Chemia Lipidów i Białek

Instrukcje do ćwiczeń Chemia Lipidów i Białek Laboratorium Specjalizacja CHEMIA ŻYWNOŚCI I rok CHEMII II stopnia Opracowanie dr hab. Agnieszka Wojtkielewicz, dr Agnieszka Hryniewicka Białystok 2015

2 Wymagania AMINOKWASY i BIAŁKA (ćw.1 i 2) 1. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne (w tym reakcje charakterystyczne) aminokwasów. 2. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne białek. 3. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych. LIPIDY I (ćw. 3 i 4) 1. Budowa oraz właściwości fizyczne i chemiczne kwasów tłuszczowych i triacylogliceroli: a) reakcja hydrolizy b) reakcja autooksydacji c) reakcja uwodornienia d) addycja halogenów 2. Proces jełczenia. Liczba kwasowa i nadtlenkowa wyznaczanie i zastosowanie 3. Metody izolacji tłuszczów. LIPIDY II (ćw. 5, 6, 7) 1. Definicja, budowa, podział lipidów ze szczególnym uwzględnieniem steroidów 2. Liczba jodowa wyznaczanie i zastosowanie. 3. Zmydlanie tłuszczów. Mydła i detergenty budowa i działanie. 4. Budowa i rola biologiczna cholesterolu

3 Ćwiczenie 1 Analiza aminokwasów probówki szklane łaźnia wodna palnik gazowy - próbka nabiału ok. 10 g (twaróg, jogurt lub mleko) należy przynieść na zajęcia 1% wodne roztwory aminokwasów: glicyny i proliny 1% wodne roztwory albuminy 1% roztwory aminokwasów: tyrozyny i tryptofanu w 0,1 M HCl 0,1% świeże roztwory aminokwasów: cysteiny i cystyny w 0,1 M HCl 0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu stężony HNO 3 stężony H 2 SO 4 2M roztwór CH 3 COOH 10% roztwór NaOH 20% roztwór NaOH stężony NH 3 aq. 1% wodny roztwór nitroprusydku sodu Na 2 [Fe(CN) 5 NO] siarczan amonu 10% roztwór NaNO 2 40% roztwór formaldehydu (formalina) 0,25M roztwór CuSO 4 mocznik Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie poniższych reakcji charakterystycznych z konkretnymi aminokwasami jak również z przyniesioną próbką nabiału. 1. Reakcja ninhydrynowa Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do aldehydów z jednoczesną dekarboksylacją, a potem deaminacją. Powstały amoniak daje z ninhydryną barwny związek fioletowo-niebieski produkt zwany purpurą Ruhemanna. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę α-aminową, np. sole amonowe, aminocukry, amoniak, aminy I-rzędowe, peptydy i białka po hydrolizie. Aminokwasy takie jak prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy α-aminowej, dają w reakcji z ninhydryną produkt o barwie żółtej. Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów aminokwasów: glicyny i proliny, a następnie dodać po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny. Probówki ogrzać do wrzenia we wrzącej łaźni wodnej obserwując pojawienie się charakterystycznego zabarwienia.

