R E C E N Z J A rozprawy doktorskiej

Wrocław, 1.03.2014 r. Prof. dr hab. Jan Oszmiański Katedra Technologii Owoców, Warzyw i Zbóż Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu R E C E N Z J A rozprawy doktorskiej Recenzja przedłożonej rozprawy doktorskiej mgr inż. Kamili Borowiec pt. Aktywności anty-cholinoesterazowe, przeciwutleniające i przeciwcukrzycowe owoców borówki czarnej (Vaccinium myrtillus L. w kontekście choroby Alzheimera), wykonanej w Katedrze Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie składa się z oceny następujących elementów: 1.Dobór i znaczenie tematu. 2.Bibliografia i znajomość literatury. 3.Układ pracy i wymogi formalne. 4.Zastosowana metodyka badań. 5.Koncepcja rozwiązania problemu naukowego i przedstawionych wyników. 6.Prawidłowość wnioskowania. 7.Ocena końcowa. Ad. 1.Ocena doboru i znaczenia tematu Na choroby cywilizacyjne jak cukrzyca, choroba Alzheimera, w dużym stopniu wpływa właściwy tryb życia, warunki środowiskowe i odżywianie. Spożywanie produktów bogatych w substancje przeciwutleniające odgrywa istotną rolę w profilaktyce tych chorób. Wśród składników diety o dużej zawartości substancji bioaktywnych są owoce jagodowe, w tym szczególnie bogate w te związki owoce borówki czarnej. Autorka w rozprawie doktorskiej podjęła się trudnego zadania oceny poznania składników owoców borówki czarnej w poprawie funkcji pamięci i wpływu na mechanizmy rozwoju choroby Alzheimera i cukrzycy. Z wykorzystaniem najnowocześniejszej aparatury analitycznej jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią masową (LC-MS), technik NMR FT-IR izolowała, identyfikowała i oceniała inhibitory cholinoesteraz. Przedstawiona do recenzji praca obejmowała ponadto badania składników borówki czarnej na przeżywalność komórek układu pokarmowego, mutagenność i poziom uszkodzeń DNA. Praca ma dużą wartość poznawczą w zakresie oceny diety zawierającej owoce borówki czarnej w badaniach in vivo na szczurach na ich wzrost, parametry biochemiczne

2 krwi, pamięć krótko- i długoterminową. Wartość praktyczną pracy stanowi ocena warunków technologicznych otrzymywania soku z owoców borówki czarnej na hamowanie aktywności cholinoesteraz i aktywność przeciwutleniającą. Doktorantka podjęła się bardzo trudnego, ważnego dla nauki, interesującego tematu badań. Ad. 2. Ocena bibliografii i znajomości literatury Bibliografia pracy jest imponująco bogata, liczy aż 500 publikacji i dwie strony internetowe przedstawiające zagadnienia związane z tematem badań. W tym tylko 18 prac jest w języku polskim pozostałe są w języku angielskim. Świadczy to o dużej dociekliwości i pracowitości w gromadzeniu informacji ze światowej literatury z zakresu przeprowadzonych przez doktorantkę badań. Recenzent nie ma zastrzeżeń odnośnie znajomości tematu, zakresu i sposobu wykorzystania przedstawionej literatury. Ad. 3. Ocena układu pracy i wymogów formalnych Praca przedłożona do recenzji w formie maszynopisu zawiera 179 stron tekstu łącznie z wykazem literatury. Konstrukcja pracy jest zgodna z wymogami pisania rozpraw i oparta na podziale rzeczowym. Składa się z wprowadzenia literaturowego, hipotez badawczych i celu pracy, rozdziałów części doświadczalnej obejmujących opis materiału i metod badawczych, oraz metod analitycznych, przedstawienia wyników, dyskusji oraz wniosków. Wyniki badań zamieszczone są na 59 dobrze przygotowanych rysunkach i w 7 tabelach. We wstępie, w części literaturowej pracy na 35 stronach przedstawione są informacje o chorobie Alzheimera i cukrzycy oraz zależności między tymi chorobami. Część wstępu poświęciła Doktorantka charakterystyce borówki czarnej, jej składnikom bioaktywnym, aktywności przeciwutleniającej