Serologiczne i molekularne metody stosowane w diagnostyce chorób zakażnych

Transkrypt

1 Serologiczne i molekularne metody stosowane w diagnostyce chorób zakażnych Dorota Wultańska Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny

2 Antygen Antygenami nazywamy złożone cząsteczki (substancje) rozpoznawane przez organizm immunologicznie kompetentny jako obce. Charakterystyczne cechy antygenów to: 1. Immunogenność- zdolność wywoływania odpowiedzi immunologicznej. 2. Swoistość- właściwość swoistego reagowania z przeciwciałami lub uczulonymi komórkami. Antygeny: białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, związki chemiczne np. formaldehyd, antybiotyki np. penicylina.

3 Przeciwciała Przeciwciałami albo immunoglobulinami nazywamy cząsteczki białkowe syntetyzowane po pobudzeniu antygenem wytwarzane przez komórki plazmatyczne (aktywowane limfocyty B) i skierowane swoiście przeciwko temu antygenowi. Immunoglobuliny: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

4 Budowa przeciwciała

5 Immunoglobuliny człowieka dzieli się na 5 klas oznaczonych symbolami: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Ig są zbudowane z 4 łańcuchów białkowych: 2 łańcuchów ciężkich H i 2 łańcuchów lekkich L. Rozczepiając cząsteczkę Ig za pomocą enzymu papainy w obecności cysteiny uzyskuje się trzy fragmenty, dwa fragmenty Fab i jeden fragment Fc.

6 Fragment Fab- jest częścią zmienną Ig mającą zdolność wiązania antygenu i warunkującą swoistość immunologiczną przeciwciała

7 FragmentFc- fragment stały dla danej klasy Ig, bierze udział w wiązaniu się z receptorami pewnych limfocytów i makrofagów, odgrywa rolę w wiązaniu i aktywacji układu dopełniacza. Immunoglobulina IgA występuje w postaci monomeru, dimeru bądź polimerów. IgM występuje w postaci pentameru. Pozostałe Ig występują w postaci monomeru.

8 IgM- jest pentamerem, występuje w surowicy, nie przechodzi przez łożysko, jej obecność u płodu świadczy o zakażeniu. IgM powstaje jako pierwsza w odpowiedzi na zakażenie. Nie mają zdolności przenikania przez naczynia krwionośne, nie odgrywają więc większej roli w obronie tkanek przed zakażeniem. Są szczególnie aktywne w procesie aglutynacji, opsonizacji i wiązania dopełniacza.

9 IgG- z łatwością przechodzi przez łożysko. IgG bierze udział w opsonizacji antygenów np. mikroorganizmów ułatwiając w ten sposób fagocytozę. Posiadają zdolność aglutynacji, precypitacji, wiązania dopełniacza i neutralizacji wirusów. IgG jest główną Ig powstającą we wtórnej odpowiedzi immunologicznej na antygen czy po szczepieniu.

10 Odpowiedź immunologiczna-(odpowiedź odpornościowa) Jest to złożony zespół reakcji obronnych organizmu zarówno swoistych jak i nieswoistych, zapoczątkowany kontaktem z antygenem. Głównymi komórkami, które uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej są limfocyty, makrofagi i granulocyty. Współdziałają one również z innymi komórkami układu odpornościowego. Odpowiedź immunologiczna jest procesem dwufazowym, na który składa się: - faza rozpoznania antygenu (swój czy obcy) - faza efektorowa obejmująca cykl reakcji zmierzających do neutralizacji i eliminacji obcego antygenu

11 Odporność przeciwzakaźną organizmu można podzielić na dwa rodzaje: 1. Odporność fizjologiczną (naturalną, nieswoistą, związaną z pewnymi właściwościami ustroju, które utrudniają wniknięcie drobnoustrojów do organizmu i ich namnożenie). 2. Odporność swoistą. U podstaw odporności swoistej leżą swoiste reakcje antygenu z Ig lub odpowiednimi komórkami układu immunologicznego.