4 2. Reakcja ksantoproteinowa Aminokwasy aromatyczne (tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan) ulegają reakcji nitrowania. Reakcja ta zachodzi dla aminokwasów wolnych jak i związanych w białku. Czynnikiem nitrującym jest jon nitroniowy NO + 2. Mieszanina nitrująca, nitruje wszystkie aminokwasy, natomiast stężony kwas azotowy ma zdolność nitrowania związków zawierających aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz fenyloalaniny. Produkty reakcji nitrowania mają barwę żółtą. Alkalizacja roztworu prowadzi do otrzymywania soli sodowych charakteryzujących się barwą pogłębioną, aż do żółto-pomarańczowej. Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka albuminy, a następnie dodać pod dygestorium po 1 ml stężonego kwasu azotowego(v). Probówki ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut, oziębić pod bieżącą wodą i dodać po 4 ml 20% roztworu NaOH (reakcja silnie egzotermiczna). Zaobserwować, w których probówkach roztwór zabarwi się na kolor żółto-pomarańczowy. 3. Wykrywanie grup tiolowych Grupy tiolowe obecne w aminokwasach wolnych i związanych w białkach reagują z nitroprusydkiem sodu w środowisku amoniakalnym. Otrzymany związek kompleksowy ma czerwono-fiołkową barwę. Do 3 probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: cysteiny, cystyny i albuminy, dodać po 1 ml 1% roztworu nitroprusydku sodu, a następnie siarczanu amonu do nasycenia roztworu. Zalkalizować próby, dodając ok. 1-2 ml amoniaku (pod dygestorium) pojawienie się czerwono-fiołkowego zabarwienia prób oznacza dodatni wynik na obecność grup tiolowych. 4. Deaminacja aminokwasów kwasem azotowym(iii) Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego(iii), tworzącego się in statu nascendi, ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. W probówce zmieszać 1 ml NaNO 2 z 1 ml roztworu CH 3 COOH, ogrzewać 1 minutę w łaźni wodnej. Odczekać, aż zmniejszy się wydzielanie gazu o żółtej barwie (tlenki azotu) i dodać do probówki 2 ml roztworu glicyny. Trzymając probówkę w drewnianej łapie wytrząsać i obserwować wydzielanie się azotu produktu gazowej reakcji deaminacji.

5 5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem glioksalowym lub aldehydem mrówkowym dając barwne produkty kondensacji. Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy, następnie dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać. Do każdej probówki dodać powoli po ściance lekko pochylonej probówki 1 ml stężonego H 2 SO 4 (nie wstrząsać!) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Pojawienie się ciemnoczerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz oznacza dodatni wynik na obecność tryptofanu. 6. Reakcja biuretowa Biuret (dimocznik, H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ) tworzy w środowisku zasadowym fioletowy kompleks z solami miedzi(ii). Reakcja ta jest charakterystyczna dla związków zawierających więcej niż jedno wiązanie peptydowe w cząsteczce (peptydy i białka). Do suchej probówki nr 1 wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym. Mocznik topi się, a następnie rozkłada. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści, do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny. Do roztworów: biuretu (probówka nr 1), albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH, wymieszać starannie, wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi(ii), w wyniku czego powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu. W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich obserwacji i schematu reakcji.

6 Ćwiczenie 2 Oznaczanie i właściwości fizykochemiczne białek. Enzymy. 1. Oznaczanie kazeiny w metodą formylkową Wolkera kolba stożkowa 100 ml pipety biureta 50 ml mleko (śmietanka lub jogurt) 10 ml formaldehyd, roztwór 20% (v/v) 0,1 M roztwór NaOH fenoloftaleina, roztwór alkoholowy 2% W I etapie oznaczenia zobojętnia się próbkę roztworem wodorotlenku sodu wobec fenoloftaleiny (do ph > 8,3). Zobojętnieniu ulegają wówczas wolne grupy -aminowe aminokwasów w łańcuchu białkowym. W II etapie oznaczenia dodaje się formaldehyd, który blokując grupy -aminowe lizyny (przemiana grup NH 2 do N=CH 2 ) powoduje uwalnianie z nich jonów H +. Uwolnione jony H + odmiareczkowuje się roztworem wodorotlenku sodu. Do kolby stożkowej odmierzyć pipetą 10 ml mleka (śmietanki lub jogurtu), dodać 0,5 ml fenoloftaleiny (12 kropli) i miareczkować 0,1 M roztworem NaOH do uzyskania lekko różowego zabarwienia. Następnie dodać 2 ml formaldehydu i miareczkować ponownie 0,1 M roztworem NaOH do momentu uzyskania lekko różowego zabarwienia próbki, utrzymującego się przez 30 sekund. Procentową zawartość kazeiny w mleku (X) obliczyć wg wzoru: gdzie: 1.57 współczynnik przeliczeniowy dla kazeiny, V NaOH objętość NaOH zużytego do miareczkowania po dodaniu formaldehydu [ml]. 2. Denaturacja białek probówki roztwór albuminy 1% roztwór FeCl 3 2% roztwór Pb(CH 3 COO) 2 2% roztwór CuSO 4 1% roztwór kwasu octowego NaCl etanol 96%

