BUDOWA, REPLIKACJA, SYSTEMATYKA WIRUSÓW METODY HODOWLI WIRUSÓW. Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Anna Majewska Warszawa, 2014

Transkrypt

1 BUDOWA, REPLIKACJA, SYSTEMATYKA WIRUSÓW METODY HODOWLI WIRUSÓW Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Anna Majewska Warszawa, 2014

2 OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WIRUSÓW Małe rozmiary (20 nm-300 średnicy) Brak budowy komórkowej Zależą całkowicie od żywych komórek Nie rosną na podłożach sztucznych Bezwzględne pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe Posiadają jeden rodzaj kwasu nukleinowego Nie namnażają się przez podziały Są niewrażliwe na antybiotyki

3 Wrażliwość na czynniki fizyczne i chemiczne temperatura Stan głębokiego zamrożenia sprzyja utrzymywaniu się aktywności zakaźnej Temperatura dodatnia - inaktywacja (wirus odry, różyczki) WYJĄTEK! WZW B zachowuje zakaźność 12 h- 60ºC wysuszenie W temperaturze pokojowej inaktywacja W niskiej temperaturze liofilizacja- zachowana zakaźność i cechy antygenowe produkcja szczepionek (szczepionka OPV, wg Sabina)

4 Wrażliwość na czynniki fizyczne i chemiczne ultradźwięki promieniowanie jonizujące i niejonizujące (UV) uszkodzenie kwasu nukleinowego ph środowiska ph optymalne ph 2-3 umożliwia przeżycie enterowirusów, wirusom KZM związki chemiczne detergenty rozpad osłonki lipidowej i kapsydu formaldehyd niszczy kwas nukleinowy

5 Budowa wirusa kwas nukleinowy (DNA lub RNA) DNA jest zwykle dwuniciowy (wyjątek parwowirusy) RNA jest zwykle jednoniciowy (wyjątek reowirusy) jednoniciowy RNA - o dodatniej (mrna) lub ujemnej polarności (transkrypcja do kopii o dodatniej polarności)

6 kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokopsyd Funkcje kapsydu: ochronna udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje z receptorami błony komórkowej

7 Nukleokapsyd o symetrii ikosaedralnej adenowirusy herpeswirusy pikornawirusy liczba kapsomerów jest cechą taksonomiczną

8 Nukleokapsyd o symetrii helikalnej (spiralnej) kapsomery spiralnie otaczają kwas nukleinowy wydłużony kształt rabdowirusy filowirusy wirus Ebola

9 Osłonka nabyta z błony komórkowej podczas późnych faz replikacji glikoproteiny przyleganie do receptorów komórkowych pobudzanie interakcji z białkami nukleokapsydu (dojrzewanie potomnych cząstek wirusa)

10 osłonka wirusa wszystkie wirusy o symetrii helikalnej wirusy o symetrii ikosaedralnej: togawirusy herpeswirusy retrowirusy flawiwirusy

11 wirusy bezosłonkowe oporne na wysuszenie, detergenty, ekstremalne ph i temperatury przenoszone droga oddechową i fekalno-oralną wirusy osłonkowe wymagają wilgotnego środowiska, wrażliwe na kwasy i detergenty

12 Białka wirusowe strukturalne enzymatyczne polimerazy wirusowe (replikacja) proteazy modyfikacja dużych protein w procesie translacji, uwolnienie kwasu nukleinowego z nukleokapsydu endonukleazy i ligazy (replikacja)

13 Postaci pozakomórkowa spoczynkowa wirion wewnątrzkomórkowa aktywna pozbawiony białkowego płaszcza komórka zarażona wirusem wścieklizny: liczne wirusy (szare, pałeczkowate struktury) i większe, ciemniejsze ciałka wtrętowe Negriego

14 Kryteria uwzględniane w klasyfikacji wirusów wygląd, kształt i wielkość, cechy kwasu nukleinowego, typ, liczba nici i ich postać: (s, ds, liniowy, kolisty), liczba segmentów, masa cząsteczkowa, polarność genomu wirusowego, symetria nukleokapsydu, obecność osłonki lub jej brak, stopień pokrewieństwa antygenowego,

15 Replikacja wirusów rozpoznanie komórki (komórka permisywna) i adsorpcja, penetracja, odpłaszczenie kwasu nukleinowego wirusa, replikacja kwasu nukleinowego i synteza białek wirusowych, uwalnianie wirusów z komórki,

16 WIRUS RECEPTOR RECEPTOR KOMÓRKOWY WIRUSOWY Reowirusy HIV cząstka CD4 gp120 Ortomyksowirus Wirus grypy sialyloligosacharydy hemaglutynina Rabdowirus Wirus wścieklizny receptor acetylocholinowy białko G Hepadnawirusy HBV receptor hepatocytowy Pre-S

