktozy, ale również w roztworze sacharozy? 6. Czy skrobia i glikogen mają właściwości redukujące? Odpowiedź uzasadnić. Literatura 1. C. Barfoed (1873) Über die Nachweisung des Traubenzuckers neben Dextrin und verwandten Körpern. Fresenius' Zeitschrift für Analytische Chemie 12 (1): 27-32.
2. R. D. Simoni, R. L. Hill, M. Vaughan (2002) Benedict s Solution, a reagent for measuring reducing sugars: the clinical chemistry of Stanley R. Benedict. J. Biol. Chem. 277 (16): 10-11. 3. T. Seliwanoff (1887) Notiz über eine Fruchtzuckerreaction. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 20 (1), 181 182. 4. K.-D. Flossmann, W. Erler (1971) Zum Mechanismus der Farbreaktion von DNA und 2- Desoxyribose mit Orcin. J. Prakt. Chem. 313 (2): 314 330. 5. E. Baldwin, D. J.Bell (1955) Cole's Practical Physiological Chemistry, Cambridge.