7 a) Strącanie białek za pomocą kationów (soli metali ciężkich) Do 3 probówek zawierających po 2 ml roztworu albuminy o ph zasadowym dodać po 15 kropli: - 1% roztworu FeCl 3 (do pierwszej probówki), - 2% roztworu Pb(CH 3 COO) 2 (do drugiej probówki), - 2% roztworu CuSO 4 (do trzeciej probówki). Obserwować strącający się osad. b) Denaturacja cieplna Do 1 ml roztwory albuminy dodać 1 kroplę 1% roztworu kwasu octowego i ogrzewać do wrzenia. Tworzy się biały kłaczkowaty osad, który staje się wyraźny po dodaniu niewielkiej ilości (około 6 kropli) roztworu NaCl. c) Działanie alkoholu Do dwóch probówek nalać po 1 ml roztworu albuminy i dodać po 2 ml 96% etanolu. Sprawdzić rozpuszczalność osadu otrzymanego w pierwszej probówce w wodzie, przez dodanie ok. 5 ml wody i wstrząśnięcie probówki. Po około 40 min. sprawdzić rozpuszczalność osadu tylko w drugiej probówce. 3. Enzymy probówki pipetki plastikowe tarka, nóż zlewka 3% nadtlenku wodoru H 2 O 2 (czyli wody utlenionej) 0,3% nadtlenku wodoru H 2 O 2 0,5% pirogalol sok z ziemniaka sok z korzenia imbiru lub chrzanu a) Wykrywanie obecności katalazy w ziemniaku Przygotować dwie probówki. Do pierwszej nalać 1 ml 3% roztworu H 2 O 2, a następnie dodać kilka kropli wyciśniętego soku z ziemniaka. Katalaza ziemniaka powoduje szybki rozkład

8 H 2 O 2 do H 2 O i O 2, co uwidacznia się gwałtownym wydzielaniem pęcherzyków tlenu. Do drugiej probówki nalać 2 ml surowego soku z ziemniaka i gotować go na wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Po schłodzeniu probówki dodać kilka kropli H 2 O 2. Brak pęcherzyków tlenu świadczy o inaktywacji katalazy. b) Aktywność peroksydazy Przygotować 3 probówki. Do pierwszej nalać 1 ml soku z korzenia imbiru (lub chrzanu), do drugiej probówki 1 ml soku z imbiru, który należy 3-5 minut gotować w łaźni wodnej. Natomiast do trzeciej probówki wlewamy 1 ml wody destylowanej. Następnie do każdej probówki dodać 1 ml 0,3% H 2 O 2 i 1 ml 0,5% pirogalolu. Zaobserwować zmiany zachodzące w kolejnych probówkach. W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem swoich obserwacji i wniosków.

