Ćwiczenie 3 ANALIZA JAKOŚCIOWA CUKRÓW Część doświadczalna obejmuje: wykonanie wybranych reakcji identyfikujących cukry analizę jakościową niektórych cukrów na podstawie sposobu krystalizacji ich osazonów WPROWADZENIE Cukrowce (cukry), nazywane też węglowodanami lub sacharydami, są, poza białkami, kwasami nukleinowymi i lipidami, jedną z najważniejszych klas cząsteczek biologicznych. W przyrodzie występują bardzo obficie ponad 50% węgla organicznego na Ziemi jest przechowywana w postaci skrobi i celulozy. Są to polisacharydy roślinne zbudowane z glukozy różniące się jedynie sposobem jej połączenia. Zawartość węglowodanów w tkankach roślinnych jest dużo wyższa (80% suchej masy) niż w tkankach zwierzęcych (poniżej 2% suchej masy), także formy ich występowania są bardziej różnorodne u roślin niż u zwierząt. Węglowodany pełnią wielorakie funkcje w organizmach żywych. Podstawowe znaczenie biologiczne tych składników polega na ich wykorzystaniu jako głównego źródła energii uwalnianej w procesach oksydacyjnych (glikoliza). Cukrowce mogą być też przetwarzane w inne metabolity wykorzystywane w różnych szlakach przemian, stanowią materiał zapasowy (skrobia u roślin, glikogen u zwierząt), a także służą jako materiał budulcowy pełniący funkcje strukturalne i nadający komórkom, narządom i całym organizmom odpowiednią stabilność mechaniczną. Na przykład, celuloza stanowi około 40-50% masy ścian komórkowych roślin, mureina występuje w ścianach komórkowych bakterii, a chityna wchodzi w skład ścian komórkowych grzybów oraz pancerzy owadów i skorupiaków. Ponadto, połączenia węglowodanów z białkami i lipidami pełnią kluczową rolę w procesach rozpoznania komórkowego pośrednicząc w oddziaływaniach między komórkami oraz w interakcjach między komórkami i składnikami środowiska komórkowego. Budowa i podział cukrowców Cukry są grupą związków karbonylowych (aldehydów lub ketonów) zawierających kilka grup hydroksylowych. Dzielimy je na cukry proste (jednocukry), nazywane monosachary- 1
dami i cukry złożone (wielocukry) nazywane polisacharydami. Monosacharydy są to związki drobnocząsteczkowe, niedające się rozłożyć na inne składniki cukrowe, natomiast polisacharydy są związkami wielkocząsteczkowymi, zbudowanymi z kilkuset do kilkudziesięciu tysięcy cząsteczek cukrów prostych. Wśród cukrów złożonych wyróżnia się oligosacharydy, które zbudowane są z kilku (2 6) cząsteczek cukrów prostych. Monosacharydy Większości monosacharydów odpowiada wzór sumaryczny C n H 2n O n. W zależności od liczby atomów węgla w cząsteczce dzieli się je na triozy, tetrozy, pentozy i heksozy. Monosacharydy zawierające więcej niż 6 atomów węgla, np. heptozy czy oktozy, występują w przyrodzie bardzo rzadko. Ze względu na obecność grupy aldehydowej bądź ketonowej, cukry proste mogą być aldozami lub ketozami. Końcówka -oza jest charakterystyczna dla cukrów. Najprostszymi monosacharydami są cukry zawierające trzy atomy węgla w cząsteczce, czyli triozy: aldehyd glicerynowy (aldoza) i dihydroksyaceton (ketoza). Aldozy zawierające co najmniej trzy atomy węgla, a ketozy zbudowane co najmniej z czterech atomów węgla, posiadają w swojej cząsteczce centra chiralne wynikające z obecności węgla asymetrycznego, tj. atomu węgla, którego 4 