Właściwości ogólne i metody hodowli wirusów, odczyny serologiczne Maciej Przybylski Katedra i zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM Definicja wirusa Organizm o budowie niekomórkowej, którego genom zbudowany jest z kwasu nukleinowego i który bezwzględnie musi namnażać się wewnątrz żywych komórek, wykorzystując ich metabolizm i aparat syntezy białek do syntezy komponentów, które składają się w strukturę zwaną wirionem, chroniącą kwas nukleinowy i umożliwiającą transport wirusa między komórkami 1
I. Systematyka wirusów Taksonomia wirusów (Rząd) -virales rodzina -viridae podrodzina virinae rodzaj virus»gatunek 9th Report of International Committee on Taxonomy of Viruses (2011) 2
Przykłady Wirus opryszczki typu 1 Rząd: Herpesvirales Rodzina: Herpesviridae Podrodzina: Alphaherpesvirinae Rodzaj: Simplexvirus Gatunek: Human Herpesvirus 1 (HHV-1) Syncytialny wirus oddechowy Rząd: Mononegavirales Rodzina: Paramyxoviridae Podrodzina: Paramyxovirinae Rodzaj: Pneumovirus Gatunek: Human Respiratory Syncytial Virus Klasyfikacja wirusów DNA 3
Klasyfikacja wirusów RNA Polarność wirusowej nici RNA 4
II. Właściwości ogólne wirusów Wielkość wirusów DNA 5
Wielkość wirusów RNA Budowa wirusów kwas nukleinowy kapsyd białka matrix i białka związane z kwasem nukleinowym (niektóre rodziny) osłonka (niektóre rodziny) białka powierzchniowe związane z osłonką (niektóre rodziny) 6
Symetria kapsydów wirusowych Spiralna (helikalna) Ikozaedralna (dwudziestościenna) 7
Replikacja wirusów w komórce adsorpcja wniknięcie odpłaszczenie synteza białek wczesnych powielenie genomu synteza białek późnych składanie i dojrzewanie wirionów potomnych uwolnienie dojrzałych wirionów Następstwa zakażenia komórki 8
III. Metody hodowli wirusów Izolacja i namnażanie wirusów kręgowców 2. Sposoby namnażania wirusów: w zwierzętach laboratoryjnych (próba biologiczna) w zarodkach ptaków w hodowlach komórkowych 9
Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych 1. Rodzaje hodowli stosowanych do namnażania wirusów: pierwotne półciągłe ciągłe 2. Źródła komórek używanych do hodowli komórkowych: tkanki embrionalne tkanki nowotworowe tkanki dojrzałe Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych Wygląd współczesnych butelek do hodowli komórkowych 10
Namnażanie wirusów: diagnostyka zakażenia badania naukowe produkcja antygenów monolayer - jednowarstwowa hodowla komórkowa Linia komórkowa Vero 11
Pożywki do hodowli komórkowych zawierają: - cukry - aminokwasy - witaminy - sole mineralne - związek buforujący (do ph 7,2-7,4) - wskaźnik barwny ph - antybiotyki - surowicę (najcześciej płodową cielęcą) w stężeniu 10-20% pożywka wzrostowa w stężeniu 2-5% pożywka utrzymująca Warunki hodowli: temperatura 37 O C stężenie CO 2 5% odpowiednia wilgotność 12
Efekty cytopatyczne (cytopathogenic effect CPE) wtręty wewnątrzkomórkowe (wewnątrzjądrowe, cytoplazmatyczne) wielojądrzaste komórki olbrzymie zmiana kształtu komórki zniszczenie komórki (liza) transformacja nowotworowa Przykładowe efekty cytopatyczne Adenowirus Wirus ECHO HSV-1 Wirus świnki 13
Zmiany niecytopatyczne 1. hemadsorpcja - np. ortomyksowirusy, paramyksowirusy 2. interferencja - np. wirus różyczki Hemadsorpcja w komórkach zakażonych wirusem parainfluenzy 14
IV. Patogeneza zakażeń wirusowych Patogeneza zakażenia wirusowego 15
Patogeneza zakażenia wirusowego wniknięcie wirusa (skóra, błony śluzowe) namnożenie wirusa we wrotach zakażenia zmiany miejscowe replikacja w węzłach chłonnych i RES wiremia zakażenie uogólnione zakażenie narządów śmierć Odporność komórkowa nieswoista i swoista Wszystkie elementy układu odpornościowego Formy zakażeń wirusowych ostre przewlekłe objawowe bezobjawowe poronne pierwotne powtórne miejscowe narządowe uogólnione latentne persystentne wynikające z reaktywacji w. latentnego 16