9 Ćwiczenie 3 Ocena jakościowa tłuszczów. Wpływ ogrzewania na właściwości tłuszczów. zlewka 100 ml x 2 kolba stożkowa 250 ml x 2 cylinder 100 ml biureta 50 ml x 2 smalec olej słonecznikowy 0.1 M roztwór wodny KOH etanol + eter dietylowy 1:1 (v/v) fenoloftaleina 1% roztwór alkoholowy chloroform kwas octowy lodowaty jodek potasu, świeży roztwór nasycony, wolny od jodanów i wolnego jodu 0,001 M roztwór tiosiarczanu sodu roztwór skrobi 1% Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową smalcu oraz oleju słonecznikowego. Następnie ogrzewać ok. 100 g tłuszczu: a) Tradycyjnie, w zlewce na płaszczu grzejnym, doprowadzając tłuszcz do temperatury 180 C. Kontynuować ogrzewanie przez 15 minut kontrolując termometrem temperaturę tłuszczu. b) Stosując ogrzewanie mikrofalowe przez 15 minut (moc 600-700 W). Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową tłuszczy po ogrzewaniu. Oznaczanie liczby kwasowej (wg normy PN-ISO 660) Liczba kwasowa wyraża ilość miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych (KT) zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa jest miarą zawartości wolnych KT, czyli określa stopień hydrolizy tłuszczu. Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć 10 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 50 ml mieszaniny alkoholu i eteru. Klarowny roztwór miareczkować roztworem KOH wobec fenoloftaleiny do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez ok. 1 minutę. Liczbę kwasową obliczyć wg wzoru: gdzie: C KOH stężenie roztworu wodorotlenku potasu [mmol/ml] V KOH objętość roztworu wodorotlenku potasu zużytego do miareczkowania [ml]

0 M KOH masa molowa wodorotlenku potasu (56,1 mg/mmol) m masa tłuszczu [g] Oznaczanie liczby nadtlenkowej (wg normy PN-ISO 3960) Liczba nadtlenkowa LOO oznaczana dla tłuszczu informuje o zawartości w próbce pierwotnych produktów utlenienia lipidów, tj. wodoronadtlenków. Liczba nadtlenkowa jest to ilość cm 3 mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 kg tłuszczu. Ilość nadtlenków w próbce, która utlenia jodek potasu w warunkach oznaczenia, wyraża się jako miliekwiwalenty aktywnego tlenu zawarte w kilogramie tłuszczu [meq O/kg tłuszczu] dokładnie w chwili pomiaru. Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć 2 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 10 ml chloroformu, rozpuścić przez mieszanie. Dodać 15 ml CH 3 COOH lodowatego oraz 1 ml nasyconego KI. Kolbę natychmiast zamknąć korkiem, mieszać 1 minutę, a następnie odstawić w ciemne miejsce na 5 minut. Dodać 75 ml wody i 5 kropli roztworu skrobi. Zawartość kolby natychmiast miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu do uzyskania odbarwienia trwającego co najmniej pół minuty. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu). Liczbę nadtlenkową, wyrażoną w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu, obliczyć wg wzoru: gdzie: 1000 - współczynnik przeliczeniowy liczby cm 3 zużytego Na 2 S 2 O 3 na milirównoważniki tlenu w 1 kg tłuszczu V Na2S2O3 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm 3 ] V 0 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm 3 ] C Na2S2O3 - stężenie molowe tiosiarczanu sodu [mol/dm 3 ] m - masa tłuszczu [g] W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać prawdopodobne produkty powstające podczas jełczenia oksydatywnego.

