ĆWICZENIE 3. Wirusy chorobotwórcze dla człowieka Podstawowe metody stosowane w wirusologii Metody serologiczne w diagnostyce mikrobiologicznej

Transkrypt

1 WYDZIAŁ NAUKI O ZDROWIU Oddział Ratownictwa Medycznego ĆWICZENIE 3 Wirusy chorobotwórcze dla człowieka Podstawowe metody stosowane w wirusologii Metody serologiczne w diagnostyce mikrobiologicznej I. Ogólna charakterystyka wirusów II. Metody hodowli wirusów III. Metody serologiczne używane w diagnostyce mikrobiologicznej IV. Do wykonania: 1. Odczyn hemaglutynacji wirusowej: diagnostyka grypy 2. Odczyn lateksowy w diagnostyce zakażen rotawirusami 3. Odczyn serologiczny w diagnostyce kiły VDRL V. Demonstracje: 1. Szkło laboratoryjne stosowane w laboratorium wirusologicznym oraz pożywki dla hodowli komórkowych 2. Przykladowe efekty cytopatyczne 3. Prawidłowa hodowla komórkowa 4. Mianowanie wirusów w jednostkach łysinkowych (PFU plaque forming units) 5. Test immunoenzymatyczny ELISA wykrywanie przeciwciał w klasie IgM przeciwko wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu 6. Test ELISA (badanie serologiczne krwi pobranej od krwiodawców w kierunku wirusów zapalenia wątroby oraz ludzkiego wirusa upośledzenia odporności) 1

2 UWAGA: Badane na ćwiczeniach materiały są niezakaźne. Czynniki chorobotwórcze zostały zinaktywowane w odrębnej procedurze. W laboratoriach wykonujących diagnostykę rutynową, gdzie nie stosuje się takich procedur, każdy materiał traktuje się jako potencjalnie zakaźny. Stosuje się specjalne środki ochrony (komory laminarne, rękawiczki, niehigroskopijne faruchy ochronne, okulary lub osłony na twarz). DO WYKONANIA: Odczyn hemaglutynacji wirusowej w diagnostyce grypy W związku ze zwiększoną ilością zachorowań w sezonie epidemicznym grypy przeprowadzono badania izolacyjno-epidemiczne. Pobrano popłuczyny z jamy nosowogardłowej chorych, którymi (po opracowaniu) zakażono dziwięciodniowe zarodki kurze. Po trzech dniach inkubacji pobrano płyn omoczniowy z ewentualnie namnożonym wirusem w celu jego identyfikacji. Wstępne wykrycie wirusa w odczynie hemaglutynacji: 1. Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę płynu omoczniowego 2. Dodajemy krwinki kurze, mieszamy W celu dalszej identyfikacji wirusa określa się typ hemaglutyniny i neuraminidazy. Odczyn lateksowy w diagnostyce zakażeń rotawirusami. Pediatrzy skierowali do szpitala dwoje dzieci w wieku miesięcy z objawami silnej biegunki. Dzieci wymagały hospitalizacji, m.in. ze względu na silne odwodnienie organizmu. Od dzieci pobrano kał. W kale nie wykryto leukocytów, materiał przesłano zatem do pracowni wirusologicznej. Probówki zawierają filtrat z supernatantu kału.. Badanie wykonać z kontrolami: ujemną i dodatnią oraz z próbkami badanymi 1 i 2. Odczyn flokulacyjny VDRL diagnostyka kiły Odczyn VDRL (skrót od ang. Veneral Diseases Research Laboratory) - test serologiczny w służący do wstępnej diagnostyki kiły jest wykorzystywany jako test przesiewowy (poborowi, kobiety w ciąży, przcownicy służby zdrowia, dawcy krwi), a także u pacjentów z podejrzeniem zakażenia krętkiem bladym. Zasadą odczynu jest wykrywanie w surowicy pacjentów przeciwciał przeciwko kardiolipinie białku wykazującemu reaktywność krzyżową z antygenami krętków. Test VDRL należy do odczynów nieswoistych, w związku z tym mogą zdarzać się wyniki fałszywie dodatnie (m.in. w przebiegu zakażenia HIV, w zakażeniach mykoplazmami, w 2

