MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 1-8 Anna Pietruczuk-Padzik 1*, Joanna Stefańska 1, Katarzyna Semczuk 2, Danuta Dzierżanowska 2, Stefan Tyski 1,3 OCENA TWORZENIA BIOFILMU PRZEZ SZCZEPY STAPHYLOCOCCUS AUREUS WYIZOLOWANE Z PLWOCINY PACJENTÓW Z MUKOWISCYDOZĄ 1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. S. Tyski 2 Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Instytut Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. D. Dzierżanowska 3 Zakład Antybiotyków i Mikrobiologii, Narodowy Instytut Leków, Warszawa Kierownik: prof. dr hab. S. Tyski Celem przedstawionych badań była ocena dwóch metod wykrywania biofilmu bakteryjnego tworzonego przez kliniczne szczepy Staphylococcus aureus wyizolowane z plwociny pacjentów z mukowiscydozą oraz ocena tworzenia biofilmu na powierzchni dołków płytek polistyrenowych w zależności od użytego podłoża hodowlanego (LB, BHI, TSB glu ). Zdolność i intensywność tworzenia biofilmu analizowano metodą barwienia z użyciem fioletu krystalicznego (CV) oraz metodą oceny redukcji chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC). Stwierdzono, że obydwie metody barwienia okazały się przydatne do oceny powstającego biofilmu gronkowcowego. Za najbardziej optymalne podłoże do hodowli biofilmu gronkowcowego uznano podłoże LB. Mukowiscydoza (cystic fibrosis, CF) jest najczęściej występującą kodowaną autosomalnie recesywnie chorobą genetyczną. Występuje z częstością 1 na 2500 żywych urodzeń (16). Mukowiscydoza jest chorobą dziedziczną wpływającą na funkcje zewnątrzwydzielnicze wielu narządów, m. in. płuc, wątroby, trzustki i jelit, powodując stopniowe upośledzenie z powodu niewydolności wielonarządowej. Najbardziej charakterystyczne zmiany zauważalne są w drogach oddechowych pacjentów. Defekt białka CFTR powoduje zaburzenie wydzielania śluzu i przewlekłe zapalenie płuc z kolonizacją przez bakterie chorobotwórcze. S. aureus może wchodzić w skład fizjologicznej flory górnych dróg oddechowych. W przypadku mukowiscydozy bakteria ta jest najczęściej izolowana z wydzieliny z dróg oddechowych na wczesnych etapach choroby. Początkowo jest to jedyny bakteryjny patogen zasiedlający płuca, w późniejszym etapie często dochodzi do kolonizacji Haemophilus influenzae. Gronkowiec złocisty oraz Haemophilus influenzae predysponują chore płuca do kolonizacji przez pałeczki Gram-ujemne, takie jak Pseudomonas aeruginosa i Stenotrophomonas maltophilia (7, 17).
2 A. Pietruczuk-Padzik i inni Nr 1 Biofilm jest zorganizowanym skupiskiem bakterii, zbudowaną z komórek trwale związanych z powierzchnią stałą. Biofilm bakteryjny składa się z ułożonych warstwowo komórek umieszczonych w wytwarzanej przez nie polisacharydowej macierzy pozakomórkowej (EPS), która ułatwia adhezję bakterii do powierzchni biotycznych i abiotycznych. Bakterie w biofilmie wykazują zróżnicowany fenotyp o różnym tempie wzrostu oraz odmienną ekspresją genów (7). Rola biofilmów bakteryjnych w przebiegu utrzymujących się zakażeń oraz w przebiegu chorób przewlekłych jest coraz lepiej poznana (5, 19). Eksperci od chorób zakaźnych z amerykańskiego Centrum Zapobiegania i Zwalczania Chorób (CDC) szacują, że 65% zakażeń bakteryjnych u ludzi związana jest z obecnością biofilmów (2). Biofilm gronkowcowy odpowiedzialny jest za rozwój wielu chorób, między innymi za infekcyjne zapalenie wsierdzia, zapalenie ucha środkowego oraz zakażenia kości (7, 12). Biofilmy powiązane są