oraz możliwości wykorzystania tego surowca w profilaktyce cukrzycy i choroby Alzheimera. Zagadnienia te są ściśle związane z przedmiotem Jej badań, wykazała się bardzo dobrą ich znajomością. Bardzo trudny materiał opracowany na bogatym piśmiennictwie Autorka przedstawiła bardzo szczegółowo wykazując się wyjątkowo bogatą wiedzą z zakresu medycyny. Ilość szczegółowych opisów zagadnień medycznych w tej części pracy wskazuje, że może być absolwentką Uniwersytetu Medycznego a nie Uniwersytetu Przyrodniczego. Do tej części pracy nie mam uwag, powinien oceniać te fragmenty specjalista z medycyny. 2

3 Dalszy fragment pracy dotyczący borówki czarnej napisany jest poprawnie. W przypadku tego owocu częściej przez biologów używana jest nazwa borówka czernica a nie borówka czarna. W tej części pracy są drobne błędy w nazewnictwie związków fenolowych. Na stronie 34 w opisie rysunku 6 nazwy antocyjanów powinny zawierać informacje o sposobie połączenia cukrów z aglikonem np. zamiast delfinidyno-3-galaktozyd powinno być delfinidyno-3-o-galaktozyd, w naturze występują wiązania przez tlen i węgiel. Autorka niepoprawnie rozróżnia nazwy związków podaje jako dwie oddzielne grupy proantocyjanidyny i procyjanidyny (s.35, w. 21; s.38 w. 10). Proantocyjanidyny to nazwa ogólna tej grupy związków, do których należą poszczególne podgrupy: procyjanidyny, prodelfinidyny, propelargonidyny itd. Do tej części pracy nie mam żadnych innych zastrzeżeń. Hipoteza badawcza i cel pracy zostały przedstawione poprawnie, cele szczegółowe jasno sformułowane w czterech punktach. W części doświadczalnej pracy na 25 stronach zaprezentowany jest opis materiału badawczego, przebiegu badań oraz dokładne opisy wykonania doświadczeń i zastosowanych metod analitycznych. Niektóre oznaczenia wykonywano we współpracy z innymi ośrodkami badawczymi w Lublinie, Poznaniu, Łodzi i Warszawie. Na stronie 54 podano: Owoce borówki czarnej rozdrobniono (15 min., Thermomix TM31 ). Jaką ilość owoców rozdrabniano w ciągu tych 15 min? Dlaczego absorbancję w oznaczaniu rodników ABTS mierzono przy 700 nm a nie jak powszechnie wykonuje się te pomiary przy maksymalnej długości fali 734 nm? Rozdział 5. Wyniki badań jest przedstawiony na 54 stronach, podzielony w logiczny sposób na podrozdziały zgodnie z kolejnością przeprowadzonych doświadczeń. Dotyczy on kolejno badań nad hamowaniem inhibitorów cholinoesteraz przez wyciągi z owoców borówki czernicy, izolowania inhibitorów tych enzymów, ich charakterystyki, wzorcowych związków występujących w owocach borówki, ultrafiltratu z tego surowca z wykorzystaniem komórek układu pokarmowego, wpływ diety wzbogaconej w owoce borówki na wzrost, stan pamięci i parametry biochemiczne szczurów, ostatnią część stanowi przedstawienie wyników doświadczeń nad oceną preparatów enzymatycznych stosowanych w produkcji soku z borówki na jego wybrane parametry. Wyniki badań są bogato ilustrowane dobrze przygotowanymi rysunkami, tabelami oraz uzupełnione obliczeniami statystycznymi. W rozdziale tym są drobne błędy jak np. kropki po tytułach rysunków i tabel. Autorka niepoprawnie używa określenia próby zamiast próbki (np. podpisy rys. 35 i 36). 3