3 malarii i liszaju rumieniowatym). W związku z tym każdy dodatni wynik VDRL należy potwierdzać serologicznymi testami swoistymi wykrywającymi przeciwciała przeciwko antygenom krętków (np. FTA-ABS, ELISA) DEMONSTRACJE: Diagnostyka wirusologiczna WZW i HIV zastosowanie testu ELISA do badania serologicznego krwi. Badane surowice oznaczono symbolami DK-1 i DK-2. Test ELISA służy do wykrycia przeciwciał i jest używany jako metoda przesiewowa przy ocenie krwi pobranej od dawców. W surowicach badanych rutynowo w stacjach krwiodawstwa oprócz oznaczania przeciwciał anty-hiv i anty WZW-B wykonuje się oznaczenia przeciwciał anty-hcv, bada się poziom antygenu HBs, oraz wykrywa się przeciwciała przeciwko krętkowi blademu (Treponema pallidum). Możliwe jest też badanie przy wykorzystaniu technik biologii molekularnej wykrywanie kwasów nukleinowych HBV, HCV i HIV. Test immunoenzymatyczny ELISA wykrywanie przeciwciał w klasie IgM przeciwko wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu Zakażenie wirusem KZM przebiega najczęściej bezobjawowo lub ze skąpymi objawami. W przypadkach objawowych KZM ma najczęściej przebieg dwufazowy. Pierwsza faza trwa od 1 do 8 dni, występują wtedy objawy grypopodobne: gorączka, bóle stawowe, nieżyt górnych dróg oddechowych, wymioty, niekiedy wysypka. Po tej fazie następuje okres bezobjawowy (do 3 tygodni), po którym może wystąpić drugie stadium choroby, związane z zajęciem ośrodkowego układu nerwowego. Tę fazę obserwuje się u około 10-30% pacjentów, którzy przebyli stadium grypopodobne. Najczęstszą i zarazem najlżejszą postać kliniczną stanowi zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, występujące w 60% przypadków. Zapalenie mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych rozpoznaje się u 30% chorych, a zapalenie mózgu, rdzenia i opon mózgowo-rdzeniowych, które stanowi najcięższą postać - u 10%. Wszyscy chorzy podlegają hospitalizacji, zgłoszeniu i rejestracji. W związku z tym, że obraz kliniczny oraz wyniki podstawowych badań laboratoryjnych są niespecyficzne, rozpoznanie należy potwierdzić za pomocą badań wirusologicznych. Najczęściej wykorzystuje się badania serologiczne, w tym techniki immunoenzymatyczne (ELISA), pozwalające na wykrycie swoistych przeciwciał w klasie IgG i IgM. Możliwe jest także stosowanie metody PCR do wykrywania specyficznych sekwencji RNA wirusa w płynie mózgowo-rdzeniowym lub surowicy krwi. 3

4 Wirusy DNA zawierające dwuniciowe DNA (ds DNA) Poxviridae wirus krowianki wirus ospy prawdziwej Herpesviridae wirus opryszczki zwykłej typu 1 (HHV-1) wirus opryszczki zwykłej typu 2 (HHV-2) wirus ospy wietrznej i półpaśca (HHV-3) cytomegalowirus (HHV-5) ludzki herpeswirus typu 6 (HHV-6) (rumień nagły) wirus Epsteina-Barr (HHV-4) (mononukleoza zakaźna) wirus mięsaka Kaposiego (HHV-8) Adenoviridae adenowirusy człowieka (51 serotypów) (przeziębienia, zapalenia oskrzeli i płuc, biegunki, zapalenie spojówek) Polyomaviridae wirus BK (krwotoczne zapalenie pęcherza u chorych poddanych immunosupresji) wirus JC (postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia) Papillomaviridae ludzkie wirusy brodawczaka (HPV): ponad 100 serotypów Wirusy DNA zawierające jednoniciowe DNA (ssdna) Parvoviridae parwowirus B19 (rumień zakaźny) Wirusy z dwuniciowym DNA kodujące odwrotną transkryptazę (dsdna RT) Hepadnaviridae wirus zapalenia wątroby typu B (wzw B) Wirusy z jednoniciowym RNA kodujące odwrotną transkryptazę (ssrna RT) Retroviridae (HTLV-1): ludzkie wirusy T-limfotropowe (HTLV) ludzki wirus upośledzenia odporności typu 1 (HIV-1) ludzki wirus upośledzenia odporności typu 2 (HIV-2) Wirusy RNA zawierające dwuniciowe RNA (dsrna) Reoviridae Rotawirusy A-C (biegunki) Wirusy RNA zawierające RNA o ujemnej polarności [(-)ssrna] 4

5 Rhabdoviridae wirus wścieklizny Filoviridae wirus Marburg (gorączka krwotoczna) wirus Ebola (gorączka krwotoczna) Paramyxoviridae wirusy parainfluenzy, typy 1-4 (przeziębienia, zapalenie oskrzeli i pluc, zapalenie wsierdzia) wirus odry wirus świnki syncytialny wirus oddechowy (RSV) (zapalenie płuc u dzieci) Orthomyxoviridae wirus grypy A wirus grypy B Wirusy RNA zawierające RNA o dodatniej polarności [(+)ssrna] Picornaviridae poliowirusy, typy 1-3 enterowirusy człowieka: echowirusy, wirusy Coxsackie A, wirusy Coxsackie B (herpangina, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie wsierdzia, zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie mięśni szkieletowych) rinowirusy (katar, przeziębienia) wirus zapalenia wątroby typu A (HAV) Caliciviridae Norowirusy (biegunki) Coronaviridae wirus zakaźnego zapalenia żołądka i jelit koronawirus ostrego zespołu oddechowego (wirus SARS) Flaviviridae wirus kleszczowego zapalenia mózgu wirus dengi wirus gorączki zachodniego Nilu wirus żółtej gorączki wirus zapalenia wątroby typu C Togaviridae wirus różyczki 5