Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności promotora S35 i terminatora NOS w próbkach żywności z wykorzystaniem metody PCR Prawo Unii Europejskiej wymaga odpowiedniego etykietowania produktów posiadających więcej niż 0,9% zawartości GMO. Weryfikację obecności GMO w produktach żywnościowych umożliwia m.in. reakcja PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych do fragmentów DNA zwykle obecnych w sekwencji transgenów, najczęściej promotora 35S oraz terminatora transkrypcji NOS. Procesy produkcyjne stosowane podczas przetwarzania żywności powodują fragmentację DNA matrycy dla reakcji PCR, wobec czego konieczna jest identyfikacja stosunkowo krótkich sekwencji (ok. 100 pz). Dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników możliwe jest zastosowanie gotowych zestawów dla przeprowadzania reakcji PCR, jak GMOScreen firmy eurofins, pozwalający na wykrycie obecności sekwencji 35S i NOS. PCR - Polymerase Chain Reaction (łańcuchowa reakcja polimerazy) (Mullis, 1986) Technika PCR (ang. polymerase chain reaction), opracowana w latach 80., zrewolucjonizowała genetykę molekularną, umożliwiając otrzymywanie dużej liczby kopii unikalnych fragmentów DNA bez konieczności stosowania żmudnych i długotrwałych procedur klonowania. Metoda PCR wykorzystuje in vitro zasady replikacji DNA. Polimeraza DNA prowadzi syntezę nowej komplementarnej nici w kierunku 5' - 3' na jednoniciowym DNA (singlestranded DNA, ssdna), który stanowi matrycę do syntezy. Aby zapoczątkować syntezę na matrycy potrzebne są krótkie fragmenty starterów z wolnym końcem 3 -OH wyznaczające początek amplifikacji, substraty do syntezy nowej nici w postaci czterech deoksyrybonukleotydów oraz termostabilna polimeraza syntetyzująca wydłużanie nowej nici. Reakcję PCR prowadzi się przez cykliczne zmiany temperatury rozpoczynając od denaturacji w temperaturze 95-94 o C, w której DNA dwuniciowy (double-stranded DNA, dsdna) rozdziela się (denaturuje) do postaci jednoniciowej, zaś jako starterów używa się pary oligonukleotydów wiążących się specyficznie (hybrydyzujących) z określonymi miejscami na jednoniciowej matrycy. Każdy ze starterów hybrydyzuje specyficznie na jednej z dwóch nici DNA. Dobiera się je tak, aby oskrzydlały odcinek DNA, który ma być zamplifikowany. Temperatura przyłączania starterów wyznaczana jest dla każdej pary starterów indywidualnie. Amplifikacja rozpoczyna się na każdej nici matrycowej od starterów i zachodzi na obu niciach. Proces ten zachodzi zwykle w 72 o C. Na nowo syntetyzowanych niciach powstają zatem nowe miejsca wiązania starterów. Po zakończeniu amplifikacji nici są rozdzielane (denaturacja), aby ponownie umożliwić wiązanie znajdujących się w nadmiarze starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA. Cykl taki powtarza się wielokrotnie, a po n cyklach otrzymuje się teoretycznie 2 n dwuniciowych cząsteczek DNA będących kopiami sekwencji zawartej pomiędzy starterami.
DENATURACJA DNA DENATURATION PRZYŁĄCZANIE OLIGONUKLEOTYDÓW (starterów) ANNEALING x n WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHA EXTENSION Temperaturę przyłączania starterów można obliczyć stosując uproszczone wzory podane poniżej. Temperatura dysocjacji (topnienia - Tm) starterów: Tm = 4x(C+G) + 2x(A+T) Temperatura przyłączania (annealingu - Ta) starterów Ta =Tm - 5 C Cele ćwiczenia: opanowanie podstaw reakcji PCR Materiał: DNA o koncentracji co najmniej 20 ng/μl, wyizolowany w poprzednim ćwiczeniu z różnych próbek żywności Przebieg ćwiczenia: Dla każdej badanej próby DNA przygotowywane są trzy reakcje PCR: 1) ze starterami komplementarnymi do sekwencji promotora 35S; 2) ze starterami komplementarnymi do sekwencji terminatora transkrypcji NOS; 3) ze starterami komplementarnymi do sekwencji genomu chloroplastowego. Reakcje 1 i 2 pozwalają na stwierdzenie lub wstępne wykluczenie obecności GMO w badanym produkcie żywnościowym, zaś reakcja 3 stanowi kontrolę obecności DNA roślinnego. W każdej z powyższych reakcji PCR (z odpowiednią parą starterów) jako matrycę wykorzystuje się: DNA wyizolowane z badanego produktu żywnościowego jest to próbka badana, DNA rośliny transgenicznej o potwierdzonej obecności amplifikowanych fragmentów jest to kontrola pozytywna reakcji Wodę (próbka bez DNA) jest to kontrola negatywna reakcji.
I. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej w probówce PCR (0,2ml): W eppendorfie 1,5ml przygotować mieszaninę reakcyjną na 6 próbek, według tabelki zamieszczonej poniżej. Wszystkie składniki reakcji po rozmrożeniu powinny zostać zworteksowane i zwirowane przed dodaniem ich do mix u. Składniki Objętość przypadająca na Objętość przypadająca na 1 próbkę 6 próbek ddh2o 14,5 µl Bufor B 2 µl dntps 1 µl Lewy starter 0,5 µl Prawy starter 0,5 µl Matrycowe DNA 4 µl Do odpowiednio oznaczonych probówek o pojemności 0,2 ml rozdzielić po 18,5 μl uprzednio przygotowanej mieszaniny reakcyjnej i dodać 5 μl DNA (50-100 ng), a następnie 0,5 µl polimerazy Color Tag Dokładnie wymieszać przez przepipetowanie i umieścić w termocyklerze. Profil temperaturowy reakcji: 1. Wstępna denaturacja: 94ºC 10 min 2. Denaturacja: 94ºC 25 sec 3. Asocjacja: 57ºC 30 sec 4. Elongacja: 72ºC 45 sec Etapy 2-4 powtórzone 50 razy 5. Końcowa elongacja: 72ºC 3 min 6. Pauza: 4ºC ~ Wielkość oczekiwanych produktów: 123 pz
Ćwiczenie 4 Jakościowe badanie obecności promotora S35 i terminatora NOS w próbkach żywności z zastosowaniem zestawu GMO Screen (35S/NOS) z wykorzystaniem metody PCR analiza wyników II. Przygotowywanie 1% żelu agarozowego w 0,5x TBE: Żele agarozowe są jedną z najczęściej używanych metod podczas szybkiej oceny ilości i czystości DNA po izolacji lub reakcji PCR, a przede wszystkim określania długości cząsteczek DNA. Kwasy nukleinowe można analizować za pomocą elektroforezy, czyli wędrówki cząsteczek w polu elektrycznym prądu stałego lub prądu zmiennego. Szybkość wędrówki cząsteczki zależy wprost proporcjonalnie od jej ładunku i siły pola elektrycznego wyrażanej zazwyczaj w woltach na centymetr nośnika (żelu agarozowego), oraz odwrotnie proporcjonalnie do wielkości cząsteczki i jej konformacji i do oporu, stawianego przez nośnik. Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ujemny ładunek elektryczny. Czas ich migracji w żelu zależy od długości cząsteczki, im jest ona krótsza, tym szybciej wędruje. Żele agarozowe o różnym stężeniu wykorzystywane są w zależności od wielkości cząsteczek DNA, które mają zostać rozdzielone; krótkie fragmenty są dobrze rozdzielone na żelach o wysokim stężeniu agarozy, podczas gdy niska zawartość agarozy sprzyja rozdziałowi większych fragmentów. Wizualizacja elektroforetycznie rozdzielonego DNA zachodzi zwykle dzięki wykorzystaniu bromku etydyny lub innego, podobnego barwnika. Substancje te interkalują pomiędzy dwie nici DNA, a proces ten powoduje znaczny wzrost ich fluorescencji w świetle UV. Przebieg procedury: Odmierzyć odpowiednią ilość buforu 10x TBE dopełnić wodą destylowaną do 200 ml odważyć odpowiednią ilość agarozy całość dokładnie rozpuścić w kuchence mikrofalowej po ostudzeniu mieszaniny żelowej do temperatury ok. 60 C dodać 4,6 μl bromku etydyny, który podczas elektroforezy zwiąże się z DNA Do próbek dodać 6 x GLB (gel loading buffer) i nałożyć do kieszonek po 20 μl, do ostatniej kieszonki nałożyć 3 μl markera wielkości 100 pz. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 120V przez 30 minut. Przeprowadzić wizualizację produktów reakcji PCR z wykorzystaniem lampy UV - dzięki temu możliwa jest detekcja fragmentów DNA związanych z bromkiem etydyny, który pod wpływem promieniowania UV fluoryzuje w kolorze różowo-pomarańczowym. 10 x TBE: 180g Tris HCl 55g kwasu borowego 9,3g Na 2 EDTA x 2H 2 O rozpuścić w 750ml dh 2 O, ustalić ph-8.3 i dopełnić do 1l 10 x loading buffer 50mg Bromo-Phenol Blue
50mg Xylene Cyanol 5g Ficol 400 rozpuścić w dh 2 O do 20ml, autoklawować Fig. 1. Wynik przykładowej analizy obecności sekwencji 35S i NOS, stosowanych w większości komercyjnie wykorzystywanych transgenów, oraz obecności specyficznego dla roślin DNA chloroplastowego (wizualizacja produktów PCR w żelu agarozowym). 1 pasztet z dziczyzny; 2 mąka sojowa z soi modyfikowanej genetycznie; 3 musli Fitness; 4 kontrola pozytywna; 5 kontrola negatywna; M marker wielkości.