wartościowości są wysycone różnymi podstawnikami. Takie związki wykazują czynność optyczną, tzn. zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, którą można mierzyć w polarymetrze. Obecność węgla asymetrycznego powoduje asymetrię danej cząsteczki oraz istnienie dwóch wzorów przestrzennych tej cząsteczki, które są wzajemnymi odbiciami lustrzanymi. Są one nazywane izomerami optycznymi lub enancjomerami. Tak więc aldehyd D- i L-glicerynowy (Ryc. 1) to enancjomery lub para enancjomerów. Aldehyd Aldehyd Dihydroksyaceton L-glicerynowy D-glicerynowy Ryc. 1. Wzory rzutowe Fischera trioz 2
W przypadku monosacharydów zawierających więcej niż 1 asymetryczny atom węgla, symbole D i L odnoszą się do konfiguracji asymetrycznego atomu węgla najbardziej oddalonego od grupy aldehydowej lub ketonowej, jak pokazano to na przykładzie D- i L-fruktozy (Ryc.2). Jeśli konfiguracja jest taka jak w aldehydzie D-glicerynowym, cukier należy do szeregu konfiguracyjnego D, jeśli natomiast jest taka jak w aldehydzie L-glicerynowym do szeregu L. 1 2 3 4 5 6 D-fruktoza 1 2 3 4 5 6 L-fruktoza Ryc. 2. Wzory rzutowe Fischera enancjomerów (odbicia lustrzane) fruktozy Ilość możliwych, dla określonego monosacharydu, enancjomerów zależy od liczby atomów węgla asymetrycznego. Ogólnie, dla cząsteczki zawierającej n węgli asymetrycznych można utworzyć 2 n izomerów optycznych, z których połowę będą stanowić izomery D, a drugą połowę izomery L. Ze względu na to, że struktury stereochemiczne z tetraedrycznym centrum węglowym są kłopotliwe do rysowania, powszechnie przedstawia się je stosując wzory rzutowe Fischera (projekcja Fischera), które dają jasny i prosty stereochemiczny obraz przestrzenny przy każdym centrum asymetrycznym. We wzorach Fischera wiązania łączące atomy podstawników z centralnym atomem węgla są przedstawione jako linie poziome (umownie skierowane na zewnątrz płaszczyzny kartki) i pionowe (umownie skierowane w głąb kartki) (Ryc. 3). wzór rzutowy wzór Fischera stereochemiczny Ryc. 3. Sposoby zapisu struktury z tetraedrycznym centrum węglowym 3
Zależności stereochemiczne dla aldoz i ketoz zawierających 3 6 atomów węgla w cząsteczce i należących do szeregu D przedstawione są odpowiednio, na Ryc. 4 i Ryc. 5. Ryc. 4. Szereg konfiguracyjny D aldoz zawierających 3 6 atomów węgla (Berg i wsp. 2005) Ryc. 5. Szereg konfiguracyjny D ketoz zawierających 4 6 atomów węgla (Berg i wsp. 2005) 4
W roztworach wodnych otwarte formy łańcuchowe cukrów ulegają w stopniu niemal całkowitym cyklizacji i przyjmują strukturę pierścieniową, w której grupa karbonylowa jest zablokowana wskutek utworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania hemiacetalowego (półacetalowego) w aldozach lub hemiketalowego (półketalowego) w ketozach. W przypadku aldoheksozy, np. glukozy, grupa hydroksylowa przy C-5 atakuje atom tlenu przy C-1 grupy aldehydowej tworząc wewnątrzcząsteczkowy 6-członowy pierścień hemiacetalu. W rezultacie mogą powstać dwie formy anomeryczne, oznaczane jako α i β. Ze względu na podobieństwo pierścienia do piranu powstający cukier nazywany jest piranozą (Ryc. 6). W przypadku ketozy, np. fruktozy, w podobnej reakcji grupa hydroksylowa przy C-5 łączy się z grupą ketonową przy C-2 i powstaje wewnątrzcząsteczkowy 