MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 89-94 Alicja Sobolewska, Maria Waloch, Tadeusz H. Dzbeński Przydatność odczynu immunofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych w diagnostyce przypadków pneumocystozowego zapalenia płuc Zakład Parazytologii Lekarskiej Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny Kierownik: prof. dr hab. T. H. Dzbeński Wykazano większą przydatność diagnostyczną metody OIF przy użyciu przeciwciał monoklonalnych do wykrywania inwazji Pneumocystis jirovecii u osób z obniżoną odpornością i śródmiąższowym zapaleniem płuc w stosunku do rutynowych badań serologicznych. Wtórne niedobory odpornościowe, szczególnie takie, które przebiegają z niedoborem limfocytów T, sprzyjają powstawaniu zakażeń układu oddechowego, w tym infekcji wywoływanych przez Pneumocystis jirovecii. Niedobory sprzyjające rozwojowi pneumocystozy występują głównie w przebiegu chorób nowotworowych, w następstwie przedłużonego podawania środków immunosupresyjnych oraz u osób zakażonych wirusem HIV (9, 4). Pneumocystoza (PCP) należy do chorób o mało charakterystycznym obrazie klinicznym, w którym dominują objawy śródmiąższowgo zapalenia płuc. W postępowaniu różnicującym etiologię śródmiąższowych zapaleń płuc, zwłaszcza w przypadkach nie poddających się antybiotykoterapii oraz u osób z obniżoną odpornością, powinno uwzględniać się badania laboratoryjne w kierunku pneumocystozy. Rutynowa, laboratoryjna diagnostyka pneumocystozy polega na poszukiwaniu swoistych przeciwciał w surowicy krwi pacjenta, zwłaszcza przeciwciał klasy M (5, 7). Jednak u osób z upośledzoną czynnością układu odpornościowego, poziom swoistych przeciwciał bywa na ogół niski lub nieoznaczalny, co utrudnia postawienie prawidłowej diagnozy. Niestety, proponowane ostatnio metody biologii molekularnej polegające na wykrywaniu DNA tj. konwencjonalny PCR, czy nested PCR, są w przypadku patogenów oportunistycznych także mało przydatne, ponieważ z powodu dużej czułości dają dodatnie wyniki również u osób będących bezobjawowymi nosicielami (1, 8). Dla wspomnianej grupy pacjentów opracowano metodę wykrywania Pneumocystis w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych lub wymuszonej plwocinie odczynem immunofluorescencji, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (3). Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej metody immunofluorescencyjnego badania popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych z rutynowym badaniem serologicznym wykonanym u pacjentów z obniżoną odpornością i objawami śródmiąższowego zapalenia płuc.
90 A. Sobolewska Nr 1 MATERIAŁ I METODY Materiał do badań pochodził od 3 grup pacjentów w wieku 20-35 lat. Pierwszą grupę stanowiło 20 pacjentów zakażonych wirusem HIV z objawami śródmiąższowego zapalenia płuc. W drugiej grupie umieszczono 20 pacjentów z nowotworami krwi i objawami śródmiąższowego zapalenia płuc, u których stosowano środki immunosupresyjne. Trzecia grupa obejmowała 20 osób immunokompetentnych, z infekcyjnymi chorobami płuc nie poddającymi się leczeniu antybiotykami lub z podejrzeniem nowotworu. Grupę tę potraktowano jako kontrolną. Zbadano łącznie 60 próbek surowicy krwi oraz 58 próbek popłuczyn oskrzelowo- -pęcherzykowych i 2 próbki wymuszonej plwociny. Próbki plwociny pochodziły od pacjentów u których ze względu na ciężki stan ogólny istniały przeciwwskazania do wykonania bronchoskopii. U wszystkich pacjentów poszukiwano w surowicy krwi swoistych przeciwciał klasy IgG i IgM skierowanych przeciwko antygenom Pneumocystis jirovecii, wykorzystując metodę immunofluorescencji pośredniej, opracowaną przez Nowosławskiego i Brzosko (5). Analizę przeprowadzono na szkiełkach mikroskopowych ze skrawkami antygenu Pneumocystis jirovecii w płucu ludzkim, o grubości 4 µm, zatopionymi w parafinie. W początkowym etapie wykonano odparafinowanie szkiełek z antygenem poprzez umieszczenie ich w 2 zmianach ksylenu (po 10 min) oraz przeprowadzenie przez szereg roztworów alkoholi etylowych, począwszy