IDENTYFIKAJA UKÓW PSTY I ZŁŻNY EAKJAMI KLYMETYZNYMI YDLIZA SAAZY Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z charakterystycznymi barwnymi reakcjami węglowodanów oraz ich identyfikacje w otrzymanych zestawach jednoi dwuskładnikowych zgodnie z dołączonym schematem. Dodatkowym celem jest przeprowadzenie enzymatycznej reakcji hydrolizy sacharozy. Materiał badany: Mieszaniny węglowodanów, 1- i 2-składnikowe Szkło i sprzet laboratoryjny: Zestaw probówek Pipety automatyczne Pipety Pasteura Statyw na probówki Łaźnia wodna 1. Analiza jakościowa mieszanin węglowodanów Próba Molisha Zasada metody W obecności stężonych kwasów t.j. siarkowy(vi) lub solny w temperaturze pokojowej cukry ulegają odwodnieniu tworząc furfurylowe pochodne. dwodnienie pentoz prowadzi do przekształcenia ich w furfural (1), natomiast heksoz w 5-hydroksymetylenofurfural (2). 3 2 (1) pentoza furfural 2 heksoza 3 2 1 2 5 - hydroksymetylenofurfural (2)
dwodnieniu najłatwiej ulegają pentozy, wśród heksoz natomiast ketozy. Disacharydy reagują znacznie wolniej niż monosacharydy aczkolwiek znacznie szybciej niż polisacharydy. Powstałe pochodne furfurylowe kondensują z różnymi fenolami, chinonami lub aminami aromatycznymi (naftolem, tymolem, rezorcyną) tworząc barwne produkty wykorzystywane do wykrywania cukrów. W przypadku reakcji Molisha z -naftolem wynikiem kondensacji jest produkt o barwie fioletowej (3). 2-2 (3) : -, - 2 -naftol pochodna cukru produkt kondensacji ciemnofioletowy Próba Molisha jest najbardziej ogólną reakcją na węglowodany. Ujemny jej wynik pozwala jedynie wykluczyć obecność cukrowca, dodatni zaś nie jest wystarczjący do stwierdzenia jego obecności, ze względu na jej małą specyficzność, gdyż w jej wyniku barwny produkt dają również aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, mrówkowy lub cytrynowy. dczynniki: 10% etanolowy roztwór -naftolu Stężony 2 S 4 Do 1 ml badanego roztworu cukru dodać 2 krople 10% etanolowego roztworu -naftolu i dokładnie wymieszać. Następnie lekko przechylić probówkę, powoli i bardzo ostrożnie po ściankach wprowadzić około 1ml stężonego 2 S 4, tak aby nie zamieszać obydwu roztworów. Powstający na granicy warstw czerwonofioletowy pierścień świadczy o dodatnim wyniku próby. Próba Lugola wykrywanie polisacharydów Zasada metody Polisacharydy w odróżnieniu od oligo- i monosacharydów tworzą z jodem barwne kompleksy, co pozwala na ich jednoznaczne odróżnienie, gdyż kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki odpowiednio duże i o uporządkowanej strukturze. oztwory skrobi oraz innych polisacharydów pod wpływem wodnego roztworu jodu przyjmują intensywnie niebiesko-granatowe barwy. W wyniku tej reakcji następuje adsorpcja 2
kanałowa jodu przez polisacharydy, który wnikając do kanału utworzonego przez helikalnie skręcone łańcuchy węglowodanów jest przetrzymywany przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy (ys.1.). Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt glukozylowych, czyli na jeden skręt helisy. ddziaływanie jednostek polisacharydu z cząsteczkami jodu ma charakter niekowalencyjny, opierajacy się głównie na siłach Van der Waalsa i wiązaniach typu przeniesienia ładunku (charge transfer). Wzdłuż wytworzonego w ten sposób łańcucha drobin jodu przemieszczają sie elektrony, efektem tej delokalizacji elektronowej jest silne pochłanianie światła przez układ. bserwowana barwa zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza z jodem daje zabarwienie intensywnie niebieskie. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia sie na fioletowoczerwoną (amyloza) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks o barwie czerwonej. grzewanie powoduje rozkręcenie się helisy, jod zostaje uwolniony co jest przyczyną zaniku zabarwienia. dczynniki: ys. 1. Kompleks skrobi z jodem (Garrett i Grischam 1999, Koolman i öhm 2005) oztwór I 2 w KI - płyn Lugola (2g KI rozpuszczono w 5 ml 2, w tym roztworze rozpuszczono 1g jodu i uzupełniono wodą do 300 ml. Przed użyciem rozcieńczono 150 razy) Do 1 ml badanego roztworu dodać trzy krople roztworu jodu (I 2 ) w jodku potasu (KI). W obecności skrobi powstaje ciemnoniebieskie zabarwienie. Następnie próbkę, w której zaobserwowano niebieską barwę, ogrzać do wrzenia na łaźni wodnej, zaobserwować czy zabarwienie znika, po czym próbkę schłodzic pod bieżącą wodą i zaobserwować czy zabarwienie powraca. Próba Biala Pentozy podczas ogrzewania ze stężonym kwasem solnym ulegają odwodnieniu przekształcając się w furfural, który w reakcji z orcyną i w obecności jonów żelaza(iii) tworzy kompleks o barwie zielononiebieskiej (4). eksozy natomiast przekształcając się w hydroksymetylofurfural w tych samych warunkach reaguję znacznie słabiej dając kompleks o barwie zielonobrązowej. 3
3 2-2 2 3 3 (4) : -, - 2 dczynniki: orcyna pochodna cukru produkt kondensacji zielononiebieski dczynnik Biala: 0,2% roztwór orcyny w 20% roztworze l 1% roztwór Fel 3 w 2 Do probówki wprowadzić 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% roztworze l a następnie dodać 1 krople 1% Fel 3 i 0,5 ml badanej próbki. ałość wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. eakcja Seliwanowa eakcja Seliwanowa jest wykorzystywana do odróżnienia ketoz od aldoz na zasadzie różnicy w szybkości odwadniania tych cukrów. Ketozy ogrzewane w 12% l w temperaturze 100 o w ciągu 30 sekund ulegają odwodnieniu do 5-hydroksymetylofuranu. W tych warunkach aldozy nie ulegaja odwodnieniu co pozwala na ich zróżnicowanie od heksoz. Powstały 5-hydroksymetylenofurfural kondensuje z rezorcyną tworząc kompleks o barwie czerwonowiśniowej (5).! Użycie kwasu bardziej stężonego jak również wydłużenie czasu ogrzewania lub podwyższenie temperatury może sprawić iż reakcji tej ulegną również aldozy.! Próba ta daje również wynik pozytywny w przypadku wielocukrów zawierajacych ketozy. 2-3 2 (5) : -, - 2 rezorcyna pochodna cukru produkt kondensacji czerwonowisniowy dczynniki: dczynnik Seliwanowa: 2% roztwór rezorcyny w etanolu 12% l 4
Do 0,5 ml badanego roztworu cukru dodać 1 ml 12% roztworu l oraz kroplę 2% roztworu rezorcyny w etanolu. Po wymieszaniu zawartości probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na około 30 sekund, a następnie szybko oziębić w strumieniu zimnej wody. eakcja Wohlkego Podczas ogrzewania roztworów dwucukrów redukujących (laktoza, maltoza) z amoniakiem w obecności K powstaje czerwone zabarwienie. ukry proste natomiast tych samych warunkach tworzą żółto-brązowy produkt. dczynniki: stężony roztwór amoniaku 3% roztwór K w 2 Do 1 ml badanej próbki dodać 1 ml stężonego roztworu amoniaku i 3 krople 3% K. Wstawić do łaźni wodnej na kilka minut i obserwować powstałe zabarwienie. Próba Barfoeda eakcja ta pozwala na odróżnienie mono- i disacharydów, gdyż wzrost stężenia jonów wodorowych powoduje zmniejszenie zdolności redukcyjnych węglowodanów. W środowisku lekko kwaśnym przy niskim stężeniu cukrów i krótkim czasie ogrzewania monosacharydy wykazuja właściwości redukujące, natomiast disacharydy w których wolna grupa karbonylowa jest mało reaktywna dają wynik pozytywny po dłuższym ogrzewaniu, kiedy ulegają hydrolizie i zostaje rozerwane wiązanie glikozydowe. dczynniki: odczynnik Barfoeda: 24 g octanu miedzi(ii) rozpuszczono w 450 ml gorącej wody. Dodano 25 ml 8,5% roztworu kwasu mlekowego. Po rozpuszczeniu soli odczynnik oziębiono i uzupełniono w kolbie miarowej do objętości 500 ml. 5