5-członowy pierścień hemiketalu podobny do furanu. Taki cukier nazywany jest furanozą i podobnie jak przy powstawaniu hemiacetalu mogą powstać jego dwie formy anomeryczne α i β (Ryc. 7). Ryc. 6. Powstawanie piranozy (wg Garrett i Grischam 1999) Do przedstawienia cukrów w formie pierścieniowej używa się najczęściej wzoru Hawortha (projekcja Hawortha), w którym widok pierścienia z góry jest przedstawiany perspektywicznie i na ogół nie pokazuje atomów węgla w pierścieniu. W zależności od konfiguracji podstawniki przy asymetrycznych atomach węgla znajdują się pod lub nad płaszczyzną pierścienia (Ryc. 6 i 7). Grupy OH, które w projekcji Fischera leżą po prawej stronie łańcu- 5
cha, w projekcji Hawortha znajdują się pod płaszczyzną pierścienia, natomiast te, które występują po lewej stronie, znajdują się nad nią. Ryc. 7. Powstawanie furanozy (wg Garrett i Grischam 1999) Podczas cyklizacji i tworzenia pierścienia powstaje dodatkowe centrum asymetrii, odpowiednio przy C-1 w hemiacetalu lub C-2 w hemiketalu (Ryc. 6 i 7). W związku z tym mogą powstawać dwie struktury pierścieniowe nazywane anomerami i oznaczane jako α (grupa OH przy C-1 lub C-2 występuje pod płaszczyzną pierścienia) i β (grupa OH przy C-1 lub C-2 znajduje się nad płaszczyzną pierścienia), np. glukoza występuje w postaci dwóch anomerycznych struktur pierścieniowych nazywanych α-d-glukopiranozą oraz β-d-glukopiranozą (Ryc. 6). Wzory Hawortha nie uwzględniają tego, że pierścienie piranozowe i furanozowe nie są płaskie ze względu na tetraedryczne ułożenie podstawników przy asymetrycznych atomach węgla. Pierścienie piranozowe przyjmują 2 rodzaje konformacji: krzesełkową i łódkową (Ryc. 8), natomiast konformacja pierścieni furanozowych nazywana jest formą kopertową. 6
Ryc. 8. (a) Krzesełkowa i łódkowa konformacja pierścienia piranozowego (b) Dwie możliwe konformacje krzesełkowe β-d-glukozy (Garrett i Grischam 1999) Cukry złożone Obecność wielu grup hydroksylowych w monosacharydach umożliwia łączenie się dwóch lub więcej cząsteczek za pomocą wiązań O-glikozydowych i tworzenie połączeń typu acetali lub ketali (Ryc. 9). Produkty przyłączania alkoholi do anomerycznego atomu węgla monosacharydów nazywa się ogólnie glikozydami. Ryc. 9. Ogólne reakcje powstawanie acetali i ketali (wg Garrett i Grischam 1999) Disacharydy Disacharydy (dwucukry) powstają w wyniku utworzenia wiązania glikozydowego pomiędzy anomeryczną grupą hydroksylową jednego monosacharydu z jedną z grup hydroksylo- 7
wych innego monosacharydu. Przykłady powszechnie występujących disacharydów i ich nazewnictwo przedstawione są na Ryc. 10. Maltoza O-α-D-glukopiranozylo- (1 4)-α-D-glukopiranoza Laktoza O-β-D-galaktopiranozylo- (1 4)-β-D-glukopiranoza Sacharoza O-α-D-glukopiranozylo- (1 2)-β-D-fruktofuranozyd Trehaloza O-α-D-glukopiranozylo- (1 1)-α-D-glukopiranozyd Celobioza O-β-D-glukopiranozylo- (1 4)-β-D-glukopiranoza Ryc. 10. Przykłady i nazewnictwo disacharydów 8