1 Ćwiczenie 4 Hydroliza oleju roślinnego mieszadło magnetyczne element mieszający łaźnia olejowa kolba okrągłodenna 250 ml kolba okrągłodenna 100 ml rozdzielacz 250 ml cylinder miarowy 100 ml lejek Buchnera kolba ssawkowa erlenmajerka 100 ml olej rzepakowy 15 g gliceryna 30 ml KOH eter dietylowy 90 ml stężony HCl 15 ml NaCl Na 2 SO 4 mocznik metanol eter naftowy Hydroliza oleju roślinnego W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml umieścić 15 g oleju roślinnego, 3.45 g wodorotlenku potasu i 30 ml gliceryny. Kolbę ogrzewać przez 5 minut w łaźni olejowej w temperaturze 160 C zapewniając mieszanie. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej (mieszanina zaczyna krzepnąć) dodać 90 ml rozcieńczonego HCl (75 ml wody i 15 ml stężonego HCl), doprowadzając do ph = 1. Wytrącony osad wraz z roztworem przenieść do rozdzielacza, kolbę przemyć eterem dietylowym. Mieszaninę ekstrahować eterem dietylowym (3 x 30 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu. Po odsączeniu odparować rozpuszczalnik. Zważyć surowy kwas oleinowy zanieczyszczony kwasami wielonienasyconymi (linolowym, linolenowym). Wyodrębnienie kwasu oleinowego Otrzymany produkt przenieść do kolby 100 ml, dodać 16.5 g mocznika i 75 ml metanolu. Mieszaninę ogrzać do rozpuszczenia osadu, przesączyć, roztwór pozostawić do krystalizacji. Otrzymane kryształy (kompleks kwasu oleinowego z mocznikiem) odsączyć, a następnie rozpuścić w 35 ml wody i ekstrahować eterem naftowym (3 x 20 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu, odsączyć, odparować. Zważyć produkt (gęstniejący olej o t.t. 16 C i obliczyć wydajność procesu). W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.

2 Ćwiczenie 5 Izolacja kwasów tłuszczowych z migdałów/ wiórków kokosowych zestaw do destylacji z parą wodną kolba okrągłodenna 250 ml x 2 chłodnica zwrotna lejek rozdzielacz 250 ml 15 g migdałów lub wiórków kokosowych chloroform eter dietylowy eter naftowy octan etylu metanol etanol Na 2 SO 4 Pozyskanie olejku migdałowego lub kokosowego można dokonać macerując materiał roślinny eterem naftowym (metoda A) lub destylując go z parą wodną (metoda B). Metoda A Rozdrobnione migdały (w płatkach, 15 g) lub wiórki kokosowe oraz 100 ml eteru naftowego umieścić w kolbie 250 ml zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w temperaturze wrzenia przez godzinę. Następnie ochłodzić mieszaninę, przesączyć. Kolbę przepłukać octanem etylu w celu wymycia wszystkich tłuszczowych pozostałości i dołączyć do przesączu. Całość odparować, zważyć. Metoda B Zmontować zestaw do destylacji z parą wodną. W kolbie umieścić 15 g migdałów w płatkach lub wiórków kokosowych. Destylację (pod wyciagiem) kontynuować do uzyskania 150 ml destylatu o mleczobiałej barwie. Destylat ekstrahować chloroformem (4 x 50 ml). Warstwę organiczną osuszyć nad Na 2 SO 4, odparować i zważyć.

3 Rys. 1. Zestaw do destylacji I Rys. 2. Zestaw do destylacji II W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.

4 Ćwiczenie 6 Zmydlanie i oznaczenie liczby jodowej oleju kokosowego i migdałowego kolba okrągłodenna 250 ml chłodnica biureta 50 ml kolba stożkowa 250 ml zlewka 250 ml cylinder 100 ml olejek kokosowy lub migdałowy etanol NaOH 0.1 M Na 2 S 2 O 3 jod skrobia Otrzymywanie mydła Rozpuścić olejek kokosowy lub migdałowy w 30 ml alkoholu etylowego w kolbie 250 ml i dodać 45 ml roztworu zawierającego odpowiednią ilość wodorotlenku sodu (na 1 g olejku - 0.25 g NaOH) w mieszaninie etanol : woda (9:1 v/v). Otrzymaną mieszaninę należy ogrzewać w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Po ochłodzeniu otrzymane mydło przenosi się łopatką do zlewki zawierającej 110 ml wody z pokruszonym lodem. Następnie należy przesączyć, osuszyć i zważyć. Oznaczenie liczby jodowej metodą Morgoschesa Liczba jodowa stanowi ilość gramów jodu, którą mogą przyłączyć nienasycone kwasy tłuszczowe zawarte w 100 g tłuszczu. Jej wartość jest miarą zawartości w tłuszczu nienasyconych kwasów tłuszczowych. Im wyższa wartość liczby jodowej, tym większa zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Nadmiar nieprzereagowanego jodu usuwa się poprzez odmiareczkowanie roztworu kwasów tłuszczowych roztworem tiosiarczanu sodu. Próbkę badanego tłuszczu 0,2 g (olejek migdałowy) lub 1 g (olejek kokosowy) umieścić w kolbie stożkowej na 250 ml, dodać 15 ml alkoholu metylowego, a następnie 10 ml 0,2 M alkoholowego roztworu jodu. Roztwór dokładnie wymieszać i natychmiast dodać 100 ml wody destylowanej i odstawić pod przykryciem nie dłużej niż na 5 minut. Po tym czasie nieprzereagowany jod odmiareczkować 0,1 M Na 2 S 2 O 3 wobec 2 ml skrobi, którą należy dodać pod koniec miareczkowania (gdy roztwór uzyska jasnożółta barwę). Zakończyć

