(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

RZECZPO SPO LITA P O LSK A (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 169952 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiei (21)Numer zgłoszenia 295727 (22) Data zgłoszenia 25.08.1992 (51) IntCl5 C12N 7/02 AB1K 39/12 (54) Sposób otrzymywania wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń (30) P ierw szeń stw o: (73) U p raw n iony z patentu: 26.08.1991,US,07/749839 Boehringer Ingelheim Animal Health Inc, 26.02.1992, US,07/841692 St Joseph, US 05.08.1992, US,07/921891 (72) T w órcy w yn alazk u : (43) Z głoszen ie ogłoszono: Danny W Chladek, St Joseph, US 17.05.1993 BUP 10/93 David E Gorcyca, St Joseph, US Louis L. Harris, St.Joseph, US (4 5) O u d zielen iu paten tu ogłoszon o: 30 09.1996 WUP 09/96 (74) P ełn om ocn ik : Bury Zofia, PATRO L Spółka z o o (57) 1 Sposób otrzymywania wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń (wirus PRRS), znamienny tym, że tkankę otrzymaną z zakazonego prosięcia czynnikiem wirusowym PRRS ATCC-VR2332, kontaktuje się z pełną albo częściową warstwą komórek małpiej linii komórkowej M A-104, komórki hoduje się w obecności surowicy w odpowiednim podłożu hodowlanym w temperaturze około 34-37 C aż do wystąpienia cytopatycznego efektu i odzyskuje się wirus. PL 169952 B1

Sposób otrzymywania wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń (wirus PRRS), znamienny tym, ze tkankę otrzymaną z zakazonego prosięcia czynnikiem wirusowym PRRS ATCC-VR2332, kontaktuje się z pełną albo częściową warstwą komórek małpiej linii komórkowej MA-104, komórki hoduje się w obecności surowicy w odpowiednim podłożu hodowlanym w temperaturze około 34-37 C aż do wystąpienia cytopatycznego efektu i odzyskuje się wirus. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się podłoże hodowlane zawierające około 10% płodowej surowicy cielęcej, a komórki AM-104 inkubuje się przez około 7 dni. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze otrzymaną tkankę homogenizuje się 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako tkankę stosuje się płuca, mózg, śledzionę, wątrobę i nerki. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze po odzyskaniu wirusa szczepi się nim nową pełną albo częściową warstwę komórek M A-104, hoduje się aż do wystąpienia cytopatycznego efektu i odzyskuje się powyższy wirus. 6. Sposób według jednego z zastrz. 1, albo 2, albo 5, znamienny tym, że hodowlę komórek MA-104 w obecności wirusa powtarza się więcej niż dwukrotnie. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób namnazania i izolacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń. Wyraźnie nowa choroba świń, powodująca ciężkie straty w stadach hodowlanych, pojawiła się ostatnio w Stanach Zjednoczonych i w niektórych regionach Kanady. Keffaber K.K, Reproductive Failure of Unknown Etiology (Niepowodzenia hodowlane o nieznanej eitologii) America Associaton of Swine Practitionere Newsletter, 1:109 (1989). Podobna choroba została także opisana w niektórych regionach Niemiec, w Holandii oraz w Zjednoczonym Królestwie i Hiszpanii Wensvoort C, i in, Blue Ear Disease of Pigs (Choroba niebieskich uszu świń) Vet.Rec., 128:574 (1991). Najważniejszym objawem klinicznym choroby jest rodzenie się nieżywych lub chorych prosiąt, przy czym niektóre prosięta wyglądają jak zdrowe ale następnie żywią się słabo albo rozwijają się w nich zaburzenia w oddychaniu, objawy ze strony ośrodkowego układu nerwowego i zdychają. W niektórych stadach dotkniętych chorobą straty osiągają75% wszystkich prosiąt. Następstwa ekonomiczne choroby są więc rujnujące. Nazwano ją tajemniczą chorobą świń, zespołem niepłodności i oddechowym świń (SIRS), chorobą niebieskich uszu i zespołem reprodukcji i oddechowym świń. SIRS jest najwyraźniej chorobą zakaźną, którą charakteryzuje niepowodzenie reprodukcji, zaburzenia oddechowe i zmienne objawy kliniczne takie jak brak łaknienia, gorączka, duszność i lekkie objawy neurologiczne. Choroba atakuje wszystkie rodzaje zakładów produkcji świń i jest być może najkosztowniejszą z chorób obecnie zagrażających przemysłowi produkcji świń. Poison D.P. i in, Financial Implications od Mystery Swine Disease (Finansowe następstwa tajemniczej choroby świń) Proceedings, Livestock Conservation Institute, Denver, CO(October 6, 1990). Zakażenie macior może przebiegać niezauważone, albo może się przejawiać gorszą ogólną kondycją przez jeden lub kilka dni. Na przykład maciory mogą nie jeść i wykazują temperaturę ciała powyżej lub poniżej prawidłowej. W okresie rodzenia objawy choroby obejmują depresję, śpiączkę, gorączkę, czasem wymioty, poronienia, rodzenie martwych i/lub zmumifikowanych płodów. Najczęstszym objawem klinicznym jest dramatyczny wzrost liczby martwo urodzonych