również z zakażeniami związanymi ze stosowaniem implantów medycznych, cewników naczyniowych, cewników moczowych, sztucznych zastawek serca, implantów ortopedycznych, rozruszników serca oraz soczewek kontaktowych (3). Przewlekłe zakażenia dróg oddechowych w przebiegu mukowiscydozy powiązane są z obecnością biofilmów bakteryjnych. Bakterie namnażają się w zmienionym śluzie zalegającym w płucach, tworząc mikrokolonie oraz biofilm. Powstawanie biofilmu sprawia, że zakażenie jest znacznie trudniejsze do eradykacji (17). Struktura biofilmu chroni drobnoustroje przed mechanizmami układu odpornościowego człowieka, utrudniając fagocytozę i opsonizację, powodując osłabienie chemotaksji, a także utrudnienie i zmniejszenie penetracji substancji przeciwdrobnoustrojowych, w tym antybiotyków i chemioterapeutyków (1). Bakterie tworzące biofilm są wysoce oporne na działanie większości antybiotyków, mogą one wykazywać nawet tysiąckrotnie większą oporność na antybiotyki, w porównaniu do komórek tych samych bakterii występujących w formie planktonowej (6, 9, 19). Do oceny tworzenia biofilmu przez szczepy bakteryjne niezbędne jest wybranie czułej i powtarzalnej metody barwienia. Metody z użyciem barwników takich jak fiolet krystaliczny lub safranina są powszechnie stosowane ze względu na ich prostotę stosowania. Fiolet krystaliczny łączy się z ujemnie naładowanymi cząsteczkami, jak kwasy nukleinowe i kwaśne polisacharydy, dzięki czemu można ocenić całą masę powstałego biofilmu (4). Sole tetrazoliowe wykrywają enzymy oksydacyjne działając jako akceptory elektronów (8). Chlorek 2,3,5-trójfenylotetrazoliowy (TTC) jest przekształcany w komórkach bakteryjnych do czerwonych, nierozpuszczalnych kryształów formazanu (4, 8). Powstały kolorowy, nierozpuszczalny produkt może być oznaczony kolorymetrycznie. Celem niniejszych badań była ocena tworzenia biofilmu przez 80 klinicznych szczepów Staphylococcus aureus uzyskanych z plwociny pacjentów chorych na mukowiscydozę. Szczepy hodowane były w trzech różnych podłożach hodowlanych w dołkach polistyrenowych płytek titracyjnych, a wytworzony na powierzchni plastiku biofilm oznaczany był dwiema metodami barwienia. Szczepy o najwyższym poziomie produkcji biofilmu zostaną wybrane do dalszych badań nad fizjologią biofilmu gronkowcowego. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne i metoda hodowli. Do badań użyto osiemdziesiąt klinicznych szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych z plwociny pacjentów z mukowiscydozą hospitalizowanych w Instytucie Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka w Międzylesiu.
Nr 1 Warunki tworzenia biofilmu przez S. aureus 3 Wszystkie szczepy przed użyciem były przechowywane w zamrożeniu w temp. 70 C w podłożu BHI z dodatkiem 10% glicerolu. Szczepy były wysiewane z zamrożenia na płytki z agarem odżywczym i inkubowane przez 24 h w temp. 37 C. Tworzenie biofilmu oceniano w trzech różnych podłożach hodowlanych, podłożu Luria Bertani (LB; Pepton Tryptone BTL, Yeast extract Difco, NaCl Chempur, glukoza - POCH), podłożu tryptozowo-sojowym z dodatkiem 2% glukozy (TSB glu ; TSB MERCK, glukoza POCH) oraz w podłożu z wyciągiem mózgowo-sercowym (BHI; Difco). Izolowane kolonie z płytek agarowych przesiewano do odpowiednich płynnych podłoży LB, BHI lub TSB glu i hodowano przez 24 h w temp. 37 C, a następnie przesiewano na odpowiednie skosy (zestalone agarem podłoża LB, BHI i TSB glu ) i inkubowano