od alkoholu 96% (2 zmiany po 5 min), poprzez alkohol 70% (5 min) i 50% (5 min), a następnie płukanie w 0,8% NaCl buforowanym fosforanami (PBS) do ph=7,6 (3 x 10min). W międzyczasie przygotowano surowice badane jak i kontrolne (surowica dodatnia, surowica słabo dodatnia, surowica ujemna), sporządzając ich rozcieńczenia 1:10. Następnie, tak przygotowane surowice nakraplano na odparafinowany, wypłukany antygen Pneumocystis i inkubowano w wilgotnej komorze przez 45 minut w temp. 18-25 C. Po upływie tego czasu ponownie preparaty płukano w 0,8% NaCl, zmieniając PBS trzykrotnie w przeciągu 30 minut. Na szkiełka osuszone z nadmiaru PBS, nakraplano koniugaty kozie surowice odpornościowe przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgG oraz IgM znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) - w stężeniu roboczym (anty-igg 1:150, anty-igm 1:30) na odpowiednie miejsca antygenowe i inkubowano w komorze wilgotnej przez 45 minut. Następnie spłukiwano szkiełka PBS, zanurzano na 1-2 sek w acetonie, po czym płukano ponownie w PBS przez 30 minut. Na osuszone z nadmiaru PBS preparaty nakraplano 0,1% para-fenylodwuaminę, zamykano szkiełkami nakrywkowymi i oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym. Odczytywanie wyników rozpoczynano od oceny świecenia kontroli dodatniej, słabo dodatniej i ujemnej. Za wynik dodatni przyjmowano zielonkawo-żółtą fluorescencję ognisk pasożyta. Reakcję uważano za ujemną wtedy, gdy ogniska wykazywały wyłącznie świecenie o odcieniu czerwonym. Do wykrywania Pneumocystis w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) oraz wymuszonej plwocinie zastosowano metodę immunofluorescencyjną (OIF) przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych 3F6 specyficznych dla ludzkiego Pneumocystis wykorzystując zestaw odczynników MONOFLUO KIT P. jirovecii firmy Bio-Rad. Próbki przeznaczone do badania wirowano przez 15 minut przy 3000 x g (próbkę plwociny uprzednio upłynniano za pomocy środka mukolitycznego-0,1% ditiotreitolu), a następnie uzyskany osad 2-krotnie przepłukiwano wodą dejonizowaną. Przepłukany osad
Nr 1 Diagnostyka pneumocystowego zapalenia płuc 91 zawieszano w 1ml PBS i nanoszono w objętości 10 µl i 20 µl do dołków na szkiełku podstawowym, a następnie suszono w temp. 37 C. Na wysuszone i utrwalone w bezwodnym acetonie preparaty nanoszono po 20 µl odpowiednio rozcieńczonego (1:10) enzymu (10% trypsyna), pokrywając dokładnie całą powierzchnię dołka i inkubowano przez 30 minut w komorze wilgotnej w temp. 37 C. Po przepłukaniu w wodzie dejonizowanej i wysuszeniu, nakraplano na każdą próbkę 15 µl mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko Pneumocystis jirovecii. Po 15 minutowej inkubacji z przeciwciałami, preparat ponownie przepłukano strumieniem wody dejonizowanej i nanoszono 15 µl koniugatu tj. przeciwciał przeciwko mysim immunoglobulinom, znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Preparaty inkubowano przez 15 minut w komorze wilgotnej w temp. 37 C, następnie płukano, suszono, nanoszono podłoże do zatapiania (glicerol zbuforowany fosforanem) i przykrywano szkiełkiem nakrywkowym, po czym oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym. Za wynik dodatni przyjmowano taki obraz, gdy na całej powierzchni dołka wykryto pięć lub więcej jasno-zielono fluoryzujących cyst, za wątpliwy, jeżeli wykryto w preparacie 1 do 5 fluoryzujących cyst, natomiast za wynik ujemny przyjmowano, jeżeli było brak fluoryzujących cyst. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W grupie pacjentów zakażonych wirusem HIV, stwierdzono obecność swoistych przeciwciał zarówno klas G jak i M u 2 na 20 zbadanych tj. u 10%, natomiast w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych tych pacjentów wykazano Pneumocystis u 3 osób, tj. u 15% zbadanych. W próbkach plwociny nie stwierdzono obecności Pneumocystis. Ryc.1. Wyniki badań surowic i BAL w kierunki inwazji Pneumocystis jirovecii u osób z wtórnym niedoborem odporności i objawami śródmiąższowego zapalenia płuc.