169 952 3 prosiąt. Liczba martwych urodzeń może sięgać 25 do 30 procent wszystkich urodzeń w zakażonym stadzie. Wiele z płodów martwo urodzonych jest zmacerowanych wskazując ze były nieżyw e od 24 do 48 godzin. Jak powiedziano wyżej, głównym składnikiem SIRS jest załamanie się reprodukcji, które przejawia się jako przedwczesne urodzenia, późne poronienia, rodzenie się słabych prosiąt, wzrost liczby martwo urodzonych, zmumifikowane płody, mniej sza liczebność porodów i opóźniony powrót do cyklu rujowego. Te objawy kliniczne obserwuje się w stadzie typowo przez 4 do 16 tygodni, lub nawet dłużej. Martwo urodzone płody w zakażonym miocie często są we wczesnych stadiach mumifikacji, co widać po brunatno-brązowym przebarwieniu skóry i autolizie pośmiertnej. Czasem obserwuje się kopulaste zniekształcenie czaszki płodów. Kliniczne objawy choroby oddechowej są wyrażone najbardziej u prosiąt poniżej 3 tygodnia życia, ale w zakażonych stadach opisano je u prosiąt w każdym wieku. Chore prosięta rosną wolno mają szorstką szczecinę, trudności oddechowe ( ciężki oddech ) i wykazują wyższą śmiertelność (do około 80 procent śmiertelności przed odstawieniem od ssania). Wyniki wstępnych badań zmian makro- i mikroskopowych u świń chorych na SIRS sugerują, że zmiany mikroskopowe w płucach są ważnym objawem klinicznym tej choroby. Mimo wyraźnych objawów oddechowych, płuca bez powikłania następowym zakażeniem bakteryjnym są albo makroskopowo prawidłowe albo wykazują delikatne, rozproszone przebarwienie brunatno-szare powierzchni. Jednak badanie mikroskopowe tkanki płucnej prosiąt chorych na SIRS wykazuje charakterystyczny obraz zapalenia śródmiąższowego Colins J.E. i in. Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome (Choroba oddechowa w stadzie świń dotkniętym zespołem niepowodzenia reprodukcji) Proceedings, Minnesota Swine Conference for Veterinarians, str. 254, St.Paul, MN (September 10-18 1990). SIRS albo tajemnicza choroba świń występuje szeroko w Stanach Zjednoczonych, doniesiono o niej z co najmniej 11 stanów Jak doniesiono w literaturze, wśród badanych pierwotnych czynników przyczynowych są wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (encephalomyocarditis - EMC), wirus grupy świń (SIV), mykotoksyny i chlamydie. Zadaniem wynalazku jest opracowanie sposobu namnazania i izolacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń. Homogenat tkankowy otrzymany z prosiąt w stadach zakażonych SIRS, podany donosowo gnotobiotycznym prosiętom i ciężarnym maciorom, stale odtwarzał oddechowe i reprodukcyjne postacie SIRS. Prosięta gnotobiotyczne, którym w ten sposób podano inokulum niesączone lub sączone (0,45, 0,22 lub 0,1 µm) traciły łaknienie i rozwijały się u nich mikroskopowe zmiany w płucach podobne do obserwowanych w stadach zakażonych SIRS. To samo inkulum wywoływało także efekty reprodukcyjne identyczne z tymi, które są obserwowane w stadach zakażonych SIRS. Z homogenatu tkankowego uzyskano czynnik wirusowy. Ten czynnik wirusowy powoduje chorobę, która naśladuje SIRS u prosiąt i ciężarnych macior. Czynnik wirusowy zdeponowano 18 lipca 1991 w American Type Culture Collection (Amerykańska Kolekcja Szczepów i Hodowli). Rockville, Maryland pod numerem ATCC-VR2332. Ten czynnik wirusowy jest wymagającym, nie hemaglutynującym wirusem RNA posiadającym otoczkę. Szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu namnazania i izolacji wirusa zespołu niepłodności i oddechowego świń ATCC-VR2332, który obejmuje zaszczepienie wirusem pełnej lub częściowej warstwy komórek małpiej linii komórkowej w obecności surowicy w odpowiednim położeniu wzrostowym, oraz inkubację zaszczepionej warstwy komórek w temperaturze około 34-37 C aż do wystąpienia cytopatycznego działania. W tym sposobie stosuje się linię komórek małpich MA 104. W sposobie tym stosuje się podłoże hodowlane zawierające około 10% płodowej surowicy cielęcej, a wymienione komórki MA-104 inkubuje się przez około 7 dni. Otrzymaną tkankę homogenizuje się, a jako tkankę stosuje się płuca, mózg, śledzionę, wątrobę i nerki. W sposobie po odzyskaniu wirusa szczepi się nim nową pełną albo częściową warstwę komórek MA-104, hoduje aż do wystąpienia cytopatycznego efektu i odzyskuje wirus. Korzystnie hodowlę wirusa MA-104 w obecności wirusa powtarza się więcej niż dwukrotnie.

