Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych

PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 2, str. 163 176 MAGDALENA WOŹNIACKA, AGNIESZKA WIERZBOWSKA Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych Angiogenesis in myelodysplastic syndromes Z Kliniki Hematologii UM w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE Angiogeneza jest zjawiskiem polegającym na tworzeniu nowych naczyń krwionośnych z uprzednio istniejącej sieci naczyniowej. W ostatnich latach udowodniono istotną rolę tego procesu w patogenezie guzów litych a takŝe nowotworów układu krwiotwórczego. Do oceny angiogenezy wykorzystuje się pomiar gęstości drobnych naczyń krwionośnych (MVD microvessel density) w szpiku kostnym, oznaczenie stęŝenia cytokin angiogennych w surowicy krwi, szpiku i cytoplazmie proliferujących komórek oraz liczby krąŝących komórek śródbłonka (CECs circulating endothelial cells) we krwi obwodowej. U chorych na zespoły mielodysplastyczne (MDS myelodysplastic syndromes) obserwowano znamiennie większą gęstość drobnych naczyń krwionośnych w szpiku kostnym. Wykazano takŝe istotnie wyŝsze stęŝenie wielu czynników angiogennych np. naczyniowo śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF vascular endothelial growth factor), zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bfgf basic fibroblast growth factor), angiogeniny, czynnika wzrostu hepatocytów (HGF hepatocyte growth factor), czynnika martwicy nowotworów α (TNFα tumor necrosis factor α) w osoczu chorych na MDS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Wyniki najnowszych badań wskazują, Ŝe ocena liczby krąŝących komórek śródbłonka (CECs circulating endothelial cells) i ich prekursorów (CEPs circulating endothelial precursors) moŝe być nieinwazyjnym markerem procesu angiogenezy w MDS. Dokładne poznanie mechanizmów kontrolujących zjawisko angiogenezy stwarza moŝliwość wprowadzenia nowych metod leczniczych. Wyniki pierwszych prób klinicznych z wykorzystaniem inhibitorów angiogenezy wskazują, Ŝe leki te mogą w przyszłości znaleźć zastosowanie w leczeniu zespołów mielodysplastycznych. SŁOWA KLUCZOWE: Zespół mielodysplastyczny Angiogeneza Etiopatogeneza VEGF Leczenie SUMMARY Angiogenesis is the formation of new blood vessels from an existing vasculare. It is established that growth of solid tumors and hematological malignancies depends on angiogenesis. The measurement of microvessel density (MVD) in the bone marrow, levels of angiogenic factors and circulating endothelial cells in plasma appears to be the most reliable method of assessing angiogenic activity. In patients with myelodysplastic syndromes (MDS) MVD in the bone marrow and levels of various angiogenic factors in plasma including vascular endothelial growth factor VEGF, basic fibroblast growth factor bfgf, angiogenin, hepatocyte growth factor HGF, tu-

164 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA mor necrosis factor α TNFα are significantly higher compared to healthy controls. Recently it has been shown that the level of circulating endothelial cells CECs and circulating endothelial precursors CEPs can be a noninvasive marker of angiogenesis in patients with MDS. The precise determination of regulation of angiogenesis may be the background for introduction of new treatment methods. The results of the first clinical trials show that the inhibitors of angiogenesis can be useful for the treatment of hematological malignancies. KEY WORDS: Myelodysplastic syndrome Angiogenesis VEGF Pathogenesis Treatment ETIOLOGIA I PATOGENEZA ZESPOŁÓW MIELODYSPLASTYCZNYCH Zespoły mielodysplastyczne (MDS) są heterogenną grupą klonalnych chorób układu krwiotwórczego, w przebiegu których dochodzi do nowotworowej transformacji wielopotencjalnej, macierzystej komórki szpiku kostnego. Charakterystyczną cechą MDS jest nieefektywna hematopoeza. WyraŜa się ona postępującą cytopenią we krwi obwodowej pomimo prawidłowej, a często nawet zwiększonej komórkowości szpiku kostnego (1, 2). MDS jest jednym z najczęstszych nowotworów układu krwiotwórczego u osób powyŝej 60 r.