Odpowiedź immunologiczna w zakażeniu wirusowym odpowiedź komórkowa i humoralna odpowiedź nieswoista bariery, makrofagi, komórki NK, apoptoza, interferony, TNF wirusy = antygeny endogenne odpowiedź swoista MHC-I, limfocyty Tc, ADCC: niszczenie komórek zakażonych wirusem odpowiedź swoista MHC-II, limfocyty Th, limfocyty B, przeciwciała: IgA na błonach śluzowych, IgM, IgG neutralizacja wirionów we krwi i płynach ciała V. Diagnostyka wirusologiczna 17
Metody diagnostyki wirusologicznej Wykrywanie wirusa: zakaźnych cząstek wirusa białek wirusowych (antygenów) wirusowego kwasu nukleinowego Wykrywanie przeciwciał swoistych wobec wirusa wywołującego zakażenie Objawy wskazujące na etiologię wirusową zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu zapalenie wątroby zapalenie mięśnia sercowego, osierdzia, wsierdzia objawy porażenne gorączki krwotoczne przedłużające się stany gorączkowe biegunki niemowląt i dzieci poniżej 2 roku życia zespół nabytego upośledzenia odporności 18
Grupy osób, u których należy wykonywać diagnostyczne badania wirusologiczne u kobiet w ciąży (ryzyko uszkodzenia płodu) u noworodków (ryzyko zakażenia okołoporodowego lub wrodzonego) u biorców przeszczepów u chorych na AIDS u dawców krwi u dawców narządów do przeszczepów u osób z upośledzeniem odporności Pobieranie materiału do badań wirusologicznych do jałowych pojemników z zachowaniem zasad aseptyki wystarczająca do badania ilość materiału do każdego badania (nie materiału!) musi być dołączone skierowanie 19
Transport materiału do badań wirusologicznych SZYBKO optymalna temperatura = 4 C wymazy, popłuczyny - w odpowiednim płynie transportowym między odległymi placówkami - w odpowiednich zestawach transportowych do materiału nie wolno dodawaćżadnych związków chemicznych Izolacja wirusów w hodowlach komórkowych Materiałem pobranym od chorego zakaża się wrażliwe linie komórkowe Jeżeli w materiale klinicznym był wirus (aktywny!), wywoła on zmiany w komórkach hodowli = efekt cytopatyczny Efekt cytopatyczny może służyć do wstępnej identyfikacji wirusa Konieczna jest późniejsza dokładna identyfikacja 20
Efekty cytopatyczne (1) Efekty cytopatyczne (2) 21
Antygeny białka powierzchniowe białka kapsydu białka związane z RNA lub DNA białka tegumentu Antygen jest to cząsteczka rozpoznawana jako obca przez organizm immunokompetentny (czyli zdolny do prawidłowej odpowiedzi immunologicznej) Epitop jest to część antygenu rozpoznawana przez receptory komórek odpornościowych i przeciwciała (odpowiedzialna za jego immunogenność) Cechy charakterystyczne antygenów Immunogenność - zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej Swoistość - komórki odpornościowe uczulone (aktywowane) przez jeden typ antygenu reagują potem tylko na ten typ antygenu Własności immunogenne mają białka, węglowodany i wiele innych związków chemicznych 22
Wykrywanie antygenów wirusowych do wykrywania antygenów używa się swoistych wzorcowych przeciwciał najczęściej wykorzystuje się przeciwciała znakowane: fluoresceiną enzymem izotopem radioaktywnym zastosowanie znacznika umożliwia uwidocznienie wzorcowych przeciwciał związanych z wykrywanym wirusem Wykrywanie wirusowych kwasów nukleinowych opiera się na wykryciu wysoce swoistych sekwencji DNA lub RNA wirusów bezpośrednie wykrycie genu wirusowego (metody hybrydyzacji) namnożenie wirusowego KN obecnego w materiale klinicznym, następnie wykrycie (PCR) kombinacje powyższych metod 23
Przeciwciała Przeciwciałami (albo immunoglobulinami) nazywamy cząsteczki białkowe syntetyzowane po pobudzeniu antygenem, skierowane swoiście przeciwko temu antygenowi. Przeciwciała są wytwarzane przez komórki plazmatyczne (aktywowane limfocyty B). Swoista aktywacja limfocytów B 24
Budowa immunoglobuliny Klasy immunoglobulin organizm człowieka produkuje 5 klas przeciwciał: immunoglobuliny G (IgG) immunoglobuliny M (IgM) immunoglobuliny A (IgA) immunoglobuliny E (IgE) immunoglobuliny D (IgD) W odpowiedzi przeciwzakaźnej najważniejszą rolę odgrywają przeciwciała klas IgG, IgM i IgA 25