4 169 952 Przykład I. Izolacja. Tkanka płuc oraz połączone tkanki mózgu- śledziony-wątroby-nerki, otrzymane z zakazonego prosięcia w stadzie zakażonym SIRS, homogenizowano oddzielnie. Poszczególne homogenaty zmieszano z modyfikowanym podłożem Eagle (MEM) zawierąjącyrn około 100 µg/ml gentamycyny. Obie próby wirowano przez około 25 minut przy około 4000 x g. Nadsącz zebrano i sączono przez filtr 0,45 mikrometra. Homogenaty płuc i tkanek połączono i połączony materiał użyto do zakażenia różnych hodowli tkanek w butelkach. Przeprowadzono dwa doświadczenia, używając butelek plastikowych 75 cm2. W doświadczeniu 1 połączony materiał zaszczepiono do dwu butelek zawierających pełną warstwę komórek jednej z podanych niżej linii komórkowych. Ponadto do jednej butelki z każdą z linii komórkowych dodano około 2,5 mg trypsyny. Wszystkie pozostałe warunki były takie same dla każdej butelki z hodowlą linii komórkowej. Podłoże hodowlane nie zawierało surowicy. Inkulum wynosiło około 1 ml. Wszystkie butelki inkubowano przez około 7 dni w temperaturze w przybliżeniu 34 C. Wyniki odczytywano pod koniec okresu około 7 dni. Po zamrożeniu i odmrożeniu pobierano próbkę do drugiego pasażu na tej samej linii komórek. Pozostały materiał zamrażano i przechowywano w około -60 C. W doświadczeniu 2 połączonym materiałem zaszczepiono butelki z tymi samymi liniami komórek jak w doświadczeniu 1. Jednak w momencie zaszczepiania warstwy komórek były pełne tylko w 20-40%. Podłoża hodowlane zawierały około 10% płodowej surowicy cielęcej. Inkulum wynosiło znów 1 ml, a hodowle inkubowano przez około 7 dni w temperaturze około 34 C. Wyniki doświadczeń 1 i 2 są podsumowane niżej: Użyta linia kom órkow a D ośw iadczenie 1 D ośw iadczenie 2 M ałżowina bydlęca (B T ) - Nerka kota (CRFK) - - Nerka małpy (Vero) - - Płuco małpy (Vero) - - Nerka psa (M DCK) - Nerka świnki (PK2a) - Płuco norki - - Płuco fretki - - Płuco bydlęce - - Płuco byka - - Nerka bydlęca (M D B K ) - - Jądro świni (ST) - - Nerka małpy (M A -104) - - Guz odbytu człow ieka (H R T -18) N T Płuco człow ieka ET - + = CPE (efekt cytopatyczny) - = brak CPE N T = nie badano Nie obserwowano efektu cytopatycznego w doświadczeniu 1 w żadnej z ocenianych linii komórkowych. W doświadczeniu 2 natomiast małe skupienia komórek M A-104 zaczęły pęcznieć i tworzyć dziury w jednolitej warstwie komórek przy krawędziach butelki. Płyn pobrano z butelki i przeniesiono do nowej butelki z komórkami M A-104 (znów 20-40% jednolitej warstwy komórek), a następnie pasażowano po raz trzeci. Efekt cytopatyczny (CPE) nasilał się z każdym pasażem. Opisane postępowanie powtórzono z linią komórek M A-104, używając pełnej warstwy komórek. CPE obserwowano również. Dalsze badanie wykazało, ze czynnik wirusowy namnaża się także w temperaturze około 37 C. Obecność surowicy może być pomocna w początkowej izolacji czynnika wirusowego. W dalszych pasażach czynnika wirusowego na komórkach linii M A-104 CPE występuje bez obecności surowicy. Jednak bardziej nasilony CPE obserwuje się przy użyciu surowicy w podłożu wzrostowym dla komórek linii M A-104.