ŝ. W naturalnym przebiegu klinicznym zespoły mielodysplastyczne z róŝną szybkością ewoluują w kolejne, coraz bardziej zaawansowane stadia, a część z nich ulega transformacji do ostrej białaczki szpikowej (OBS). Rokowanie chorych na MDS jest niepomyślne, a jedyną, jak dotąd, skuteczną metodą leczenia pozostaje allogeniczny przeszczep szpiku kostnego. Dlatego teŝ szczególnie u chorych w podeszłym wieku, u których transplantacja wiąŝe się z bardzo du- Ŝym ryzykiem, brak jest efektywnej metody pozwalającej na całkowite wyleczenie (3). W rzadkich przypadkach MDS moŝe rozwijać się takŝe u dzieci, u których choroba charakteryzuje się bardziej agresywnym przebiegiem klinicznym, większym odsetkiem transformacji białaczkowej i krótszym czasem przeŝycia (3, 4). MDS moŝe mieć charakter pierwotny (p-mds) lub wtórny (w-mds), gdy rozwija się na skutek wcześniejszego naraŝenia na cytostatyki (głównie leki alkilujące oraz inhibitory topoizomerazy II) i radioterapię (5). Wtórne zespoły mielodysplastyczne opisywano u około 20% chorych na chłoniaki nieziarnicze leczonych za pomocą wysokodawkowanej chemioterapii wspomaganej przeszczepieniem autologicznych komórek krwiotwórczych (6). Etiologia pierwotnych zespołów mielodysplastycznych wiązana jest z naraŝeniem na benzen oraz inne petrochemikalia a takŝe paleniem tytoniu oraz niektórymi infekcjami wirusowymi. Anemia Fanconiego jest równieŝ czynnikiem ryzyka rozwoju MDS (5). Rozwój OBS na podłoŝu MDS obserwowany jest w 20% p-mds i 70% w-mds (7). PATOGENEZA MDS Patogeneza MDS nie jest w pełni poznana. Wyniki ostatnich badań wskazują, Ŝe jest to złoŝony, wielostopniowy proces, w czasie którego dochodzi do licznych mutacji w komórce macierzystej pnia, prowadzących do powstania onkogenów promujących

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 165 wzrost nieprawidłowych klonów komórkowych (3, 8). Anomalie chromosomowe w klasycznym badaniu cytogenetycznym stwierdza się w 40 70% przypadków p-mds (Ryc. 1) i u około 95% osób z w-mds (Ryc. 2) (9). Do najczęściej spotykanych Pierwotny MDS Wspólnie 5/7 15% Defekt 7 8% Prawidłowy 40% Defekt 5 8% Defekt 17p 5% +8 10% -Y 7% del(20q) 5% t(11q23) 2% Ryc. 1. Najczęstsze zmiany w genomie w pierwotnym zespole mielodysplastycznym (9). Fig. 1. The most common cytogenetic abnormalities in primary myelodysplastic syndrome. Wspólnie 5/7 22% Wtórny MDS t(11q23) 3% Prawidłowy 8% t(21q22) 3% inv(16) 2% t(15;17) 2% Inne 13% Defekt 7 26% Defekt 5 21% Ryc. 2. Najczęstsze zmiany w genomie we wtórnym zespole mielodysplastycznym (9). Fig. 2. The most common cytogenetic abnormalities in secondary myelodysplastic syndrome.

166 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA aberracji cytogenetycznych zalicza się delecje chromosomów 5, 7, 13, 17, 20 i Y oraz trisomię chromosomu 8. Na poziomie genomu w przebiegu MDS obserwuje się hipermetylację DNA i deacylację histonów genów regulujących cykl komórkowy oraz mutacje punktowe w obrębie genów ras, fms i p53. Dotychczas nie wykryto jednak defektów molekularnych swoistych dla MDS (10, 11). W wyniku nieprawidłowości genetycznych w MDS dochodzi do zaburzenia równowagi pomiędzy aktywnością proliferacyjną komórek układu krwiotwórczego a ich apoptozą (12). Badania Parker i wsp. (13) wykazały znamiennie większą apoptozę CD34 + komórek szpiku kostnego u chorych z niedokrwistością oporną na leczenie (RA refractory anemia), z niedokrwistością oporną na leczenie z obecnością pierścieniowych syderoblastów (RARS refractory anemia with ringed sideroblasts) oraz u chorych z niedokrwistością oporną na leczenie z nadmiarem blastów (RAEB - refractory anemia with excess blasts) w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (p < 0,0001). Wykazano