przez kolejne 24 h w temp. 37 C. Kolonie bakteryjne zawieszano w 0,85% NaCl, w celu uzyskania inokulum bakteryjnego o gęstości około 3,2 jednostki w skali McFarlanda, co odpowiada 10 9 jednostek tworzących kolonie (cfu) S. aureus w 1 ml. Aby uzyskać odpowiednią gęstość zawiesiny bakterii do inokulacji mikropłytek, każdą wyjściową zawiesinę rozcieńczano 10-krotnie odpowiednim podłożem. Dołki w polistyrenowych, sterylnych 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych (Kartell S.p.A., Italy, Medlab) napełniano 200 µl zawiesiny bakteryjnej. Równocześnie do części dołków dodawano 200 µl samego podłoża LB, TSB glu i BHI jako kontrolę sterylności i niespecyficznego wiązania odczynników. Płytki były inkubowane przez 24 h w temp. 37 C. Metoda barwienia fioletem krystalicznym (CV). Po inkubacji usuwano komórki planktonowe bakterii poprzez 9-krotne płukanie sterylnym buforem fosforanowym - PBS. Powstały biofilm utrwalano 3% roztworem formaliny przez 10 minut, a następnie przepłukiwano trzykrotnie 200 µl PBS. Biofilm powstały w dołkach płytek titracyjnych barwiono przez 15 minut, 2% wodnym roztworem fioletu krystalicznego (Chemapol, UK). Barwnik usuwano poprzez płukanie wodą destylowaną. Do poszczególnych dołków dodawano po 200 µl 96% etanolu i mierzono absorbancję spektrofotometrycznie przy długości fali 584 nm (PowerWave XS; BioTek). Metoda TTC. Płytki titracyjne były inokulowane według metody opisanej powyżej, ale dodatkowo do dołków dodawano 20 µl 0,1% sterylnego wodnego roztworu chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC; Reanal, Hungary). Płytki inkubowano przez 24 h w 37 C. Następnie dołki płukano i materiał utrwalano, tak jak zostało opisane w metodzie barwienia fioletem krystalicznym. W celu rozpuszczenia powstałych kryształów formazanu do dołków dodawano po 200 µl 96% etanolu. Absorbancję mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 485 nm (PowerWave XS; BioTek). Standaryzacja metody. W doświadczeniu równocześnie prowadzono hodowlę szczepów referencyjnych S. aureus, stanowiących odniesienie, sklasyfikowanych jako: szczep tworzący duży biofilm (H), szczep tworzący średni biofilm (I) i szczep tworzący mały biofilm (L). Szczepy te zostały wybrane z kolekcji szczepów klinicznych S. aureus z Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, na podstawie wcześniej wykonanych analiz. Eksperyment przeprowadzono dwukrotnie, w dwóch powtórzeniach każdy. Wyniki uzyskane dla poszczególnych szczepów zostały uśrednione, a cząstkowe wyniki porównano z wynikami uzyskanymi dla szczepów referencyjnych. Wartości średnie i wartości odchylenia standardowego zostały obliczone dla wszystkich powtórzeń eksperymentu. Dwa pomiary zostały uznane za poprawne, wówczas
4 A. Pietruczuk-Padzik i inni Nr 1 gdy różnica między średnią wyliczoną dla każdego szczepu i danym pomiarem była niższa niż 20%. Jeżeli różnica wynosiła powyżej 20% doświadczenie było powtarzane. WYNIKI Barwienie fioletem krystalicznym (CV) jak i TTC wykazało, że wszystkie z analizowanych szczepów S. aureus wyizolowanych z plwociny chorych na mukowiscydozę, są w stanie tworzyć biofilm w warunkach in vitro, we wszystkich użytych podłożach hodowlanych, jednak z różną intensywnością. Analiza wyników uzyskanych dla badanych szczepów w porównaniu do szczepów referencyjnych pozwoliła na różnicowanie szczepów jako tworzące mały, średni i duży biofilm, w zależności od wartości absorbancji. Poziomy