5 miareczkowanie gdy roztwór uzyska mleczną barwę. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu w metanolu). Liczbę jodową obliczyć wg wzoru: gdzie: 1,269 wartość gramorównoważnika jodu (126,92 g) w odniesieniu do 100 g tłuszczu V 0 liczba ml Na 2 S 2 O 3 zużyta w próbie kontrolnej V 1 liczba ml Na 2 S 2 O 3 zużyta w oznaczeniu właściwym m masa tłuszczu [g] W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać schemat reakcji otrzymywania mydła z kwasu laurynowego i oleinowego oraz addycji jodu do kwasu oleinowego.

6 Ćwiczenie 7 Izolacja i wykrywanie cholesterolu z żółtka jaja kurzego zlewka 100 ml 2x bagietka kolba okrągłodenna 250 ml lejek płytki chromatograficzne komory chromatograficzne probówki jajo kurze etanol-eter dietylowy (2:1, v/v) eter dietylowy aceton chloroform cholesterol - wzorzec kwas siarkowy stężony bezwodnik octowy roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym Izolacja cholesterolu Dokładnie oddzielić żółtko od białka i zalać je w zlewce 75 ml mieszaniny etanol-eter dietylowy (2:1, v/v). Rozmieszać żółtko szklaną bagietką i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na ok. 10 min., od czasu do czasu mieszając. Mieszaninę odsaczyć na sączku karbowanym do suchej kolby kulistej, a przesącz odparować na wyparce (temp. łaźni poniżej 50 C). Żółtą pozostałość rozpuścić w 10 ml eteru dietylowego. Otrzymany roztwór wkroplić powoli, mieszając, do zlewki zawierającej 30 ml acetonu. Wytrącony osad surowych lecytyn odsaczyć na sączku karbowanym. Przesącz odparować, a pozostałość rozpuścić w chloroformie i zachować do TLC i reakcji probówkowych. Na płytkę chromatograficzną nanieść próbki osadu, przesączu i wzorzec cholesterolu. Rozwinąć w układzie oraz heksan-octan etylu (7:3). Wywołać: w parach jodu oraz kwasie siarkowym.

7 Wykrywanie cholesterolu Reakcje probówkowe na obecność cholesterolu w przesączu. Powtórzyć z wzorcem cholesterolu rozpuszczonym w chloroformie. Próba Salkowskiego: Do 2 ml roztworu cholesterolu dodać powoli po ściance probówki 1 ml stężonego kwasu siarkowego. Kwas fluoryzuje na zielono, a warstwa organiczna barwi się na czerwono. Próba Liebermana-Burcharda: Do 1 ml roztworu cholesterolu dodać 10 kropli bezwodnika octowego i kroplę kwasu siarkowego. Pojawia się czerwone zabarwienie, przechodzące przez niebieskie w zielone. Próba Windausa: Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu dodać kroplami roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym. Obserwować zanikanie barwy bromu. W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich obserwacji i schematu reakcji.