Polisacharydy Polisacharydy są polimerami monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Mogą być zbudowane z jednego rodzaju monosacharydów (homoglikany) lub z różnych cukrów prostych (heteroglikany) (Tabela 1). Polisacharydy występują w postaci liniowych łańcuchów lub są rozgałęzione. Do najważniejszych polisacharydów należą polimery D- glukopiranozy (glukozy) nazywane też glukanami (nie mylić z glikanami, które jest pojęciem szerszym). Są to 2 polisacharydy roślinne skrobia i celuloza oraz występujący w komórkach zwierząt glikogen. Skrobia jest szeroko rozpowszechnionym polisacharydem zapasowym stanowiącym magazyn glukozy wykorzystywanej jako podstawowe paliwo energetyczne. Jest mieszaniną dwóch glukanów: amylozy i amylopektyny, które występują w różnych stosunkach ilościowych w zależności od pochodzenia skrobi. Obydwie postacie zbudowane są z α- D-glukopiranozy. Amyloza, nazywana rozpuszczalną skrobią, składa się z prostych nierozgałęzionych łańcuchów połączonych wiązaniami α1 4 (tak jak w maltozie), zawierających 200-300 reszt glukozowych (Ryc. 11A). Łańcuchy te są zwinięte w helisę, w której na 1 skręt przypada 6-8 reszt glukozy (Ryc. 11B). Tabela 1. Ważne polisacharydy (Koolman i Röhm 2005) 9
A B C Cząsteczka jodu Ryc. 11. Budowa skrobi: (A) Fragmenty wzorów amylozy i amylopektyny; (B) Struktury amylozy i amylopektyny; (C) Kompleks skrobi z jodem cząsteczki jodu układają się równolegle do długiej osi helisy amylozy (pokazane są 3 obroty helisy) (Garrett i Grischam 1999, Koolman i Röhm 2005) Niebieskie zabarwienie roztworu skrobi w reakcji z jodem jest spowodowane występowaniem takich helis, ponieważ atomy jodu gromadzą się we wnętrzu helisy (Ryc. 11C) i w takim prawie bezwodnym otoczeniu barwią się na kolor ciemnoniebieski. Polisacharydy o strukturze 10
rozgałęzionej barwią się jedynie na brązowo lub czerwonobrązowo. Amylopektyna, w przeciwieństwie do amylozy praktycznie nierozpuszczalna, jest polisacharydem rozgałęzionym. Przeciętnie, co 24-30 reszt glukozowych, występuje rozgałęzienie utworzone przez wiązanie α1 6 (tak jak w izomaltozie), w wyniku czego powstaje rozległa struktura krzaczasta (Ryc. 12). Cząsteczki amylopektyny mogą mieć setki tysięcy reszt glukozowych. Ryc. 12. Porównanie stopnia rozgałęzienia w amylopektynie i glikogenie (Campbell 1999) Celuloza (błonnik), najbardziej rozpowszechniony węglowodan roślinny, jest liniowym homoglikanem zbudowanym z 1500 2500 reszt β-d-glukopiranozy połączonych wiązaniami β1 4, tak jak w celobiozie, którą można otrzymać przez częściową hydrolizę tego polisacharydu. Długie cząsteczki celulozy nadają tkankom roślinnym wytrzymałość mechaniczną i elastyczność. Glikogen, cukier zapasowy zwierząt, przypomina strukturą amylopektynę, lecz jego cząsteczka jest bardziej rozgałęziona, ponieważ rozgałęzienia występują przeciętnie co dziesięć reszt glukozy (Ryc. 12). Ważne reakcje Monosacharydy, tworząc różne formy, uczestniczą w wielu procesach metabolicznych. Na Ryc. 13, na przykładzie glukozy, przedstawione są niektóre ważne reakcje monosacharydów. 11
Ryc. 13. Przykłady reakcji monosacharydów (Koolman i Röhm 2005) REAKCJE BARWNE I REDUKCYJNE CUKRÓW Metody identyfikacji cukrów oparte są na ich właściwościach: Heksozy i pentozy pod wpływem stężonych kwasów ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów hydroksymetylofurfuralu lub furfuralu, które następnie ulegają kondensacji z fenolami lub aminami dając barwne pochodne: 12