4 Dyskusję wyników zamieszczono jako osobny rozdział 6. Dyskusja wyników. Została ona poprawnie przeprowadzona na podstawie bogatej bibliografii i zakończona podsumowaniem. Na początku tego rozdziału jest nieścisłość na stronie 128 w zdaniu w wierszach 11-15 Autorka podaje, że wykazano zdolność hamowania aktywności ChE przez owoce borówki czarnej, a w kolejnym zdaniu, że w piśmiennictwie brak jest informacji o zdolności do hamowania aktywności ChE przez owoce borówki czarnej. W końcowej części rozprawy doktorskiej mgr inż. Kamila Borowiec przedstawiła 12 wniosków i stwierdzeń dotyczących najważniejszych wyników. Ostatni rozdział to poprawnie przygotowany spis literatury, brak jest natomiast streszczenia pracy. Ad.4.Ocena zastosowanej metodyki badań Autorka zastosowała w swych badaniach bardzo różnorodne, nowoczesne techniki analityczne mierząc absorbancję z wykorzystaniem czytnika mikropłytek w pomiarach zdolności hamowania enzymów i aktywności przeciwutleniającej. Do izolowania związków stosowała niskociśnieniową chromatografię kolumnową, wysokosprawną chromatografię cieczową w skali preparatywnej i analitycznej. Identyfikowała i oznaczała związki z użyciem spektroskopii w podczerwieni (FT-IR) we współpracy z PAN w Lublinie, spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego NMR i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas LC-MS we współpracy z UMCS w Lublinie. Badania cytotoksyczności i mutagenności przeprowadziła we współpracy z pracownikami WNoŻiŻ Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Wpływ diety na zachowanie szczurów wykonała z wykorzystaniem labiryntu krzyżowego we współpracy z Uniwersytetem Medycznym w Lublinie. Badania biochemiczne krwi szczurów wykonała w Centrum Badań Weterynaryjnych w Łodzi, a markery cukrzycowe w Weterynaryjnym Laboratorium Diagnostycznym LAB-WET w Warszawie. Zastosowane metody były wyjątkowo złożone i czasochłonne, wymagały dużego nakładu pracy, szkoda że nie w pełni pozwoliły zrealizować założony ambitny cel badań. W zakresie izolacji i identyfikacji związków chemicznych borówki czernicy, mimo wykonania ogromnej ilości doświadczeń z wykorzystaniem niskociśnieniowej chromatografii preparatywnej z której zebrała aż 1040 frakcji, jednak z powodu zbyt niskiej ich aktywności hamowania ChE zrezygnowała z izolacji związków tą metodą. Podobnie zastosowanie wysokosprawnej preparatywnej i analitycznej chromatografii cieczowej z wielokrotnymi powtórzeniami (87 powtórzeń) nie pozwoliło Jej na uzyskanie zadowalających rezultatów. Szkoda, że mimo wykonywania badań w wielu ośrodkach nie miała możliwości użycia w 4

5 celu izolacji związków z ekstraktu borówki czernicy metody przeciwprądowej chromatografii cieczowej (Counter Current Chromatography CCC). Technika ta daje możliwość rozdzielania związków z niekompletnie oczyszczonych próbek. CCC jest odmianą chromatografii cieczowej, która wykorzystuje bezkrzemionkowe kolumny w układzie ciecz-ciecz. Zaletą jej jest niskie zużycie rozpuszczalników, krótki czas analizy, wysoka wydajność, czystość >99%, odzysk >90%, brak strat próbki, denaturacji i nieodwracalnej adsorpcji próbki. Tą droga można uzyskać większe ilości izolowanych próbek ułatwiających identyfikację. W przypadku metod zastosowanych przez Doktorantkę ilości otrzymanych substancji były niewystarczające do dokładnego ustalenia struktury metodą NMR. Jest ona tego świadoma i podaje że izolowanie inhibitorów ChE wymaga dalszych badań, w szczególności w skali preparatywnej, by zyskać dostateczne ilości materiału do kolejnych prac badawczych (s.133, w. 16-17). Inne zastosowane metody badawcze były właściwie dobrane, wymagały dużego wkładu pracy, zwłaszcza ze względu na konieczność współpracy z innymi ośrodkami badawczymi z wielu miast Polski. Tak kompleksowe badania wniosły wiele nowych informacji z zakresu poznania aktywności anty-cholinoesterazowej, przeciwutleniającej i przeciwcukrzycowej owoców borówki czernicy w kontekście choroby Alzheimera. Część analityczna, w która obejmowała dużą ilość bardzo trudnych, czasochłonnych i pracochłonnych analiz zasługuje na szczególne podkreślenie i stanowi najwartościowsze osiągnięcie Autorki pracy. Duża ilość badań