takŝe, Ŝe u chorych z MDS typu RA i RARS odsetek komórek apoptotycznych jest istotnie wyŝszy niŝ odsetek proliferujacych komórek CD34 + (stosunek A:P = 2,08 [zakres 1,15 3,63]). Natomiast u chorych z RAEB stosunek A:P wynosił 1,14 [0,93 2,08], co wynika przede wszystkim z istotnego wzrostu indeksu proliferacyjnego komórek CD34 +. U chorych z niedokrwistością oporną na leczenie z nadmiarem blastów w fazie transformacji (RAEB-t refractory anemia with excess blasts in transformation) i ostrą białaczką szpikową na podłoŝu MDS (MDS-OBS) odsetek komórek ulegających apoptozie jest znamiennie niŝszy niŝ u chorych z RA i RARS i jest porównywalny z wartościami obserwowanymi w grupie osób zdrowych. Autorzy ci zaobserwowali takŝe, Ŝe stosunek ekspresji proapoptotycznych białek Bax/Bad do antyapoptotycznych Bcl-2/Bcl-X jest podwyŝszony u chorych z RA i RARS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. JednakŜe progresja choroby wiąŝe się ze znamiennym przesunięciem równowagi na korzyść Bcl-2 (p < 0,0001). Stwierdzono odwrotną korelację pomiędzy stopniem nasilenia apoptozy oraz współczynnikiem Bax/Bad do Bcl- 2/Bcl-X a stopniem IPSS (International Prognostic Scoring System Międzynarodowy System Prognostyczny). U chorych z niskim ryzykiem transformacji w OBS obserwowano zwiększenie apoptozy i ekspresji proapoptotycznych białek Bax/Bad w stosunku do antyapoptotycznych białek Bcl-2/Bcl-X. U chorych na MDS opisywano takŝe wysoką ekspresję proapoptotycznego białka Fas/CD95 oraz jego związek z nieefektywną erytropoezą (14, 15). W 1982 r. grupa robocza FAB (French, American, British) zaproponowała wytyczne, które w sposób uporządkowany pozwoliły na klasyfikację i diagnozę zespołów mielodysplastycznych. W oparciu o obecność blastów we krwi i szpiku kostnym, ilość pierścieniowych syderoblastów oraz stopień monocytozy wyróŝniono 5 podtypów MDS (16). W 2001 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) opublikowała nową klasyfikację nowotworowych chorób układu krwiotwórczego i chłonnego. Zaproponowane zmiany dotyczyły takŝe MDS i objęły obniŝenie ilości blastów we krwi i szpiku kostnym definiującej ostrą białaczkę szpikową z 30 do 20%, eliminację podtypu RAEB-t

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 167 oraz zaliczenie przewlekłej białaczki mielomonocytowej (CMML) do chorób mielodysplastyczno-mieloproliferacjnych (17). ANGIOGENEZA Angiogeneza jest zjawiskiem polegającym na tworzeniu nowych naczyń krwionośnych z uprzednio istniejącej sieci naczyniowej. Proces ten występuje zarówno w trakcie rozwoju embrionalnego jak i postnatalnie i obejmuje degradację zewnątrzkomórkowego zrębu, aktywację, proliferację i migrację komórek śródbłonka oraz pericytów a takŝe równoczesną aktywację sieci rozmaitych cytokin i cząsteczek adhezyjnych (18, 19). Odgrywa on znaczącą funkcję w zjawiskach fizjologicznych takich jak embriogeneza, owulacja, powstawanie łoŝyska i gojenie się ran, lecz jest równieŝ istotnym czynnikiem w patogenezie łuszczycy, twardziny czy reumatoidalnego zapalenia stawów (rzs) (20, 21). W ostatnich latach udowodniono, Ŝe proces nowotworzenia naczyń krwionośnych w znamienny sposób przyczynia się do rozwoju guzów litych i nowotworów układu krwiotwórczego, w tym takŝe zespołów mielodysplastycznych (22). Istotą procesu angiogenezy jest zaburzenie delikatnej równowagi pomiędzy czynnikami pro- i antyangiogennymi (23) (Tabela 1). Tabela 1. Czynniki pobudzające i hamujące angiogenezę. Table 1. Stimulators and inhibitors of angiogenesis. Czynniki proangiogenne Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF vascular endothelial growth factor) Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bfgf basic fibroblast growth factor) Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF hepatocyte growth factor) Interleukina-6 (IL-6) Interleukina-8 (IL-8) Płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF plateletderived growth factor) Transformujący czynnik wzrostu-β (TGF- α- transforming growth factor-β) Czynnik martwicy nowotworów-α (TNF-α - tumor necrosis factor) Transformujący czynnik wzrostu-β (TGF - β - transforming growth factor-β) Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF epidermal growth factor) Angiopoetyna-1 Angiogenina Angiotropina Integryna-αvβ3 Integryna-αvβ1 Integryna-αvβ5 Czynniki antyangiogenne Angiostatyna Endostatyna Interferon-α Interferon-γ Trombospondyna Fibronektyna Płytkowy czynnik 4 Interleukina-1 (IL-1) Interleukina-12 (IL-12) Kwas retinowy Thalidomid Tkankowy inhibitor metaloproteinaz

168 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA Głównymi cytokinami stymulującymi neowaskularyzację są: naczyniowośródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF vascular endothelial growth factor) oraz zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bfgf basic fibroblast growth factor). VEGF jest białkiem o masie 34-42-kDa kodowanym przez gen zlokalizowany w obrębie chromosomu 6 (6p21.3). WyróŜnia się 5 izoform tej proteiny: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 i VEGF 206, które swój efekt biologiczny wywierają poprzez wiązanie się z jednym z trzech, jak dotąd poznanych receptorów: VEGFR-1 (Flt- 1 FMS-like tyrosine kinase-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1 fetal liver kinase-1), VEG- FR-3 (Flt-4) naleŝących do grupy receptorów kinazy tyrozynowej (19, 24). RóŜnice w ekspresji receptorów VEGF w poszczególnych tkankach sugerują, Ŝe kaŝdy z nich posiada odrębną funkcję. U dorosłych ekspresję VEGFR-1 i VEGFR-2 spotyka się przede wszystkim w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, natomiast VEGFR- 3 znajduje się głównie w endotelium naczyń chłonnych (25). Cytokina ta uwaŝana jest za najistotniejszy czynnik kontrolujący procesy angiogenezy zarówno w Ŝyciu embrionlnym jak i w przebiegu chorób nowotworowych (26). VEGF reguluje rozwój krwiotwórczych komórek pnia, odpowiada za remodeling zrębu zewnątrzkomórkowego, wytwarzanie cytokin prozapalnych i proangiogennych oraz nieprawidłową lokalizację niedojrzałych komórek krwiotwórczych w obrębie szpiku kostnego (27, 28). bfgf naleŝy do rodziny dziewięciu strukturalnie podobnych mitogenów polipeptydowych. Gen odpowiedzialny za ekspresję tej cytokiny znajduje się na chromosomie 4 (29). Obecnie znane są 4 typy receptorów dla FGF, które naleŝą do rodziny receptorów kinazy tyrozynowej. bfgf poprzez pobudzenie aktywności kolagenaz powoduje niszczenie błony podstawnej, a co za tym idzie doprowadza do wzrostu przepuszczalności naczyń krwionośnych. Wykazano równieŝ chemotaktyczny wpływ tego czynnika na komórki endotelium (30). HGF wpływa na angiogenezę poprzez stymulację proliferacji, migracji i adhezji komórek śródbłonka a takŝe poprzez pobudzenie syntezy czynników proangiogennych przez komórki zrębu szpiku kostnego (31). HGF produkowany jest przede wszystkim przez komórki pochodzenia mezenchymalnego fibroblasty i komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a swój efekt biologiczny wywiera poprzez znajdujący się na powierzchni komórek receptor Met kodowany przez protoonkogen c-met (32). HGF zwiększa takŝe ekspresję VEGF w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (33). METODY OCENY ANGIOGENEZY Do oceny angiogenezy w szpiku kostnym stosowana jest najczęściej metoda immunohistochemiczna, polegająca na pomiarze gęstości naczyń włosowatych w szpiku (microvessel density MVD) po uprzednim wybarwieniu komórek śródbłonka naczyniowego za pomocą przeciwciał monoklonalnych anty-cd31, CD34, Ulex europeus (UEA-1) lub przeciwciał przeciwko antygenowi związanemu z czynnikiem VIII (factor VIII-related antigen, FVIIIrAg) (23). Pewnym ograniczeniem tej techniki jest brak swoistego markera komórek śródbłonka. Wykazano bowiem, Ŝe przeciwciało anty-