17 Penetracja Fuzja wirusowej osłonki z błona komórkową Białko fuzji, doprowadza do połączenia osłonki wirusowej z błoną komórkową, do cytoplazmy dostaje się nukleokapsyd, z którego uwalnia się kwas nukleinowy (odpłaszczanie) Translokacja bezpośrednie przejście wirusa przez błonę komórkową, małe wirusy

18 penetracja Endocytoza Wpuklenie błony komórkowej. Wirus zamknięty w pęcherzyku pokrytym klarytyną, który wędruje w głąb cytoplazmy

19 odpłaszczanie proteazy wirusowe trawią białka ochronne uwolnienie kwasów nukleinowych

20 synteza Replikacja kwasu nukleinowego Synteza białek wirusowych DNA przemieszcza się do jądra komórkowego

21 Dojrzewanie formowanie wirionów potomnych

22

23 wirusy osłonkowe egzocytoza, odzyskanie osłonki lipoproteinowej (ortomyksowirusy, paramyksowirusy) wirusy nagie liza komórki

24

25 Wirusy lityczne Cykl rozwojowy wirusa doprowadzający do rozpadu (lizy) atakowanej komórki Wirus wnika do komórki, zmusza ją do powielenia wirusowego kwasu nukleinowego i do syntezy wirusowych białek. Powstają potomne cząsteczki wirusa, które opuszczają komórkę, niszcząc ją.

26 Wirusy lizogenne Wirus nie powoduje śmierci komórki, ulega włączeniu do komórkowego DNA. DNA wirusa jest przekazywany komórkom potomnym w procesach podziałów komórkowych. Zjawisko to uznaje się za przyczynę niektórych zmian nowotworowych, a wirusy je wywołujące nazywamy wirusami onkogennymi.

27 Drogi zakażenia powietrzna inhalacyjna pokarmowa fekalno-oralna wertykalna krwiopochodna kontakt płciowy wektory autoinokulacja kontakt bezpośredni (zakażone powierzchnie)

28 Zakażenie pierwotne Zakażenie wtórne Zakażenie miejscowe Zakażenie narządowe Wiremia zakażenie narządów docelowym (tropizm OUN, wątroba, płuca, jelita, skóra, wirusy pantropowe)

29

30 latencja zakażenie latentne, utajone komórki nerwowe HSV-1, HSV-2, HSV-3 limfocyty B HHV-4 (EBV) limfocyty T HHV-5 (CMV) reaktywacja ze stanu latencji czynniki reaktywacji: bodźce termiczne, psychiczne, fizyczne, hormonalne, zakaźne

31

32 OBJAWY ZAKAŻENIA pierwsze objawy: gorączka, bóle mięśniowe, złe samopoczucie aktywacja dopełniacza i uwalnianie cytokin objawy miejscowe wysypka, obrzęk ślinianek, nieżyt nosa działanie cytopatogenne wirusa

33 objawy narządowe ostra faza choroby procesy nowotworowe zakażenia przetrwałe retrowirusy, papillomawirusy zakażenia wertykalne zakażenie płodu, noworodka

34 materiał diagnostyczny wczesna postekspozycja faza objawów klinicznych (wirusy oddechowe) ozdrowieńcy kontrola postępów leczenia wymaz z błony śluzowej nosa i gardła plwocina krew/surowica krwi moc, kał wymazy ze zmian skórnych, zeskrobiny aspiraty fragmenty tkanek

35 metody diagnostyczne obraz kliniczny hodowla komórkowa, obserwacja mikroskopowa: CPE, immunofluorescencja, mikroskopia elektronowa wykrywanie składników wirusowych wykrywanie przeciwciał

36 Hodowla wirusów diagnozowanie zakażeń badania naukowe produkcja antygenów (szczepionki, testy diagnostyczne) Metody hodowli hodowle komórkowe żywe układy: zwierzęta laboratoryjne zarodki ptasie

37 ZARODKI PTASIE KURZE rok - KACZE, PRZEPIÓRKI JAPOŃSKIE wirus świnki wirus grypy

38 zwierzęta laboratoryjne (myszy, świnki morskie, króliki, chomiki)

39 HODOWLE KOMÓRKOWE (1925rok WIRUS KROWIANKI W HODOWLI TKANKOWEJ, F. PARKER )

40 Hodowle komórkowe PIERWOTNE Komórki uzyskane ze świeżo izolowanych tkanek lub narządu WTÓRNE - USTABILIZOWANE PÓŁCIĄGŁE diploidalne, ograniczona liczba pasaży (40-50), utrzymują swój garnitur chromosomalny, ulegają aberracji i degeneracji, (MRC-5, WI-38), CIĄGŁE aneuploidalne, najczęściej wywodzą się z tkanki nowotworowej, VERO, HeLa,

41 Hodowle komórkowe Hodowla w naczyniach szkło, nietoksyczny plastik przyleganie do powierzchni tworząc jednowarstwową hodowlę monolayer Hodowla w zawiesinie mieszadła magnetyczne