12 Odporność nieswoista Mechanizmy odporności nieswoistej odgrywają ważną rolę w początkowej obronie gospodarza przed zakażeniem. Można je podzielić na: 1. Mechanizmy miejscowe - ciągłość skóry i błon śluzowych - kwas mlekowy i kwasy tłuszczowe znajdujące się w wydzielinie gruczołów potowych i łojowych, działających niekorzystnie na większość bakterii patogennych - lizozym we łzach, ślinie, pocie i innych wydzielinach uszkadza ścianę komórkową głównie bakterii Gram(+) - spłukiwanie śluzem błon śluzowych - ciągły przepływ śliny zawierającej substancje bakteriobójcze( między innymi lizozym) - odruchy obronne: kaszel, kichanie, ruch rzęsek nabłonka, wymioty, skurcze jelit, strumień moczu - kwas żołądkowy o ph 1-2, enzymy proteolityczne - działanie antagonistyczne flory fizjologicznej przewodu pokarmowego czy flory fizjologicznej skóry - laktoferyna występująca we łzach, mleku, ślinie wiążąca Fe, które potrzebne jest do wzrostu bakteriom

13 2. Mechanizmy układowe - produkcja cytokin, w tym i interferonów. Cytokiny wydzielane są głównie przez komórki układu immunologicznego i powodują aktywację tych komórek. Interferony hamują replikację, czyli namnażanie się wirusów.

14 Odczyny serologiczne Odczyny serologiczne są to metody, za pomocą których można wykazać obecność i stężenie Ig w surowicy, płynie mózgowo-rdzeniowym i innych płynach tkankowych bądź też wykryć antygen (bakterie, wirusy, grzyby, pierwotniaki) przy użyciu znanej surowicy odpornościowej.

15 Aglutynacja Reakcja zachodząca pomiędzy Ig a antygenem w formie komórkowej (bakterie, drożdże, erytrocyty, leukocyty itp.). Polega ona na zlepianiu się komórek pod wpływem swoistych Ig i wypadaniu ich z roztworu pod wpływem elektrolitów. Precypitacja Reakcja zachodząca pomiędzy Ig i rozpuszczalnym antygenem przejawiająca się powstawaniem strątów.

16 ODCZYNY AGLUTYNACYJNE W MIKROBIOLOGII odczyn Widala (dur brzuszny) odczyn Weila-Felixa (dur plamisty) odczyn Wrighta (bruceloza) odczyn aglutynacji lateksowej (rotawirusy) odczyn hemaglutynacji (TPHA kiła) odczyn zahamowania hemaglutynacji (grypa) odczyn antyglobulinowy Coombsa (listerioza)

17 Pobieranie materiałów do badań serologicznych Surowica - do badania serologicznego pobiera się krew żylną na czczo, najczęściej z żyły łokciowej z zachowaniem wszelkich zasad aseptyki przy użyciu jałowej suchej strzykawki. Od dorosłych pobiera się 5-10 ml, od dzieci 2-5 ml, aby można było uzyskać 1-2 ml surowicy. Krew należy przelać do jałowej suchej probówki i zamknąć jałowym gumowym korkiem. W celu uzyskania surowicy próbki z krwią należy wstawić do cieplarki w temp. 37 C na minut do czasu powstania skrzepu. Surowicę najłatwiej oddzielić od skrzepu zlewając ją ostrożnie do nowej jałowej probówki lub odciągając jałową pipetą. Jeżeli przy zlewaniu surowicy lub odciąganiu dostanie się do niej nawet niewielka ilość czerwonych krwinek, surowicę należy odwirować i ponownie odciągnąć. Wirować należy przy obrotach obr/minutę.

18 Surowice parzyste Wykrycie Ig w surowicy krwi chorego może świadczyć zarówno o aktualnym, jak i przebytym zakażeniu wirusowym. Dlatego do serologicznego potwierdzenia rozpoznania niezbędne jest stwierdzenie zwiększania się ilości Ig w trakcie rozwoju choroby. Aby móc śledzić dynamikę narastania Ig, od chorego pobiera się dwie próbki - pierwszą w ostrym okresie choroby, drugą po dniach. Są to tzw. surowice parzyste. Stwierdzenie 4-krotnego lub większego wzrostu miana Ig w przeciągu dwóch tygodni stanowi dowód aktualnie toczącego się procesu chorobowego.

19 Płyn mózgowo-rdzeniowy Przy neuroinfekcji do badań w kierunku ściśle określonego zakażenia wystarczy 0,5-1 ml płynu m-r pobranego z nakłucia lędźwiowego. Materiał powinien być pobrany jałowo do wyjałowionych probówek. Miano Ig w płynie m-r nie spada, jeżeli próbka ulega zamrożeniu. Wykrywanie Ig w płynie m-r dotyczy przede wszystkim przypadków o etiologii wirusowej.

