Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX) Gotowy premix zawierający polimerazę hot-start i barwnik fluorescencyjny EvaGreen do analiz Real-time PCR HRM (zawiera barwnik referencyjny ROX) Numery katalogowe: EVG-0500R (500 reakcji) EVG-1000R (1000 reakcji) Wydanie 1 (Listopad 2012) Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, NIP 9721099648, email info@novazym.com, www.novazym.com
1. Przeznaczenie Premix przeznaczony jest do prowadzenia reakcji PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR) oraz analizą profilu topnienia w wysokiej rozdzielczości (ang. High Resolution Melting HRM). W Real-time PCR wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne lub sondy molekularne w celu monitorowania przyrostu ilości produktu amplifikacji, w każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym. Dzięki temu cała procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap rozdziału i oceny produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości DNA w matrycy podanej do reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej reakcji PCR. Ponadto ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest minimalizowane dzięki temu, że reakcja i detekcja produktu odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu. AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix jest gotową do użycia mieszaniną do prowadzenia analizy qpcr i HRM. Premix zawiera wszystkie niezbędne komponenty reakcji, czyli: polimerazę hot-start, mieszaninę ultra czystych dntps [10 pmol/µl], MgCl 2, barwnik referencyjny ROX oraz wiążący się do dsdna barwnik EvaGreen, umożliwiający analizę produktów PCR metodą HRM. Aby przygotować reakcję, należy do premixu dodać wodę, startery oraz matrycę DNA. Polimeraza hot-start jest aktywowana przez 15-minutową inkubację w 95 C. Ta właściwość uniemożliwia wydłużanie starterów, które hybrydyzują do matrycy w miejscach niespecyficznych oraz zapobiega powstawaniu dimerów starterów w niskiej temperaturze podczas reakcji qpcr. EvaGreen jest barwnikiem fluorescencyjnym nowej generacji, który wiąże się ilościowo do dwuniciowego DNA. W przypadku braku dsdna fluorescencja pozostaje na bardzo niskim poziomie (1-4 % false positive). Zakres widma barwnika EvaGreen jest podobny do barwnika SYBR Green, jednakże wykazuje on kilka cech czyniących go idealnym do analiz HRM, tj. wysoka stabilność, nie inhibuje reakcji PCR oraz udowodniono, że nie jest mutagenny ani cytotoksyczny. EvaGreen jest kompatybilny z większością dostępnych platform do analizy Real-time PCR, po ustawieniu tych samych parametrów, jak dla SYBR Green lub FAM. EvaGreen jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy BIOTUM, INC. HRM (ang. High Resolution Melting) jest nowoczesną techniką umożliwiającą wykrywanie zmian genetycznych (m.in. SNP, mutacje, metylacje) w amplikonie PCR. Znacznie przewyższa i wykracza poza klasyczną analizę krzywych topnienia w Real-time PCR, pozwalając śledzić denaturację dwuniciowego DNA bardzo szczegółowo i uzyskać większą ilość informacji na temat przebiegu tego procesu, niż za pomocą jakiejkolwiek wcześniejszej techniki. Produkty reakcji można klasyfikować w zależności od ich sekwencji, długości, zawartości zasad GC lub komplementarności nici. Technika umożliwia nawet analizę zmian pojedynczych nukleotydów, takich jak SNP (ang. single nucleotide polymorphism). Mutacje w produktach PCR wykrywa się w oparciu o zmianę w kształcie krzywej topnienia produktu PCR. 2
2. Zasada działania testu W reakcji Real-time PCR analizowany jest przyrost ilości produktu w czasie rzeczywistym. Przyrost ilości kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowany w każdym cyklu reakcji amplifikacji. W technice Real-time PCR wyznacznikiem początkowej ilości matrycy DNA w reakcji jest ilość cykli (C T ), po których kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Ilość produktu w reakcji PCR wzrasta wykładniczo z każdym cyklem, aż do momentu, wyczerpania się któregoś z komponentów reakcji. Zawartość zestawu Lp. KOLOR ELEMENT 500 reakcji 1000 reakcji [1] Fioletowy AmpliQ 5x HOT EvaGreen 1 4 HRM Mix (ROX) [2] Żółty MgCl 2 [25 mm] 1 1 [3] Biały H 2 O MQ do reakcji PCR 1 1 Skład mieszaniny AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX) Polimeraza DNA hot-start Bufor reakcyjny 5x EvaGreen HRM MgCl 2 12.5 mm Mix dntps 10 pmol/µl Barwnik EvaGreen BSA Barwnik referencyjny ROX. Przechowywanie -20 C Chronić przed światłem Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. 3. Przeprowadzenie testu PCR Zalecany program reakcji Real-time PCR HRM Etap reakcji Denaturacja wstępna Amplifikacja Metoda Ilość Temperatura Czas Pomiar analizy cykli fluorescencji - 1 95 C 15 min - Quantification (2) 40 denaturacja 95 C 15 s - hybrydyzacja (1) 60-65 C 20 s - elongacja 72 C 20 s single Krzywa Melting 1 denaturacja 90 C 15 s topnienia hybrydyzacja 75 C 15 s elongacja 95 C 0 s continuous slope = 0,1 C/s Chłodzenie - 1 40 C 30 s 3