pozwoliła na uzyskanie wielu nowych informacji z tego zakresu. Ad.5.Ocena koncepcji rozwiązania problemu naukowego i przedstawionych wyników Badania mgr inż. Kamili Borowiec dotyczyły trudnego i ambitnego zadania oceny żywieniowego aspektu wykorzystania borówki czernicy dla poprawy funkcji pamięci i wpływu na mechanizmy rozwoju choroby Alzheimera i cukrzycy. Były one przeprowadzone, kompleksowo i w szerokim zakresie. Szczegółowe zadania dotyczyły izolowania i identyfikacji z tego surowca związków o zdolności inhibicji enzymu cholinoesterazy istotnego w rozwoju tych chorób. Autorka badała także wpływ owoców borówki na parametry przyżyciowe komórek układu pokarmowego, mutagenność i poziom uszkodzenia DNA. Oceniała wpływ diety szczurów zawierających owoce borówki na pamięć i parametry biochemiczne krwi. Ostatnią część stanowiły doświadczenia technologiczne oceny wpływu 5

6 procesu obróbki enzymatycznej miazgi borówki na zawartość związków hamujących aktywności cholinoesteraz i aktywność przeciwutleniającą przez otrzymane z niej soki. Założenia i koncepcja rozwiązania problemu naukowego w pracy doktorskiej mgr inż. Kamili Borowiec były poprawne, gorzej było z realizacją najtrudniejszej części dotyczącej izolowania inhibitorów cholinoesteraz z owoców borówki. Mimo, że Autorka dysponowała powszechnie stosowanymi technikami do izolacji tych substancji jak niskociśnieniowa chromatografia preparatywna na kolumnie z żelem Sephadex LH-20 i możliwością szybkiej kontroli hamowania aktywności AChE przez każdą frakcję, których zebrała 1040 nie uzyskała zbyt pozytywnych efektów izolacji związków o odpowiedniej aktywności. Wadą tej metody był długi czas procesu i niska aktywność substancji zawartych we frakcjach. W kolejnym etapie do izolowania związków Doktorantka zastosowała chromatografię cieczową wysokosprawną preparatywną. Metoda ta posłużyła do rejestracji chromatogramów dla różnych wybranych długości fali charakterystycznych dla poszczególnych grup związków. Okazało się substancje absorbujące światło UV przy 245 nm wykazywały zdolność hamowania aktywności badanego enzymu. Jak wynika z chromatogramów przedstawionych na rys. 23 i 25 rozdziały związków nie były zbyt dobre dlatego słusznie zastosowała w dalszym etapie chromatografię wysokosprawną z użyciem kolumny analitycznej z możliwością badania widm w zakresie UV-Vis. Jednakże tą drogą nie można uzyskać dostatecznej ilości oczyszczonych związków mimo 100 krotnie powtarzanego rozdziału, ze względu na konieczność jednorazowego nanoszenia bardzo małej ilości próbki. Na podkreślenie zasługuje determinacja mgr inż. Kamili Borowiec w osiągnięciu pożądanego efektu oczyszczania składników zawartych w ultrafiltracie z borówki poprzez dalsze doskonalenie metody chromatograficznej w skali preparatywnej i laboratoryjnej w drugim wariancie. Być może lepsze wyniki uzyskałaby Doktorantka gdyby zamiast ultrafiltratu użyła ekstraktu rozpuszczalnikami organicznymi np. alkoholem metylowym lub etylowym bezpośrednio z owoców, wówczas mogłaby dysponować większym stężeniem związków, która próbowała izolować z tego surowca. Wysoko oceniam badania dotyczące określenia struktury wyizolowanych inhibitorów cholinoesteraz z wykorzystaniem nowoczesnych metod widm FT-IR i widm 1 H i 13 C-NMR. Są to zagadnienia trudne wymagają doświadczenia i wiedzy w interpretacji tych widm. Kolejną nowoczesną technikę w identyfikacji związków, która wykorzystała Doktorantka była metoda LC-MS, gdzie poprawnie analizowała widma masowe badanych związków. Szkoda, że posiadała próbki w których występowały one w niskich stężeniach i trudno było ocenić jednoznacznie ich strukturę na podstawie analizy jonów pseudomolekularnych i 6