92 A. Sobolewska Nr 1 W drugiej grupie osób z chorobami nowotworowymi tylko u 1 pacjenta (5% badanych) wykryto przeciwciała pneumocystozowe klasy G jak i M, ale obecność pasożyta w próbkach BAL wykryto aż u 5 osób, tj. u 25% badanych. W trzeciej grupie chorych nie stwierdzono przypadku występowania przeciwciał klasy M, natomiast metodą analizowania próbek BAL wykryto pasożyta u 1 osoby tj. u 5% badanych (Ryc.1). Analizując wyniki badań laboratoryjnych w kierunku pneumocystozy, jakie przeprowadzono u osób podejrzanych o tę infekcję na podstawie badań klinicznych i przynależności do grupy podwyższonego ryzyka, należy stwierdzić, że metoda wykrywania swoistych przeciwciał klasy M ma ograniczoną przydatność diagnostyczną, ponieważ potwierdza podejrzenie pneumocystozy zaledwie u 1 pacjenta na 13 badanych. Wynik nie jest zaskakujący wziąwszy pod uwagę fakt, że Pneumocystis jest bardzo szeroko rozpowszechniony w populacji ludzkiej, co ogranicza w znacznym stopniu możliwość wykrycia u osób dorosłych infekcji pierwotnej, stymulującej syntezę swoistych IgM. Przydatność metody wykorzystującej przeciwciała monoklonalne do badania popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych okazała się znacznie większa, potwierdzając podejrzenie pneumocystozy u 1 osoby na każde 5 badanych. DYSKUSJA Mimo znacznego postępu, jaki dokonano w laboratoryjnym rozpoznawaniu pneumocystozy wprowadzając nowe metody diagnostyczne polegające na wykrywaniu DNA pasożyta za pomocą technik z zakresu biologii molekularnej, wciąż brakuje metody bezpiecznej dla chorego, a równocześnie dostarczającej jednoznacznej informacji diagnostycznej. Ze względu na wysokie ryzyko powikłań pozabiegowych, unika się obecnie biopsji diagnostycznych, ograniczając procedurę pozyskiwania materiału do mniej inwazyjnego zabiegu bronchoskopii, umożliwiającego zbieranie popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych oraz do pobierania próbek krwi na badania serologiczne polegające na poszukiwaniu swoistych przeciwciał. Pobieranie krwi jest najmniej inwazyjną metodą pozyskiwania materiału do badań w kierunku pneumocystozy. Badania serologiczne uzyskanych próbek mają jednak dużą wadę, ponieważ oferują obecnie niewielkie szanse na potwierdzenie klinicznych podejrzeń PCP. Stwierdzenie swoistych przeciwciał klasy G i M świadczy o aktywnej inwazji. Niestety znamienne diagnostycznie przeciwciała klasy M wykrywa się u niewielkiego odsetka badanych w czasie infekcji pierwotnych i nie występują w czasie nawrotów. Sobolewska i Dzbeński (6) wykazali obecność przeciwciał klasy M zaledwie u 4,6% spośród 8810 badanych próbek. Obecność samych przeciwciał klasy G przemawia za odleglejszym kontaktem z antygenem pasożyta, gdyż utrzymują się przez dłuższy czas w krążeniu zakażonej osoby. Należy wziąć pod uwagę, że u pacjentów z upośledzoną czynnością układu odpornościowego i pneumocystozowym zapaleniem płuc, poziom przeciwciał bywa na ogół niski lub nieoznaczalny, zwłaszcza w przypadkach rozwiniętego zespołu AIDS. Dzięki zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych dokonano bardzo istotnego postępu w diagnostyce laboratoryjnej pneumocystozy podnosząc czułość i swoistość reakcji fluorescencji. Metoda ta może być szczególnie przydatna dla grupy pacjentów z obniżoną odpornością, u których oznaczenie miana przeciwciał często bywa trudne. W badanym
Nr 1 Diagnostyka pneumocystowego zapalenia płuc 93 materiale (popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe lub wymuszona plwocina) poszukuje się cyst i trofozoitów, oraz określa ich liczbę. Przy wykorzystaniu tej metody za wynik dodatni przyjmuje się preparaty wykazujące co najmniej 5 cyst w badanym preparacie. Wobec tego można wnioskować, że wynik dodatni przy zastosowaniu tej metody, w dużym stopniu stanowi potwierdzenie rozpoznania pneumocystozy i pozwala odróżnić infekcję od nosicielstwa, niemniej jednak i ta metoda ma pewne ograniczenia. Przeciwciała monoklonalne charakteryzują się reaktywnością w stosunku do pojedynczej determinanty antygenowej na powierzchni pasożyta. Niekiedy może dojść do zamaskowania jej przez inne sąsiadujące determinanty, co uniemożliwi rozpoznanie obecności patogenu (6). Pomimo, iż stosując tę metodę wykazano większą wykrywalności przypadków pneumocystozy w stosunku do