absorbancji zostały przyjęte subiektywnie przez autorów w celu sklasyfikowania analizowanych szczepów. Szczepy zostały podzielone w zależności od wartości absorbancji na 3 grupy. Stosując fiolet krystaliczny: szczepy tworzące mały biofilm A 584 <0,24, szczepy tworzące średni biofilm 0,24 A 584 0,39, i szczepy tworzące duży biofilm A 584 >0,39. Stosując TTC: szczepy tworzące mały biofilm A 485 <0,17, szczepy tworzące średni biofilm 0,17 A 485 0,32, i szczepy tworzące duży biofilm A 485 >0,32. W przypadku metody CV, uzyskano różne wyniki dla poszczególnych szczepów w zależności od użytego podłoża hodowlanego. Wartości absorbancji wynosiły od 0,3 do około 1,8. W przypadku podłoża TSB glu, tylko kilka (4/80) szczepów sklasyfikowano jako tworzące mały biofilm, podczas gdy w podłożu LB, szczepy tworzyły mały, średni i duży biofilm (odpowiednio 19/80, 24/80 i 37/80). Najbardziej powtarzalne wyniki, o najmniejszym zakresie odchylenia standardowego (z wyjątkiem szczepu 7) otrzymano w podłożu LB (Ryc. 1a). Wartości absorbancji uzyskane w metodzie CV, w podłożu TSB z dodatkiem 2% glukozy, były najwyższe. Ponadto w tym przypadku uzyskano stosunkowo duże różnice między wynikami poszczególnych doświadczeń (Ryc. 1b). W podłożu BHI biofilm tworzony był mniej intensywnie niż w przypadku podłoża LB, a także wartości odchylenia standardowego były wyższe (Ryc. 1c). W metodzie z użyciem fioletu krystalicznego, w podłożu LB, 20 (25%) spośród 80 analizowanych szczepów tworzyło duży biofilm, podczas gdy w podłożu TSB glu liczba szczepów tworzących duży biofilm wzrastała do 42 (52,5%). W podłożu TSB glu tylko 4 (5%) szczepy tworzyły mały biofilm (Tab. I). W metodzie TTC, wartości absorbancji wynosiły od około 0,2 do 0,9, przy czym w przypadku podłoża TSB glu ich wartości nie różniły się istotnie od wartości uzyskanych na pozostałych podłożach. W tej metodzie barwienia więcej szczepów sklasyfikowano jako tworzące mały biofilm, w porównaniu do metody CV. W podłożu TSB glu, 19 (23,75%) szczepów wykazywało niski poziom produkcji biofilmu, w metodzie TTC, podczas gdy w metodzie CV tylko 4 szczepy tworzyły mały biofilm w tym podłożu. W podłożu BHI większość szczepów tworzyła średni i duży biofilm (odpowiednio 45% i 52,5%) (Tab. I). Niezależnie od metody barwienia biofilmu (CV czy TTC), 32 (40%) szczepów tworzyło biofilm na tym samym poziomie, we wszystkich zastosowanych podłożach hodowlanych. Niemniej jednak, obserwowano duże rozbieżności między poziomem tworzenia biofilmu w różnych podłożach dla tego samego szczepu, w niektórych przypadkach szczep został sklasyfikowany jako tworzący mały biofilm w jednym z podłoży, i jako tworzący duży biofilm w innym. Tylko 8 (10%) szczepów wykazywało ten sam poziom produkcji biofilmu w metodzie CV i TTC we wszystkich użytych podłożach.
Nr 1 Warunki tworzenia biofilmu przez S. aureus 5 368 369 370 Ryc. 1. Tworzenie biofilmu przez 10 losowo wybranych szczepów S. aureus wyizolowanych z plwociny pacjentów z mukowiscydozą po 24 godz. inkubacji w trzech podłożach, 13 a) Luria Bertani (LB), b) tryptozowo-sojowym z dodatkiem 2% glukozy (TSB glu ), i c) podłożu z wyciągiem mózgowo-sercowym (BHI). Tworzenie biofilmu oceniano metodą barwienia fioletem krystalicznym (CV) i metodą oznaczania redukcji chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC). Absorbancja: CV λ=584 nm, TTC λ=485 nm. Słupki przedstawiają wartości średnie ± odchylenie standardowe.