169 952 5 Stwierdzono również, ze czynnik wirusowy jest częściowo oporny na ogrzewanie w około 56 C przez około 50 minut. W wyniku takiego traktowania ciepłem miano wirusa spadło o około 3 logarytmy. Czynnik wirusowy pasażowano ośmiokrotnie na komórkach linii MA-104 z dobrym CPE rozwijającym się w ciągu 3 dni w pasażu piątym i następnych. Otrzymywane miano wynosiło w przybliżeniu 5.05 log (105,5). Czynnik wirusowy namnaża się także na innych małpich liniach komórkowych. Jest zatem sprawą indywidualnego doświadczenia w tej dziedzinie aby namnażać wirus SIRS ATCC-2332, lub jego mutanty, na innych liniach komórkowych przy pomocy modyfikacji warunków wzrostu, podłoży wzrostowych itd. Przykład II. Badanie in vivo. Zbiór z trzeciego pasażu użyto do zaszczepienia dwu. trzydniowych prosiąt gnotobiotycznych. Obu podano donosowo odpowiednio 1 i 2 ml. Prosięta obserwowano 7 dni następnie zabito. Pobrano próbki tkanek do histopatologii i do izolacji czynnika wirusowego, badanie histopatologiczne potwierdziło, że zmiany w płucach zakażonych prosiąt były identyczne ze zmianami w płucach prosiąt z SIRS. Próbki tkanek opracowano jak poprzednio, następnie podano do hodowli 20-40% i 100% warstwy komórek linii MA-104 z płodowa surowicą bydlęcą. Czynnik wirusowy ponownie izolowano. Zbiór z trzeciego pasażu użyto także do zaszczepienia macior, celem weryfikacji, ze efekty reprodukcyjne choroby można odtworzyć i potwierdzić. Dwie maciory rodzące po kilka młodych zaszczepiono donosowo około 93 dnia ciąży. Odpowiednio 112 i 114 dnia ciąży maciory wydały mioty, w których było 50 procent martwo urodzonych (8/13 i 6/14 martwych/żywych). Siedem z martwo urodzonych prosiąt było częściowo zmumifikowanych, a żywe prosięta były słabe i nie ssały prawidłowo. Z tkanek martwo urodzonych prosiąt izolowano czynnik wirusowy. Czynnik wirusowy izolowano w trzech stadach, w których znane było SIRS. W tych samych stadach stwierdzono miana przeciwciał dla czynnika ATCC-VR2332. Chociaż występują pewne różnice w klinicznych objawach, to jest sinica skóry uszu, ogona i wymienia u krów europejskich, przeważa pogląd, ze chorobą północnoamerykańską i europejską wywołuje ten sam wirus. Przykład III. Charakterystyka wirusa. ATCC-VR2332 stale wywoływał objawy kliniczne i zmiany w płucach u gnotobiotycznych świń i dawał ujemne wyniki immunofluorescencji (ImF), wykazujące, ze wirus nie posiada antygenu grupowego, antygenowo podobnego do wirusów aktualnie znanych rodzajów togawirusów (Togavirideae). Zatem wirus ATCC- VR2332 może reprezentować niezidentyfikowany rodzaj togawirusów (Togaviridae). Wirus ATCC-VR2332 nie jest także znanym patogenem świń, ponieważ swoiste antysurowice przeciw znanym wirusowym patogenom świń nie neutralizowały wirusa ani nie wykazywały antygenów w zakażonych komórkach. ATCC-VR2332 jest to wymagający, nie hemaglutynujący wirus RNA posiadający otoczkę. Namnaża się w linii ciągłej komórek, w szczególności MA-104 i innych małpich liniach komórkowych. Wirus ATCC-VR232 namnaża się do wysokich mian (107 TCID50/ml) w handlowej linii komórek MA-104. Wirus ATCC-VR2332 posiada otoczkę lipidową, na co wskazuje utrata zakaźności po traktowaniu chloroformem. Otoczkę lipidową można także uwidocznić jako elektronowo przejrzysty pierścień otaczający puste cząstki. Morfologia wirusa SIRS nie jest wyraźna w bezpośredniej mikroskopii