W środowisku zasadowym łańcuchowe formy cukrów z wolną grupą aldehydową wykazują właściwości redukcyjne, przy czym same utleniają się do kwasów: glukoza kwas glukonowy Produktami utlenienia cukrów są: kwasy onowe, kwasy uronowe i kwasy cukrowe: Cukry z wolną grupą karbonylową reagują również z fenylohydrazyną tworząc osazony wykazujące charakterystyczną dla danego cukru postać krystaliczną oraz temperaturę topnienia Polisacharydy wykazują zdolność adsorbowania cząsteczek jodu (J 2 ), w wyniku czego powstają barwne kompleksy o różnym zabarwieniu (granatowe, brunatne, czerwonofioletowe) (Ryc. 11C). WYKONANIE Odczynniki: 1. 2% roztwory wzorcowe cukrów 2. Odczynnik Molischa 1% etanolowy roztwór α-naftolu 3. Stężony H 2 SO 4 4. Stężony HCl 5. HCl : H 2 O (1 : 1) 13
6. Odczynnik Seliwanowa 2% etanolowy roztwór rezorcyny 7. Odczynnik Tollensa 2% etanolowy roztwór floroglucyny 8. Odczynnik Biala 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl 9. 1% roztwór FeCl 3 10. 1M roztwór NaOH 11. 0,25M roztwór CuSO 4 12. Odczynnik Fehlinga: I rozpuścić w wodzie destylowanej 34,65 g krystalicznego CuSO 4 5H 2 O i uzupełnić w cylindrze miarowym do 500 ml II rozpuścić w wodzie 173 g winianu sodu i potasu i 15 g NaOH, uzupełnić do 500 ml 13. Odczynnik Benedicta w 700 ml wrzącej wody rozpuścić 173 g cytrynianu sodu i 100 g bezwodnego Na 2 CO 3. Po ochłodzeniu dodać powoli 100 ml 17,3% CuSO 4 5H 2 O, stale mieszając. Uzupełnić wodą do 1 000 ml 14. Odczynnik Barfoeda rozpuścić na gorąco 24 g Cu(CH 3 COO) 2 w 450 ml wody i dodać 25 ml 8,5% kwasu mlekowego. Wstrząsnąć aż do rozpuszczenia osadu. Oziębić, uzupełnić wodą do 500 ml i przesączyć. 15. Roztwór J 2 w KJ Reakcje charakterystyczne Próba Molischa z α-naftolem Jest to najbardziej ogólna reakcja na cukrowce, tak wolne jak i związane. Ujemny jej wynik wyklucza obecność cukrowca, dodatni zaś nie wystarcza do stwierdzenia jego obecności, gdyż dodatnią reakcję dają także aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, cytrynowy. Nie można również stosować tej próby do wykrycia cukrowców w moczu, ponieważ dodatni odczyn dają obecne tam związki niecukrowe. Zasada próby polega na powstaniu czerwono-fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z α-naftolem. 14
Do około 0,5 ml 2% roztworu badanego cukru dodać 2 krople etanolowego roztworu α- naftolu. Po dokładnym zmieszaniu, po ściance ukośnie ustawionej probówki wprowadzić bardzo ostrożnie 0,5 ml stężonego H 2 SO 4 tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Wyniki podać w tabeli. Próba Seliwanowa z rezorcyną na ketozy W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający pod działaniem kwasu solnego dużo łatwiej z ketoz niż z aldoz. Próba ta pozwala więc na odróżnienie ketoz od aldoz, ponieważ w obecności 3-krotnie rozcieńczonego roztworu HCl tylko ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w 100 o C przez 30 sekund. Do około 0,5 ml 2% roztworu fruktozy dodać 1 ml roztworu HCl (rozcieńczonego wodą 1 : 1) i kroplę roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Po około 30 sekundach powstaje czerwono-łososiowe zabarwienie. Po dłuższym ogrzaniu barwa może wystąpić i przy innych cukrach. Próbę powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów. Próba Tollensa z floroglucyną na pentozy Wskutek działania kwasu chlorowodorowego na pentozy powstaje furfural, który tworzy z floroglucyną związek o barwie wiśniowej. 15