6 A. Pietruczuk-Padzik i inni Nr 1 Tabela I. Tworzenie biofilmu przez 80 klinicznych szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych z plwociny pacjentów z mukowiscydozą po 24 godz. inkubacji w trzech różnych podłożach hodowlanych Tworzenie biofilmu oceniane poprzez Podłoże Barwienie fioletem krystalicznym hodowlane Barwienie TTC*** L I H L I H LB 14 46 20 20 16 44 TSB glu 4 34 42 19 24 37 BHI 19 29 32 2 36 42 Objaśnienia: liczba szczepów tworzących biofilm o danym typie LB - podłoże Luria Bertani, TSB glu podłoż- tryptozowo-sojowe z dodatkiem 2% glukozy, BHI - podłoże z wyciągiem mózgowo-sercowym, ** barwienie fioletem krystalicznym (szczepy tworzące mały biofilm L, A 584 <0.24; szczepy tworzące średni biofilm I, 0,24 A 584 0,39; szczepy tworzące duży biofilm H, A 584 >0,39), ***barwienie TTC (L - A 485 <0,17; I 0,17 A 485 0,32; H - A 485 >0,32) DYSKUSJA Niniejsza praca jest drugą próbą badania wpływu podłoży hodowlanych i różnych metod barwienia biofilmu do analizy dynamiki tworzenia biofilmu bakteryjnego. Analizując wzrost biofilmu rozmaitych szczepów P. aeruginosa (10) również odnotowano zróżnicowany wzrost biofilmu na polistyrenie w obecności 3 podłoży hodowlanych i oznaczanego przy zastosowaniu różnych metod barwienia. Do dalszych badań nad biofilmem tworzonym przez P. aeruginosa za optymalne uznano podłoża LB i TSB z glukozą oraz metodę barwienia z użyciem MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazoil-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy). W niniejszej pracy wykazano, że obydwie z zastosowanych metod barwienia barwienie fioletem krystalicznym, jak i metoda oceny redukcji chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (TTC) są przydatne do wykrywania powstałego biofilmu gronkowcowego. Wyniki uzyskane w prezentowanych badaniach wskazują, że metoda TTC jest bardziej specyficzna do wykrywania oraz ilościowej oceny powstałego biofilmu bakteryjnego. Knobloch i wsp. (11) wykazali, że wzbogacenie podłoża TSB lub BHI węglowodanami, glukozą lub sacharozą, powodowało znaczący wzrost produkcji biofilmu przez kliniczne szczepy S. aureus. Około 57% szczepów tworzyło biofilm, w co najmniej jednym z użytych podłoży. W naszych badaniach, barwienie CV, wykazało, że 72,5% z analizowanych szczepów tworzyło średni lub duży biofilm w podłożu TSB z dodatkiem 2% glukozy, ale w przypadku tego podłoża występowały największe rozbieżności między wynikami i największe wartości odchylenia standardowego. Semczuk i wsp. (18) przeanalizowali 297 klinicznych szczepów S. aureus wyizolowanych z plwociny i wymazów z gardła od pacjentów z mukowiscydozą, oraz 40 szczepów pochodzących od zdrowych dzieci, przy użyciu metody Christensena z zastosowaniem fioletu krystalicznego, na podłożu TSB z dodatkiem 0,25% glukozy. Izolaty pochodzące od pacjentów z mukowiscydozą znacznie częściej wykazywały zdolność do produkcji biofilmu niż szczepy z grupy kontrolnej.
Nr 1 Warunki tworzenia biofilmu przez S. aureus 7 Rola biofilmu bakteryjnego w przebiegu zakażeń związanych ze stosowaniem implantów medycznych jest dobrze opisana w licznych publikacjach, jednak rola biofilmu w przebiegu chorób nie związanych z implantami jest słabiej poznana. Przykładem choroby w przebiegu której biofilm bakteryjny wydaje się odgrywać znaczącą rolę jest zapalenie płuc u pacjentów z mukowiscydozą. Jednak większość publikacji koncentruje się na zakażeniach wywoływanych przez Pseudomonas aeruginosa (6, 14, 15, 20), niewiele prac poświęconych jest roli biofilmu S. aureus w mukowiscydozie (13, 18). Wyniki niniejszych badań potwierdzają, że szczepy S. aureus izolowane z dróg oddechowych od pacjentów z mukowiscydozą tworzą biofilm in vitro, i mogą powodować u nich przewlekłe zakażenia układu oddechowego. Podsumowując, mimo że obserwowano korelację między zastosowanymi metodami barwienia stwierdzono, że metoda barwienia fioletem krystalicznym, jest bardziej czuła niż metoda TTC, gdy istotna jest informacja na temat całej masy powstałego biofilmu. Wynika to z faktu, że fiolet krystaliczny wybarwia cały biofilm, w tym żywe, jak i martwe komórki bakterii, a także ujemnie naładowane cząsteczki polisacharydowe matriks biofilmu, natomiast TTC wykrywa obecność tylko żywych, metabolicznie aktywnych komórek. W przedstawionych badaniach obydwie metody barwienia z użyciem fioletu krystalicznego, jak i z użyciem TTC, okazały się przydatne do oceny powstającego biofilmu gronkowcowego, a także uzyskane wyniki wskazują na podłoże LB, jako najbardziej optymalne do hodowli biofilmu gronkowcowego, ze względu na najmniejsze wartości odchylenia standardowego. A. Pietruczuk-Padzik, J. Stefańska, K. Semczuk, D. Dzierżanowska, S. Tyski EVALUATION OF BIOFILM FORMATION BY STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM SPUTUM OF CYSTIC FIBROSIS PATIENTS SUMMARY The purpose of this study was to evaluate two screening methods for detection of biofilm formation by eighty clinical Staphylococcus aureus isolates from patients with cystic fibrosis, and evaluation of biofilm production on the polystyrene 96-well tissue culture plates, depending on media applied. All clinical strains were incubated in three different media: Luria Bertani broth (LB), tryptic soy broth supplemented with 2% glucose (TSB glu ) and brain heart infusion (BHI). Biofilm production was screened by staining with crystal violet (CV) or with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). Both CV and TTC assays showed, that all analyzed isolates created biofilm, in all tested media, however with different intensity. In conclusion, the CV method was found to be more sensitive than the TTC method, when we need information about whole mass of biofilm. The most optimal medium for the biofilm culture was LB medium. PIŚMIENNICTWO 1. Bartoszewicz M, Rygiel A, Krzemiński M, Przondo-Mordarska A. Penetration of a selected antibiotic and antiseptic into a biofilm formed on orthopedic steel implants. Ortop Traumatol Rehabil. 2007; 9: 310 18.