20 Metody serologiczne, w których za pomocą wzorcowych znakowanych Ig wykrywa się antygeny wirusowe bądź bakteryjne Zależnie od klinicznego obrazu choroby do badań pobiera się różne materiały. Enterowirusy, takie jak poliowirus, znacznie łatwiej jest izolować z kału (wrotami zakażenia enterowirusów jest układ pokarmowy) niż płyn m-r. Materiał musi być pobrany do jałowych naczyń. Do próbek nie wolno dodawać żadnych środków konserwujących. Do tych próbek, w których wirus narażony jest na wysychanie, a ponadto występuje flora bakteryjna (np. wymazy z gardła, nosa, odbytu, kał) dodaje się zbuforowany roztwór soli fizjologicznej z antybiotykami hamującymi wzrost innych niepożądanych drobnoustrojów. Każda próbka musi być wyraźnie i trwale oznakowana: data i godzina pobrania, imię i nazwisko itd.

21 Zalety metod serologicznych Metody serologiczne są szczególnie przydatne w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez drobnoustroje trudne lub niemożliwe do izolowania i hodowli w laboratorium diagnostycznym. Np. wirusy (np. HBV, HIV), pałeczki tularemii, mykoplazmy, legionelle, riketsje.

22 Test ELISA

23 Wykrywanie antygenów Precypitacja Metody precypitacyjne w mikrobiologii: 1) Test Eleka (diagnostyka błonicy)- pozwala na wykrycie zjadliwości Corynebacterium diphtheriae poprzez sprawdzenie obecności toksyny bakteryjnej 2) testy kłaczkujące VDRL oraz USR (nieswoiste odczyny kiłowe) Kardiolipina (wyciąg z serca wołu) zawiera chlorek choliny, który unieczynnia dopełniacz. Odczyn można wykonać na szkiełku podstawowym dodając kroplę surowicy pobranej od pacjenta do kropli odczynnika. Jeżeli na szkiełku następuje wykłaczanie, świadczy to o występowaniu Ig (reagin) kiłowych.

24 Odczyn wiązania dopełniacza: Wykrywanie antygenów Stosowany w wykrywaniu chorób o różnej etiologii wirusowej (np. w zakażeniach wirusami: parainfluenzy, HSV, CMV, adenowirusami, RSV, odry, różyczki, enterowirusami i innymi). Badaną surowicę inkubuje się z wzorcowym antygenem i określoną ilością dopełniacza. Swoiste Ig, jeśli występują w badanej próbce tworzą kompleks z antygenem i dopełniaczem. Wolny (nie związany dopełniacz) wykrywany jest przez dodanie erytrocytów uczulonych przeciwciałami. Jeżeli dopełniacz nie jest związany dochodzi do lizy erytrocytów (wynik ujemny). Jeżeli dopełniacz został związany przez kompleks antygen wirusowy i przeciwciało pacjenta erytrocyty nie ulegają lizie (wynik dodatni) OWD wykorzystywany w diagnostyce: chorób bakteryjnych- kiła, bruceloza, tularemia, listerioza, chorób wirusowych- grypa, polio, KZM chorób grzybiczychkandydoza

25 Hemaglutynacja - bierna - odczyn TPHA (w diagnostyce kiły) Krwinki baranie opłaszczone są szczepem chorobotwórczym T.pallidum. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy czy płynu mózgowo-rdzeniowego i dodaje do zawiesiny krwinek baranich. Miana 1:80 dla surowicy i 1:40 dla płynu mózgowo-rdzeniowego potwierdzają zakażenie.

26 Wykrywanie przeciwciał ASO-odczyn antystreptolizynowy- pomiar stężenia przeciwciał przeciwko antystreptolizynie O. Przeciwciała te powstają po kontakcie z paciorkowcami grupy A. Lekarz zleca badanie ASO, by potwierdzić lub wykluczyć powikłania po infekcji streptokokowej. Do takich powikłań należeć mogą: bakteryjne zapalenie wsierdzia, kłębuszkowe zapalenie nerek, gorączka reumatyczna.