Do około 0,5 ml 2% roztworu pentozy dodać 1 ml stężonego roztworu HCl i 2 krople roztworu floroglucyny. Ogrzać. Powstaje barwa wiśniowa. Reakcję powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów. Próba Biala na pentozy Do 2 ml roztworu orcyny w HCl dodać kroplę 1% FeCl 3 i 0,5 ml roztworu pentozy. Próbę wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Powstaje zielone zabarwienie. Reakcję powtórzyć z roztworami pozostałych cukrów. W obecności jonów żelaza (III), powstający furfural daje z orcyną kompleks o zielonej barwie. Próba Fehlinga Zmieszać w probówce 3 ml roztworu Fehlinga I z 3 ml roztworu Fehlinga II. Próbę ogrzać do wrzenia w celu sprawdzenia czy nie wystąpi redukcja własna odczynnika. Do 1 ml sprawdzonego roztworu Fehlinga dodać kilka kropel badanego roztworu cukru, a następnie ogrzać w łaźni wodnej. Opisać wynik. Próba Benedicta Do 1 ml odczynnika Benedicta dodać 2 krople 2% roztworu cukru i wstawić na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej. Powstające pomarańczowe zabarwienie roztworu wynika z redukcji Cu 2+ do Cu +. Próba Benedicta należy do najbardziej specyficznych i czułych prób redukcyjnych na cukrowce. Odczynnik różni się od odczynnika Fehlinga tym, że zamiast wodorotlenku sodu zawiera węglan sodu i zamiast winianu, cytrynian sodu. Powstaje więc nie wodorotlenek miedzi (II) a węglan. Jest to próba bardziej swoista od próby Fehlinga, gdyż związki redukujące odczynnik Fehlinga, jak: chloroform, kreatynina i kwas moczowy, nie redukują odczynnika Benedicta. Czułość próby jest dość duża. Już 0,1% stężenie cukrowca powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. Zielone zabarwienie jest wynikiem nakładania się pomarańczowej barwy zawiesiny Cu 2 O z niebieskim zabarwieniem odczynnika. 16
Próba Barfoeda w modyfikacji Tauber-Kleinera odróżnienie jednocukrów od dwucukrów redukujących Do 1 ml 2% roztworów badanych cukrów dodać po 1 ml odczynnika Barfoeda. Próbę wymieszać, a następnie wstawić dokładnie na 3 min do wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wynik reakcji. Próby następnie pozostawić we wrzącej łaźni wodnej na dalsze 15 minut, po czym zanotować wynik reakcji. Próba ta pozwala na odróżnienie mono- od dwucukrów redukujących. Jednocukrowce wykazują właściwości redukujące w środowisku lekko kwaśnym po krótkim ogrzewaniu (3 min), natomiast dwucukrowce redukujące dopiero po 15 minutach ogrzewania we wrzącej łaźni wodnej. Reakcja z jodem Reakcja ta pozwala na odróżnienie polisacharydów od innych cukrowców, ponieważ kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki o uporządkowanej strukturze i odpowiednio duże. Efekt barwny jest związany z wielkością cząsteczki im większa cząsteczka polisacharydu tym więcej cząsteczek jodu jest związanych w kompleksie. Amyloza barwi się intensywnie na kolor ciemnoniebieski. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia się na fioletowoczerwoną (amylopektyna) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks o barwie czerwonej. Do 1 ml zawiesiny skrobi dodać 1 kroplę roztworu J 2 w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie. Reakcje powtórzyć z pozostałymi cukrowcami. UWAGA! Wyniki uzyskane w powyższych reakcjach zestawić w tabeli zaznaczając dodatni wynik jako +, a ujemny jako 17