8 A. Pietruczuk-Padzik i inni Nr 1 2. Bendouah Z, Barbeau J, Hamad WA, Desrosiers M. Biofilm formation by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa is associated with an unfavorable evolution after surgery for chronic sinusitis and nasal polyposis. Otolaryngol Head Neck Surg. 2006; 134: 991 6. 3. Bryers JD. Medical Biofilms. Biotechnol. Bioeng. 2008; 100: 1 18. 4. Burmølle M, Webb JS, Rao D i inni. Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72: 3916 23. 5. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science 1999; 284: 1318 22. 6. Davey ME, O Toole GA. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64: 847 67. 7. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 167 93. 8. Gabrielson J, Hart M, Jarelov A i inni. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. J. Microbiol. Methods 2002; 50: 63 73. 9. Gilbert P, Das J, Foley I. Biofilm susceptibility to antimicrobials. Adv. Dent. Res. 1997; 11: 160 7. 10. Kalicińska A, Tyski S. Analiza wzrostu biofilmu Pseudomonas aeruginosa w zależności od warunków namnażania szczepów i barwienia biofilmu. Med. Dośw. Mikrobiol. 2009; 61: 243 52. 11. Knobloch JK-M, Horstkotte MA, Rohde H, Mack D. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in Staphylococcus aureus. Med. Microbiol. Immunol. 2002; 191: 101 6. 12. Mandal S, Berendt AR, Peacock SJ. Staphylococcus aureus bone and joint infection. J. Infect. 2002; 44: 143 51. 13. Molina A, Del Campo R, Máiz L i inni. High prevalence in cystic fibrosis patients of multiresistant hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST228-SCCmecI capable of biofilm formation. J. Antimicrob. Chemother. 2008; 62: 961 7. 14. Moreau-Marquisa S, Stantona BA, O Toole GA. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 2008; 21: 595 9. 15. Murraya TS, Egana M, Kazmierczak BI. Pseudomonas aeruginosa chronic colonization in cystic fibrosis patients. Curr. Opin. Pediatr. 2007; 19: 83 8. 16. Ratjen F, Döring G. Cystic fibrosis. Lancet 2003; 361: 681 9. 17. Saiman L. Microbiology of early CF lung disease. Paediatr Respir Rev. 2004; 5: 367 9. 18. Semczuk K, Dzierżanowska-Fangrat K, Dmeńska H, Dzierżanowska D. Ocena wytwarzania biofilmu przez szczepy Staphylococcus aureus izolowane od dzieci chorych na mukowiscydozę. Med. Dośw. Mikrobiol. 2008; 60: 311 8. 19. Trafny EA. Powstawanie biofilmu Pseudomonas aeruginosa i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych. Post. Microbiol. 2000; 39: 55 71. 20. Wagner VE, Iglewski BH. P. aeruginosa biofilms in CF infection. Clin Rev Allergy Immunol. 2008; 35: 124 34. Otrzymano: 11 I 2010 r. Adres Autora: 02-007 Warszawa, ul. Oczki 3, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny e-mail: anna.pietruczuk@gmail.com