7 ścieżek fragmentacji. Mam wątpliwość czy dobrze została zinterpretowana struktura związku o masie 515 Da (strona 104), związki te pochodne kwasów kawowo-chinowych z fragmentacją m/z 353 powszechnie występują w owocach jagodowych jako 1,3 dikawowochinowy lub 3,4-dikawowochinowy. Dostępne są ich komercyjne standardy i można porównać ich czasy retencji i fragmentacje. Stwierdzenie (strona 110) o braku wybranych substancji wzorcowych we frakcji J1 na podstawie porównania czasów retencji z chromatografii cieczowej wzorców i składników frakcji J1 mogło wynikać, z faktu że wzorce były w postaci aglikonów a w borówce większość tych związków występuje w postaci glikozydów antocyjanów i flawonoli. Dużą wartość poznawczą mają doświadczenia na liniach komórkowych układu pokarmowego oraz doświadczenia żywieniowe na szczurach, które są oryginalnym osiągnięciem Doktorantki. Mogły one stanowić odrębną rozprawę doktorską, były bardzo pracochłonne i czasochłonne. Dużą wartość praktyczną i poznawczą mają doświadczenia nad oceną preparatów enzymatycznych pektynolitycznych stosowanych w produkcji soków z owoców jagodowych. Autorka poprawnie dobrała warunki, które są stosowane w praktyce przemysłowej z rozparzeniem i bez rozparzania owoców. Ad.6. Ocena prawidłowości wnioskowania Autorka sformułowała poprawnie 12 wniosków i stwierdzeń w których przedstawiła najważniejsze wyniki dobrze udokumentowanych własnych badań. Ad..7. Ocena końcowa Oceniając merytorycznie przedłożoną do recenzji pracę doktorską mgr inż. Kamili Borowiec stwierdzam, że Autorka wykazała się gruntowną znajomością tematyki badań, poprawnie zaplanowała i wykonała wyjątkowo trudne eksperymenty wykazując się umiejętnością posługiwania najnowocześniejszą dostępna aparaturą analityczną uzyskując dużą ilość wartościowych wyników. Szczególnie należy podkreślić bardzo duży zakres różnorodnych, czasochłonnych analiz oraz izolacją i identyfikacją związków borówki hamujących aktywność cholinoesteraz. Na podstawie swych badań Autorka przedstawiła obszerny materiał dotyczący oceny owoców borówki czernicy w profilaktyce powszechnych chorób cywilizacyjnych jakimi są choroba Alzheimera i cukrzyca. Wyniki tej pracy stanowią ważny wkład w poznanie składu związków odpowiedzialnych za hamowanie aktywności 7

8 cholinoestraz. Praca zawiera elementy nowości naukowej, zwłaszcza w zakresie badań nad składem i identyfikacją związków borówki czernicy hamujących aktywność cholinoesteraz. Bardzo duża ilość doświadczeń wniosła wiele nowych informacji z ważnego dla nauki i praktyki zakresu badań. Dużą wartość naukową mają wyniki badań żywieniowych na szczurach. Na szczególne podkreślenie zasługuje prowadzenie badań w innych ośrodkach naukowych, co pozwoliło uzyskać wartościowe wyniki i poznanie przez Doktorantkę nowoczesnych metod analitycznych. Niewielka ilość uwag krytycznych recenzenta ma charakter dyskusyjny. Oceniający głównie skupił się na błędach, które należałoby skorygować w przygotowywaniu pracy do druku. Dyskusyjne uchybienia w pracy nie umniejszają jej wartości merytorycznej. Uważam, że będąca przedmiotem oceny rozprawa mgr inż. Kamili Borowiec w pełni odpowiada wymogom art. 20, punkt 1 Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. 03,65,595) stawianym pracom doktorskim i wnoszę o dopuszczenie Jej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie proponuję wyróżnić rozprawę mgr inż. Kamili Borowiec za szczególnie duży wkład pracy w opracowanie literaturowe, determinację w udoskonaleniu i wykonaniu doświadczeń nad izolacją i identyfikacją inhibitorów cholinoesteraz borówki czernicy, oraz zakres badań znacznie przekraczający pracę doktorską.. 8