Swoista odpowiedź humoralna Metody serologiczne w badaniach wirusologicznych metody serologiczne (serum = surowica) opierają się na wykrywaniu przeciwciał swoistych wobec antygenów wirusów, które wywołały zakażenie metody te opierają się na swoistości reakcji antygen - przeciwciało 26
Metody serologiczne - wykrywanie przeciwciał szczególnie przydatne w diagnostyce chorób wirusowych, w których napotykamy trudności w izolacji lub wykryciu czynnika etiologicznego: AIDS WZW A-E różyczka odra wirusowe zapalenia mózgu mononukleoza zakaźna) metodami laboratoryjnymi przeciwciała wykrywa się najczęściej w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym (neuroinfekcje) Wykrywanie przeciwciał - zastosowanie badanie surowic parzystych określenie wzrostu miana swoistych przeciwciał wykrywanie przeciwciał w klasie IgM w surowicy - wykrywanie bieżącego zakażenia; w płynie mózgowo-rdzeniowym - potwierdzenie neuroinfekcji u noworodków - potwierdzenie zakażenia wrodzonego wykrywanie przeciwciał w klasie IgG potwierdzenie kontaktu z antygenem (po zakażeniu lub szczepieniu IgG utrzymują się w surowicy nawet przez wiele lat) metody jakościowe lub ilościowe 27
Badanie surowic parzystych Laboratoryjne metody wykrywania przeciwciał odczyny aglutynacji odczyny precypitacyjne odczyny hemaglutynacji test ELISA (enzymatyczny odczyn immunosorbcyjny) Immunobloting (Western-Blott) odczyn immunofluorescencji odczyn wiązania dopełniacza odczyn zahamowania hemaglutynacji 28
Western-Blott 29
Aglutynacja Reakcja zachodząca pomiędzy immunoglobulinami a antygenem w formie komórkowej (bakterie, drożdże, erytrocyty, leukocyty itp.). Polega ona na zlepianiu się komórek pod wpływem swoistych Ig i wypadaniu ich z roztworu w obecności elektrolitów. Precypitacja Reakcja zachodząca pomiędzy immunoglobulinami i rozpuszczalnym antygenem przejawiająca się powstawaniem strątów Zakażenie miejscowe Przykłady: opryszczka zwykła, zapalenie spojówek Diagnostyka: najczęściej na podstawie objawów klinicznych laboratoryjne wykrycie wirusów w zmianach miejscowych 30
Ostre zakażenie uogólnione Przykłady: odra, różyczka, ospa wietrzna i wiele innych Diagnostyka: objawy kliniczne wykrycie wirusa w zmianach miejscowych, wydzielinach, wydalinach, krwi wykrycie przeciwciał Zakażenie przewlekłe Przykłady: przewlekłe WZW, zakażenie HIV Diagnostyka: objawy kliniczne wykrycie wirusa we krwi monitorowanie poziomu wirusa we krwi (przewlekła wiremia) wykrycie wirusa w narządach wewnętrznych monitorowanie obecności i poziomu przeciwciał 31
III. Wybrane wirusy chorobotwórcze dla człowieka Wirusy ważne ze względu na groźne następstwa zakażenia wirusy wywołujące choroby zgłaszane i zwalczane z urzędu wirusy badane we krwi dawców wirusy stanowiące zagrożenie w przypadku zakażenia wrodzonego 32
Choroby wirusowe zgłaszane i zwalczane z urzędu (I) obowiązek zgłaszania, rejestracji i hospitalizacji: wirusowe zapalenia wątroby wszystkich typów biegunki wirusowe wieku dziecięcego wirusowe zapalenia mózgu i opon mózgowordzeniowych nagminne porażenie dziecięce (poliomyelitis) wirusowe gorączki krwotoczne i tropikalne zespół nabytego upośledzenia odporności (obowiązek rejestracji i leczenia) wścieklizna Choroby wirusowe podlegające obowiązkowi zgłaszania i rejestracji mononukleoza zakaźna różyczka świnka odra (+ szczepienia) grypa (obowiązek zgłaszania) 33
Wirusy badane we krwi dawców wirus zapalenia wątroby typu B wirus zapalenia wątroby typu C ludzki wirus upośledzenia odporności Wirusy groźne w przypadku zakażenia wrodzonego HIV WZW typu C WZW typu B wirus różyczki ludzkie herpeswirusy typu 1 i 2 (wirusy opryszczki typu 1 i 2) wirus cytomegalii także inne wirusy (wirus ospy wietrznej i półpaśca, wirusy Coxsackie) 34