Cukier Reakcja Molischa Seliwanowa Tollensa Biala Fehlinga Trommera Benedicta Barfoeda J 2 w KJ Tworzenie osazonów Cukry tworzą z fenylohydrazyną żółte, trudno rozpuszczalne w wodzie dwuhydrazony (osazony). Osazony różnią się formami kryształów i temperaturą topnienia, co pozwala na identyfikację różnych cukrów (Ryc. 14). Związki te mogą powstawać tylko w reakcji z cukrami redukującymi, gdyż fenylohydrazyna kondensuje z wolną grupą aldehydowa lub ketonową. Ponieważ cukry w roztworach występują przeważnie w postaci pierścieniowej, w której grupa karbonylowa jest zablokowana, konieczne jest rozerwanie mostka tlenowego. Proces ten zachodzi w środowisku zasadowym; również niektóre organiczne zasady m.in. fenylohydrazyna mogą powodować otwarcie pierścienia w mono- i dwucukrach. W pierwszym etapie reakcji aldozy z fenylohydrazyną tworzy się fenylohydrazon, w wyniku dalszej reakcji z dwiema cząsteczkami fenylohydrazyny powstaje osazon. Jak wynika z poniższych reakcji, w tworzeniu osazonu uczestniczą tylko dwa pierwsze atomy węgla (C-1 i C- 2). Cukry różniące się tylko ugrupowaniami przy C-1 i C-2, np. glukoza, fruktoza i mannoza dają w związku z tym identyczne osazony. 18
Reakcja tworzenia osazonów Ryc. 14. Kryształy osazonów (Vogel 2006) 19
WYKONANIE Odczynniki: 1. Chlorowodorek fenylohydrazyny (UWAGA! Silna trucizna!) 2. Octan sodu in subst. 3. Wzorcowe roztwory cukrów 0,2 % roztwory glukozy, ksylozy i galaktozy oraz 2% roztwory maltozy i laktozy Postępowanie: Do probówek napipetować po 1,5 ml roztworu badanych cukrów, dodać po około 100 mg chlorowodorku fenylohydrazyny i około 150 mg octanu sodu. Próby wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 45 min. Po tym czasie, próby wyjąć i umieścić w zlewce z zimną wodą pozostawiając do powolnej krystalizacji (około godziny). Osad kryształów przenieść na szkiełko podstawowe i obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać rysunki kryształów badanych osazonów UWAGA! W reakcji powszechnie stosuje się chlorowodorek fenylohydrazyny, trwalszy od wolnej zasady. Ponieważ w reakcji z chlorowodorkiem będzie powstawał dodatkowo przeszkadzający w tworzeniu osazonów HCl, dla jego zobojętnienia do mieszaniny dodaje się octanu sodu in subst. Zagadnienia do przygotowania: szeregi konfiguracyjne D aldoz i D ketoz wzory rzutowe Fischera i wzory Hawortha terminy: enancjomer, anomer, mutarotacja, epimer, budowa disacharydów (maltoza, laktoza, sacharoza, trehaloza, celobioza) polisacharydy (budowa skrobi, glikogenu i celulozy) powstawanie furfuralu i hydroksymetylofurfuralu reakcje barwne pozwalające wykrywać różne cukry produkty utleniania cukrów reakcja powstawania osazonow; identyfikacja cukrów 20
Literatura: 1. Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer, PWN, Warszawa 2005 2. Biochemia. Ilustrowany przewodnik J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005 3. Biochemistry MK Campbell, Saunders College Publishing. Harcourt Brace College Publishers, Philadelphia, 1999 4. Biochemistry RH Garrett, ChM Grischam, University of Virginia 1999 5. Preparatyka organiczna AI Vogel, WNT 2006 21