27 Immunofluorescencja Jest to metoda, w której za pomocą Ig wyznakowanych fluoresceiną (izotiocyjanian fluoresceiny) możemy wykryć antygeny wirusowe, bakteryjne lub specyficzne Ig. Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym. W mikroskopie fluorescencyjnym barwnik emituje zielone światło. Metody immunofluorescencyjne mogą być stosowane do identyfikacji antygenu wirusowego w materiale klinicznym np. wirusa RSV, w popłuczynach z gardła, lub np. wykryć bakterie Legionella pneumophila, Bordetella pertussis w materiałach pochodzących z dróg oddechowych czy Chlamydia trachomatis w materiałach z dróg moczowo-płciowych i ze spojówek.

28 Metody hybrydyzacji -wykrywanie wirusów HPV, HSV -wykrywanie zakażeń chlamydią i rzeżączką Sondy genetyczne wyznakowany odcinek nici DNA do poszukiwania komplementarnej nici DNA

29 Test Western blotting Białka wirusa rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym. Z żelu antygeny są przeniesione (blotting) na błonę nitrocelulozową, z którą się silnie wiążą. Paski nitrocelulozowe są inkubowane z surowicą pacjenta. Jeżeli w surowicy występowały Ig swoiste wobec wyznakowanych antygenów, to nastąpi ich połączenie. Następnie uwidacznia się związane przeciwciała, poprzez dodanie znakowanych antyimmunoglobulin (wyznakowanych enzymem, a kolejno substrat reakcji enzymatycznej). Ocenia się występowanie zabarwionych pasm przez porównanie z pasmami wzorcowymi. Występowanie pasm świadczy o występowaniu swoistych Ig. Metoda Western-blotting jest bardzo czuła i swoista, używa ją się między innymi do potwierdzenia wyników dodatnich badań zakażenia wirusem HIV.

30 Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) Wynaleziona w 1983 roku przez Kary ego Mullisa (Nagroda Nobla w 1993) Polega na powielaniu określonych fragmentów DNA Etapy PCR: 1) przygotowanie próbki (izolacja) 2) oczyszczenie DNA, 3) amplifikacja DNA 4) wizualizacja produktu (np. za pomocą elektroforezy żelowej lub hybrydyzacji ze znakowanymi sondami)

31 Przykłady metod molekularnych w diagnostyce mikrobiologicznej PCR -(polymerase chain reaction)-polimerazowa reakcja łańcuchowa zastosowanie: wykrywanie wirusów HIV, CMV, HBV, HPV, HCV, wykrywanie oporności szczepów bakteryjnych na antybiotyki (oporność gronkowców na metycylinę, oporność enterokoków na wankomycynę) zastosowanie metody PCR w diagnostyce Chlamydii i Mykoplazm.

32 Zastosowanie PCR w mikrobiologii 1. Wykrycie oraz identyfikacja patogenu w dowolnym materiale klinicznym 2. Identyfikacja patogenów trudnych w hodowli, niemożliwych do hodowania, wolnorosnących 3. Wykrywanie genów oporności na leki 4. Wykrywanie genów czynników zjadliwości

33 Typowanie mikroorganizmów w oparciu o sekwencje kwasów nukleinowych 1. Metody typowania oparte na analizie sekwencji kwasów nukleinowych umożliwiają wyznaczenie pokrewieństwa filogenetycznego mikroorganizmów oraz analizę epidemiologiczną 2. Najczęściej stosowane metody genotypowania: rybotypowanie, analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA z elektroforezą pulsacyjną (RFLP- PFGE), analiza restrykcyjna powielonego rybosomalnego DNA (ARDRA),różne odmiany techniki PCR (fingerprinting)

34 Rybotypowanie Elektroforetyczny rozdział produktów uzyskanych po amplifikacji DNA izolowanego ze szczepów C. difficile, wyhodowanych z materiałów od dzieci hospitalizowanych na oddziale patologii noworodków ze starterami P3 i P Ścieżki: 1 - P 45/04, 2 - P 89/04, 3 - P 287/04, 4 - P 133/05, 5 - P 173/05, 6 - P 272/05, 7 - P 287/05, 8 - P 54/06, 9 - P 203/06.

35 PFGE- pulsed-field gel electrophoresis 1.Trawienie w żelu całogenomowego DNA enzymami rzadko tnącymi (np. SmaI) 2. Długotrwały rozdział elektroforetyczny produktów restrykcji w zmiennym polu elektrycznym 3. Najbardziej miarodajna metoda typowania wewnątrzgatunkowego szczepów 4. Pracochłonna i wymagająca stosownej aparatury

36 Dziękuję za uwagę