metody serologicznej OIF, metoda ta nie spełnia całkowicie oczekiwań, zwłaszcza podczas badania zakażonych wirusem HIV, u których odsetek laboratoryjnych potwierdzeń PCP powinien być zdecydowanie wyższy. Prawdopodobną przyczyną omówionej sytuacji było pobieranie popłuczyn do badań diagnostycznych w trakcie rozpoczętego już leczenia swoistego, co zmniejsza w sposób istotny szanse wykrycia form rozwojowych Pneumocystis. Podejmowanie leczenia pneumocystozy przed zaplanowanymi badaniami laboratoryjnymi może przyczynić się do popełnienia błędu w postępowaniu diagnostycznym. Interpretacja wyników dodatnich uzyskanych przez stosowanie metody konwencjonalnego PCR oraz nested PCR, wymaga dużej ostrożności. Weig i wsp. (10) wykazali daleko idącą korelację między dodatnim wynikiem PCR a klinicznym rozpoznaniem PCP u pacjentów z AIDS, natomiast w grupie pacjentów z obniżoną odpornością bez AIDS uzyskano 82% wyników fałszywie dodatnich. Alternatywną metodą pozwalającą udoskonalić diagnostykę pneumocystozy wydaje się być opracowanie techniki Real-Time PCR. Pozwoliło by to, nie tylko określić obecność DNA poszukiwanego pasożyta, ale również specyficzność otrzymanego produktu, oraz określić liczbę kopii DNA pasożyta. Określenie progu granicznego (cut-off), umożliwiłoby odróżniać infekcję od bezobjawowego nosicielstwa (2). Przeprowadzone badania z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych będą również bardzo pomocne dla ustalenia progu granicznego. A. Sobolewska, M. Waloch, T. H. Dzbeński Usefulness of the immunofuorescence test employing monoclonal antibodies for the diagnosis of Pneumocystis pneumonia SUMMARY In spite of a considerable progress which was made in the laboratory diagnosis of pneumocytosis, a method delivering unequivocal diagnostic information is still missing. The purpose of the study was to compare diagnostic effectiveness of the fluorescent antibody method using monoclonal antibody in the examination of bronchoalveolar lavage fluid with routine serologic examination of immunocompromised patients affected by interstitial pneumonia. It was demonstrated that the method with monoclonal antibody was more useful for examining bronchoalveolar lavage samples confirming the suspicion of Pneumocystis pneumonia in 1 person among every 5 examines.
94 A. Sobolewska Nr 1 PIŚMIENNICTWO 1. Chabe M, Dei-Cas E, Creusy C, Fleurisse L, Respaldiza N, Camus D, Durand-Joly I. Immunocompetent hosts as a reservoir of Pneumocystis organisms: histological and rt-pcr data demonstrate active replication. Eur J Microbiol Infect Dis 2004; 23: 89-97. 2. Flori P, Bellete B, Durand F, Raberin H, Cazorla H, Hafid J, Lucht F, Tran Manh Sung R. Comparison between real-time PCR, conventional PCR and different staining techniques for diagnosing Pneumocystis jirovecii pneumonia from bronchoalveolar lavage specimens. J Med Microbiol 2004; 53: 603-7. 3. Kovacs JA, Gill V, Swan JG, Ognibene F, Shelhamer J, Parrillo JE, Masur H. Prospective evaluation of a monoclonal antibody in diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Lancet 1986; 2 (8497): 1-3. 4. Morris A, Lundgren JD, Masur H, Walzer PD, Hanson DL, Frederick T, Huang L, Beard ChB, Kaplan JE. Current epidemiology of Pneumocysts pneumonia. Emerg Infect Dis 2004; 10: 1710-20. 5. Nowosławski A, Brzosko W. Indirect immunofluorescence test for serodiagnosis of Pneumocystis carinii infection. Bull Acad Pol Sci 1964; 12: 143-7. 6. Sobolewska A, Dzbeński TH. Epidemiologia i diagnostyka laboratoryjna inwazji powodowanych przez Pneumocystis carinii. Przeg Epid 1997; 51: 3-9. 7. Tanabe K, Furuta T, Ueda K, Tanaka H, Shimada K. Serological observations of Pneumocystis carinii infection in humans. J Clin Microbiol 1985; 22: 1058-60. 8. Vargas SL, Ponce CA, Giglotti F, Ulloa AV, Prieto S, Muńoz M, et.al. Transmission of Pneumocysis carinii DNA from a patient with P. carinii pneumonia to immunocompetent contact health care workers. J Clin Microbiol 2000; 38: 1536-8. 9. Varthalitis I, Aoun M, Daneau D, Meunier F. Pneumocystis carinii pneumonia in patients with cancer: an increasing incidence. Cancer 1993; 71: 481. 10. Weig M, Klinker H, Wilhem M, Lemmer K, Gross U. Correlation of Pneumocystis carinii PCR with clinical diagnosis in immunocompromised patients. Lancet 1996; 347: 1266.