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 169 CD31 wiąŝe się równieŝ z płytkami krwi, megakariocytami i plazmocytami, anty- CD34 reaguje z prekursorami linii mieloidalnej a UEA-1 z komórkami podścieliska oraz linii erytrocytarnej (34). Inną metodą oceny angiogenezy jest pomiar stęŝenia cytokin proangiogennych w surowicy krwi, szpiku i cytoplazmie proliferujących komórek przy uŝyciu metody immunoenzymatycznej (ELISA), Western-blotu lub badań molekularnych. JednakŜe oznaczenia te mogą być obarczone pewnym błędem ze względu na fakt, Ŝe dodatkowym źródłem cytokin np. VEGF czy bfgf mogą być płytki krwi (25, 35 37). W ostatnich latach wykazano, Ŝe oznaczanie za pomocą cytometrii przepływowej liczby krąŝących komórek śródbłonka (CECs circulating endothelial cells) we krwi obwodowej moŝe słuŝyć do oceny i monitorowania angiogenezy w chorobach nowotworowych (38). Złotym standardem oceny nasilenia procesów angiogenezy pozostaje nadal pomiar gęstości drobnych naczyń krwionośnych (MVD). ANGIOGENEZA W MDS MVD U chorych na MDS wykazano znamiennie większą MVD w trepanobioptatach szpiku kostnego w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (p = 0,0004), natomiast powierzchnia ocenianych naczyń krwionośnych nie róŝniła się istotnie statystycznie (p = 0,06). Brak róŝnic wynika najprawdopodobniej z nadmiernej komórkowości szpiku kostnego w przebiegu MDS i zapadania się ścian drobnych naczyń krwionośnych na skutek ucisku przez proliferujące komórki układu krwiotwórczego. Hipotezę tą potwierdzają badania Albitara i wsp. (35), w których obserwowano znamienny wzrost powierzchni drobnych naczyń krwionośnych przy niezmienionej ich liczbie w 14 dobie od rozpoczęcia chemioterapii. JednakŜe w dalszych etapach leczenia obserwuje się równieŝ zmniejszenie MVD. Stifter i wsp. (39) wykazali istotnie mniejszą MVD w trepanobioptatach szpiku kostnego chorych na MDS leczonych chemioterapią w porównaniu z materiałem uzyskanym od chorych z nowo wykrytą chorobą (p = 0,01). Nie stwierdzono zaleŝności pomiędzy MVD w szpiku kostnym a czasem całkowitego przeŝycia (overall survival, OS) chorych na MDS. Wykazano dodatnią zaleŝność między MVD a komórkowością szpiku kostnego, co sugeruje istnienie licznych auto- i parakrynnych mechanizmów regulacyjnych pomiędzy prawidłowymi komórkami hematopoetycznymi, komórkami śródbłonka oraz komórkami nowotworowymi. Cytokiny proangiogenne Cytokiny proangiogenne uwalniane przez komórki nowotworowe stymulują w mechanizmie parakrynnym proliferację komórek śródbłonka i powstawanie nowej sieci naczyniowej, a w niektórych przypadkach są takŝe autokrynnymi czynnikami wzrostu. Proliferujące komórki endotelium uwalniają pod ich wpływem szereg czynników

170 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA wzrostowych stymulujących komórki śródbłonka, komórki zapalne i nowotworowe (40). W licznych badaniach oceniano stęŝenie róŝnych czynników proangiogennych w osoczu chorych na MDS. Aguayo i wsp. (41) wykazali znamiennie wyŝsze stęŝenie VEGF i bfgf w osoczu nieleczonych wcześniej chorych na MDS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (p < 0,01). JednakŜe, nie wykazano zaleŝności pomiędzy poziomem VEGF i bfgf a odpowiedzią na leczenie, przeŝyciem wolnym od objawów choroby (DFS; disease free survival) i czasem całkowitego przeŝycia. Albaitar i wsp. (35) ocenili stę- Ŝenie cytokin angiogennych w osoczu chorych na MDS przed i podczas terapii. StęŜenie VEGF i bfgf zmniejszyło się 14 dnia leczenia (odpowiednio p = 0,001 i p = 0,06); natomiast poziom TNF-α nie uległ znaczącym zmianom (p = 0,83). Wimazal i wsp. (42) metodą immunohistochemii z zastosowaniem przeciwciał anty-vegf zbadali ekspresję VEGF w utrwalonych parafiną próbkach szpiku kostnego chorych na MDS. Autorzy ci wykazali znamiennie wyŝszy poziom VEGF (ekspresja VEGF w niedojrzałych komórkach linii mieloidalnej) u chorych z podtypem RAEB, RAEB-t i CMML w porównaniu z chorymi