Do 0,5 ml badanej próbki dodać 1 ml odczynnika Barfoeda i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 3 minuty. Jeśli po tym czasie nie wytrącił się osad probówkę ponownie umieścić w łaźni wodnej i ogrzewać 10 minut. Pojawienie się czerwonego ceglastego osadu u 2 w próbce po ok. 3 min. ogrzewania potwierdza obecność monosacharydów, jeśli osad pojawi się po kilkunastu minutach potwierdza to obecność disacharydu. Próba Tollensa dczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody amoniakalnej do roztworu azotanu(v) srebra (6). Powstający brunatny osad tlenku srebra rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku. Powstaje jon kompleksowy diaminasrebra(i) [Ag(N 3 ) 2 ] (7). Wprowadzenie do odczynnika Tollensa cukru o właściwościach redukujących (z aktywną grupą aldehydową) powoduje redukcję jonów srebra(i) do metalicznego srebra tworzącego lustro srebrowe (8). 2 AgN 3 N 3 2 Ag 2 2 N 4 N 3 Ag 2 N 3 2 4 2 [Ag(N 3 ) 2 ] - 2 (6) (7) 2 [Ag(N 3 ) 2 ] 2 Ag 4 N 3 (8) 2 2 dczynniki: 5% roztwór azotanu(v) srebra 10% roztwór amoniaku Do probówki odmierzyć 1 ml 5% roztworu azotanu(v) srebra AgN 3, następnie dodawać po kropli 10% roztworu amoniaku do momentu, aż powstający osad Ag rozpuści się w nadmiarze amoniaku. Dodać 1ml badanego roztworu cukru i dokładnie wymieszać po czym wstawić do łaźni wodnej i obserwować wynik reakcji. 6
2. Enzymatyczna hydroliza sacharozy Sacharoza jest disacharydem złożonym z dwóch reszt monosacharydów połączonych ze sobą wiazaniem -1,2-glikozydowym. Sacharoza zbudowana jest z reszty glukozy ( -Dglukopiranozy) oraz fruktozy ( -D-fruktofuranozy) (9). 2 2 1 2 2 sacharoza (9) -D-glukopiranozylo-(1 2)- - D-fruktofuranoza W środowisku kwaśnym jak również pod wpływem enzymu zwanego inwertazą sacharoza bardzo łatwo ulega hydrolizie do fruktozy i glukozy (10). l, enzymy 12 22 11 2 6 12 6 6 12 6 sacharoza glukoza fruktoza (10) Drożdże piekarskie zawieraja enzym zwany -inwertaza, który katalizuje hydrolize wiązania -glikozydowego rozkładajac sacharoze na glukoze i fruktozę. Do trzech probówek wprowadzić po 0,5 ml zawiesiny drożdży w wodzie. Do pierwszej (próba kontrolna) dodać 0,5 ml 2. Drugą wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 min. Po upływie tego czasu do probówek drugiej i trzeciej dodać po 0,5 ml roztworu sacharozy i wymieszać. Następnie z każdej probówki pobrać po 0,5 ml roztworu i przenieść do oddzielnych probówek, po czym wykonac próbę Benedicta zgodnie z procedura podana poniżej. Tabela 1 Nr probówki 1 2 3 Zawiesina drożdży [ml] 0,5 0,5 0,5 2 [ml] 0,5 - - grzewanie/czas Temp. Pok./10 min. 100 o /10 min. 100 o /10 min. Sacharoza [ml] - 0,5 0,5 7
Próba Benedicta Próba Benedicta należy do najbardziej specyficznych i czułych prób redukcyjnych na cukry. Wolne grupy aldehydowe węglowodanów w środowisku zasadowym wykazują właściwości redukujące. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa redukuje jony miedzi(ii) z odczynnika Benedicta do jonów miedzi(i). Powstający w tej reakcji u 2 w zależności od ilości cukru redukujacego ma różne zabarwienie (od zielonożółtego przez pomarańczowe do czerwonego). dczynniki: odczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodu i 90 g bezwodnego węglanu sodu rozpuszczono w 60 ml gorącej wody. Po przesączeniu roztworu, do przesączu dodano 100 ml 17,3% roztworu us 4 5 2. Mieszaninę uzupełniono w kolbie miarowej do 1000 ml. Do każdej probówki dodać po 2,5 ml odczynnika Benedicta, następnie wszystkie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 min. Zaobserwować, w której probówce pojawia się zielone zabarwienie albo żółty, pomarańczowy lub czerwony osad (barwa powstającego osadu zależy od ilości cukru redukującego w roztworze). Zaznaczyć w których probówkach próba wypada ujemnie i wyjaśnic dlaczego. us 4 -, cytrynian u() 2 u 2 (11) 2 u u 2 (12) 2 2 Tabela 2. cena ilosci cukru w próbce na podstawie próby Benedicta Barwa sad Stężenie cukru [%] Niebieska brak 0 Zielona brak 0,1 0,3 Zielona osad 0,5 Zółtozielona osad 1,0 pomarańczowa osad 1,5 czerwona osad >2,0 8
Schemat analizy jakościowej węglowodanów PÓBA MLISA PÓBA Z JDEM BAK UKWA SKBIA PÓBA TLLENSA PÓBA SELIWANWA PÓBA BAFEDA SAAZA PÓBA BIALA PÓBA WLKEG KSYLZA GLUKZA FUKTZA LAKTZA MALTZA PÓBA SELIWANWA FUKTZA GLUKZA 9