42 Pożywki do hodowli komórkowych zawierają - cukry, - aminokwasy, - witaminy, - sole mineralne, - związek buforujący (do ph 7,2-7,4), - wskaźnik barwny ph, - antybiotyki, - surowicę (najczęściej płodową cielęcą) w stężeniu 10-20% w stężeniu 2-5% pożywka wzrostowa pożywka utrzymująca

43 WARUNKI HODOWLI temperatura 37ºC, stężenie CO 2 5%, wilgotność

44 Permisywność Wirus zakaża się i replikuje tylko w tych liniach komórkowych, których komórki zawierają odpowiedni dla gatunku wirusa receptor (komórki permisywne, zezwalające)

45 NAZWA TKANKA WIRUS POCHODZENIE MORFOLOGIA HeLa człowiek rak szyjki macicy nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, herpeswirusy Hep-2 człowiek rak krtani nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, flawiwirusy BHK-21 chomik nerka fibroblasty adenowirusy, herpeswirusy Vero małpa nerka nabłonkowa SV 40, herpeswirusy WI-38 człowiek płuca fibroblasty Polio 1, 2, VSV, adenowirusy PK świnia nerka nabłonkowa VSV, Coxsackie B2 - B6, flawiwirusy, herpeswirusy nie wszystkie wirusy mogą namnażać się we wszystkich liniach komórkowych, wirus replikuje się tylko w komórce permisywnej tj. zezwalającej, która posiada odpowiedni dla danego wirusa receptor.

46 Hodowle komórkowe stosowane w celach diagnostycznych, naukowych, produkcyjnych VERO

47 Vero (komórki nabłonkowe z zielonej małpy afrykańskiej) wielojądrowe komórki olbrzymie

48 Micrograph showing the viral cytopathic effect of herpes simplex virus (multi-nucleation, ground glass chromatin).

49 A okołojądrowe halo, powiększone hyperchromatyczne jądro B duże jądro, nieregularne rozmieszczenie chromatyny, nieregularna osłonka

50 HAdV ludzkie adenowirusy

51 Metody wykrywania wirusów

52 ZMIANY CYTOPATYCZNE (CPE) WTRĘTY- ciałka wtrętowe, widoczne w barwionych, zakażonych komórkach za pomocą mikroskopu świetlnego. Są to skupiska wirusów lub wirusy otoczone komórkowymi elementami białkowymi i lipidowymi lub składniki komórkowe powstałe pod wpływem zmienionego metabolizmu zakażonej komórki. wtręty cytoplazmatyczne

53 wtręty jądrowe (herpeswirusy) Wtręty A (HSV, VZV) ostro odgraniczone, otoczone jasną przestrzenią od chromatyny jądrowej Wtręty B (poliowirus, żółtej febry) mniejsze. Wtręty jądrowe i cytoplazmatyczne (wirus odry)

54 CPE - wirus odry w linii komórkowej HeLa, syncytia, wtręty cytoplazmatyczne (barwienie hematoksyliną)

55 Hepatocyt wewnatrzjądrowe wtręty, otoczone strefą halo. barwienie H&E.

56 Wielojądrzaste komórki olbrzymie syncytia np. paramyksowirusy, herpeswirusy

57 Skupiska powiększonych i zaokrąglonych komórek, utrata mostków cytoplazmatycznych (grona winogron) - adenowirusy

58 zaokrąglenie i obkurczenie komórek. liza (zniszczenie warstwy komórek) np. poliowirus

59

60 Efekt cytopatyczny powodowany przez wirusa HSV hodowla prawidłowa (linia Vero) CPE

61 Efekt cytopatyczny powodowany przez poliowirusy hodowla prawidłowa (linia Vero) CPE c

62 Efekt cytopatyczny powodowany przez cytomegalowirusa

63 Efekt cytopatyczny powodowany przez wirusa Coxsackie A hodowla prawidłowa (linia PMK) CPE

64 Transformacja nowotworowa komórek wzrost jednowarstwowy zastąpiony jest chaotycznym i wielowarstwowym, grudkowate skupiska, aberracje chromosomów

65 HHV-8 Mięsak Kaposiego

66 HPV typy onkogenne

67 EBV - Chłoniak Burkitta

68 ZMIANY NIECYTOPATYCZNE 1. Hemadsorpcja ortomyksowirusy, paramyksowirusy 2. Interferencja podwójne zakażenie = oporność na zakażenie komórki innym wirusem

69 Hemaglutynacja [Hirst 1941] Stosowania do wykrywania wirusów posiadających na swej otoczce hemaglutyniny np. wirusa grypy Uwolnione wirusy w pożywce hodowlanej + krwinki czerwone = aglutynacja erytrocytów konglomeraty erytrocytarnowirusowe Dokładna identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli komórkowej wymaga zastosowania dodatkowych technik diagnostycznych