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Lp. SKŁADNIK OBJĘTOŚĆ STĘŻENIE KOŃCOWE [1] AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix [5x] (1) 4 µl [1x] [2] Starter forward [10 pmol/µl] 0,16 0,5 µl [80 250 nm] [3] Starter reverse [10 pmol/µl] 0,16 0,5 µl [80 250 nm] [4] [5] Matryca DNA Opcjonalnie MgCl 2 MgCl 2 [25 mm] 1-5 µl [0,01 10 ng/µl] należy dostosować [6] H2O MiliQ do 20 µl RAZEM 20 µl [2.5 5 mm] (1) Premix AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix [5x] zawiera w swoim składzie MgCl 2 w stężeniu 12.5 mm. Stężenie końcowe MgCl 2 w reakcji 1x PCR wynosi 2.5 mm. Stężenie MgCl 2 zaleca się modyfikować w zakresie 2.5 5 mm. 4. Interpretacja najczęściej spotykanych problemów w reakcji PCR W przypadku braku produktu lub pojawienia się niespecyficznych produktów reakcji PCR zalecamy przeprowadzenie optymalizacji metody poprzez zastosowanie: gradientu temperatury hybrydyzacji starterów w zakresie +/- 5 C od średniej Tm starterów gradientu stężenia MgCl 2 w zakresie od 1.5-5 mm kontroli pozytywnej reakcji, pozwalającej ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu kontroli negatywnej reakcji, pozwalającej ocenić czystość odczynników używanych do reakcji PCR (zamiast matrycy DNA do reakcji należy podać tę samą objętość wody). Lot nr Exp. date Ograniczenia w zastosowaniu: Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków. UWAGA! Pewne składniki buforu reakcyjnego oraz buforu służącego do przechowywania mogą działać silnie drażniąco. Radzimy podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. 4
SHORT ENGLISH PROTOCOL Description: AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX) is an optimized ready-to-use solution for High Resolution Melt (HRM) Analysis, incorporating EvaGreen dye. It comprises all the components necessary to perform qpcr and HRM Analysis: hotstart DNA Polymerase, 10 pmol/µl ultrapure dntps, MgCl 2 and EvaGreen dye and ROX dye according to system requirements. The user simply needs to add water, template and primers. Hot-start DNA Polymerase is activated by a 15 min incubation step at 95 C. This prevents extension of non-specifically annealed primers and primer-dimers formed at low temperatures during qpcr setup. Applications: High Resolution Melt (HRM) Mix Composition: Hot-start DNA Polymerase 5x EvaGreen HRM buffer MgCl 2 12.5 mm (1x PCR solution - 2.5 mm MgCl 2 ) dntps mix 10 pmol/µl EvaGreen dye BSA ROX dye EvaGreen Dye: EvaGreen is a DNA-binding dye with many features that make it a superior for HRM. Apart from having similar spectra, EvaGreen has three important features that set it apart from SYBR Green I: EvaGreen has much less PCR inhibition, is extremely stable dye and has been shown to be nonmutagenic and noncytotoxic. EvaGreen is compatible with all common real-time PCR cyclers - simply select the standard settings for SYBR Green or FAM! Shipping and Storage conditions: Routine storage: -20 C Shipping and temporary storage for up to 1 month at room temperature has no detrimental effects on the quality of AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX). Recommended qpcr reaction mix: AmpliQ 5x HOT 4 µl 1x EvaGreen HRM Mix Primer For [10 µm] 0.16-0.5 µl 80-250 nm Primer Rev [10 µm] 0.16-0.5 µl 80-250 nm DNA template 1-5 µl 0.01-10 ng/µl H2O PCR grade up to 20 µl Recommended qpcr cycles: For HRM step please use settings recommended by producer: Initial 95 C 15 min x1 denaturation Denaturation 95 C 15 s Annealing 60-65 C 20 s x40 Elongation 72 C 20 s Safety warnings and precautions: This product and its components should be handled only by persons trained in laboratory techniques. It is advisable to wear suitable protective clothing, such as laboratory overalls, gloves and safety glasses. Care should be taken to avoid contact with skin or eyes. In case of contact with skin or eyes, wash immediately with water. EvaGreen is a registered trademark of BIOTIUM, INC. The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer, where such research does not include testing, analysis or screening services for any third party in return for compensation on a per test basis. The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product, (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. LightCycler is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Some applications this product is used in may require a license which is not provided by the purchase of this product. Users should obtain the license if required. 5