elektronowej (DEM) i jest niezwykle trudna do identyfikacji w preparatach zawierających resztki komórkowe. Wiriony ATCC-VR2332 można zidentyfikować po oczyszczeniu w gradientach CsCl i następnie wyznakowaniu wirionów koniugatem złota i hyperimmunizowanej surowicy anty ATCC-VR2332. Gęstość pływakowa wirionów ATCC- VR2332 w gradientach CsCl wynosi 1,18-1,19 g/ml. Gradienty sacharozy stale powodowały straty miana wirusa i zostały zaniechane jako gradienty do oczyszczania. Morfologia oczyszczonych w gradiencie cząstek ATCC-VR2332 oraz przeciętna średnica 62 nm są bardzo podobne do wirionów wirusów zapalenia tętnic koni i dehydrogenazy mlekowej. Wirus zapalenia tętnic koni ma opisaną wielkość 50-73 nm, podobną do wielkości 48-84 nm wirusa ATCC- VR2332. W niektórych cząstkach ATCC-VR2332 obserwowano rdzenie 30-35 nm, które

6 169 952 przypominają nukleokapsydowe rdzenie opisane u wirusa zapalenia tętnic koni. Tak więc morfologicznie ATCC-VR2332 najbardziej przypomina grupę wirusów zapalenia tętnic. Obecność genomu RNA ATCC-YR2332 została potwierdzona przez zdolność wirusa do kontynuowania replikacji w obecności 5-brono-2-dezoksyurydyny i mitomycyny C. które są znane jako inhibitory replikacji DNA i jednej rodziny wirusów RNA (retrowirusów - Retroviridae) ale nie innych wirusów RNA. Jednak tymczasem klasyfikacja ATCC-VR2332 jako wirusa RNA jest zgodna z obserwacją, ze wirus ten replikuje się w cytoplazmie komórki, na co wskazuje obecność antygenów wirusa wykrywanych ImF. Również antynomycyna D, która interferuje z tanskrypcją RNA zalezą od DNA, nie wpływa na replikację wirusa ATCC-VR2332. Wyniki badań wskazują, ze wirus ATCC-VR2332 nie wymaga funkcji jadra dla swojej replikacji. Wirus ATCC-VR2332 jest termolabilny w 37 C i 56 C, ale jest trwały przez długi czas w 4 C i -70 C. Termolabilność w 37 C może sugerować, ze wirus jest stosunkowo nietrwały w ciepłych warunkach otoczenia. Ma to również praktyczne zastosowanie dla namnażania wirusa, sugerując, ze wzrost w temperaturach niższych niż 37 C będzie dawał wyższą wydajność wirusa ATCC-VR2332. Chłodzenie powinno wystarczać dla przechowania próbek diagnostycznych do izolacji wirusa przez krótki czas, w innym przypadku próbkę należy przechowywać w stanie zamrożenia. Podsumowując, wielkość morfologia, obecność genomu RNA oraz inne cechy biologiczne prowizorycznie lokują wirus ATCC-VR2332 w rodzinie togawirusów (Togaviridae). Jednak ATCC-VR2332 nie może być definitywnie umieszczony w jednym ze znanych rodzajów tej rodziny Aczkolwiek morfologicznie wirus ATCC-VR2332 bardzo przypomina arteriwirusy, nie należy go umieszczać w określonym rodzaju dopóki nie będą dostępne dodatkowe dane co do struktury DNA i białka. I. Podłoża i płyny: a. Podłoże minimalne Eagle a (MEM), JRH Biosciences, 200-2041 b. Płodowa surowica cielęca, FCS JHR Biosciences c. Podłoże wzrostowe do hodowli komórek - MEM + 10% płodowa surowica cielęca d. Podłoże utrzymujące - MEM + 4% płodowa surowica cielęca e. Trypsyna _ WersaneIX f. Dwuwęglan sodu 5% lub nasycony II. Hodowla tkanek: Zastosowana linia komórkowa: MA-104 (komórki nerki zielonej małpy afr ykańskiej, utrzymywana na poziomie 20 pasaży (pasaż komórek 58-78). III. Wyposażenie: butelki 75 cm do hodowli tkanek zestaw do inkubacji w 35-37 C zestaw do inkubacji w 31 C wirówka Departament W ydawnictw UP RP N akład 90 egz Cena 2,00 zł