z podtypem RA i RARS i grupą kontrolną osób zdrowych. TakŜe gęstość naczyń krwionośnych była znacznie większa u osób z RAEB-t i CMML w porównaniu z chorymi z RA i RARS oraz grupą osób zdrowych. Za pomocą metody rpcr (reverse transcriptase polymerase chain reaction) w komórkach nowotworowych wszystkich chorych wykryto ekspresję mrna dla VEGF. W licznych badaniach wykazano, Ŝe w komórkach nowotworowych pobranych od chorych na MDS wykrywa się ekspresję VEGF i jego receptorów (VEGFR-1 i VEG- FR-2) (35). Potwierdza to hipotezę, iŝ czynniki angiogenne wydzielane przez komórki nowotworowe promują ich własny wzrost i proliferację w mechanizmie auto- i parakrynnym oddziaływując przy tym na prawidłowe komórki hematopoetyczne i komórki podścieliska szpiku kostnego. Verstovsek i wsp. (25) wykazali, Ŝe wysoka ekspresja VEGF w komórkach szpiku kostnego jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym i koreluje z krótszym OS chorych na MDS (p = 0,008). Stwierdzono ponadto dodatnią korelację pomiędzy ekspresją VEGF i jego receptora VEGFR-2 (p = 0,0002) w komórkach. ZaleŜności takiej nie obserwuje się pomiędzy VEGF a VEGFR-1. Ponadto, Cortelezzi i wsp. (36) stwierdzili dodatnią zaleŝność pomiędzy stęŝeniem VEGF i jego rozpuszczalnego receptora svegfr-2 w surowicy chorych na MDS. Pozostaje to w zgodzie z doświadczalnymi obserwacjami sugerującymi istnienie autokrynnych mechanizmów regulacyjnych pomiędzy ligandami VEGF i jego receptorami na komórkach nowotworowych. Stwierdzono, Ŝe poziom svegfr-2 jest znamiennie podwyŝszony u chorych z niskim/średnim-1 (low/int-1) ryzykiem transformacji w OBS wg IPSS, w porównaniu z wartościami uzyskiwanymi u chorych z grupy INT-2/high, co nasuwa wniosek, Ŝe wpływ czynników proangiogennych na komórki nowotworowe wydaje się być bardziej istotny u chorych z mniej zaawansowaną chorobą niŝ w przypadku pacjentów z wyŝszych grup ryzyka, u których inne czynniki patogenetyczne mogą pełnić kluczową rolę. Hu i wsp. (43) wykazali niŝsze stęŝenie svegfr-2 w osoczu chorych na MDS,

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 171 którzy uzyskali całkowitą remisję (CR) w wyniku standardowej chemioterapii w porównaniu z grupą chorych bez CR (p = 0,04). Verstovsek i wsp. (32) oznaczyli stęŝenie HGF u 42 chorych na MDS. Autorzy ci wykazali, Ŝe poziom HGF jest istotnie wyŝszy w osoczu chorych niŝ u osób zdrowych (p < 0,0001). Stwierdzono ponadto dodatnią korelację pomiędzy stęŝeniem HGF w osoczu a ilością krwinek białych (WBC white blood count, p = 0,000001) i monocytów (p = 0,003). WyŜsze wartości HGF obserwowano u chorych w złym stanie ogólnym (p = 0,001). Nie wykazano natomiast istotnego wpływu tej cytokiny na czas całkowitego przeŝycia (p = 0,34). StęŜenie angiogeniny (ANG angiogenin) jest takŝe podwyŝszone w osoczu chorych z zaawansowanym MDS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (p < 0,00001) (22). Badania Alexandrakis i wsp. (44) wykazały, Ŝe zarówno MVD jak i poziom angiogeniny są znamiennie wyŝsze u chorych na MDS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (p < 0,01). W surowicy tych chorych stwierdzono takŝe podwyŝszone stęŝenie interleukiny-6 (IL-6), której poziom wykazuje odwrotną korelację z czasem przeŝycia chorych i stanowi niezaleŝny czynnik prognostyczny. Zaobserwowano równieŝ dodatnią korelację pomiędzy stęŝeniem ANG i IL-6 (p < 0,001) oraz między MVD i IL-6 (p < 0,05). TNF-α TNF-α to cytokina, która odgrywa rolę zarówno w procesie apoptozy jak i angiogenezy. Nadmierna apoptoza progenitorowych komórek szpiku kostnego, odpowiedzialna za nieefektywną hematopoezę i cytopenię we krwi obwodowej jest prawdopodobnie związana m.in. ze zwiększoną ekspresją czynnika martwicy nowotworów. TNF-α indukuje apoptozę m.in. poprzez zwiększenie ekspresji antygenu Fas na powierzchni komórek (45). Stifter i wsp. (39) zbadali ekspresję TNF-α w 57 utrwalonych w parafinie trepanobioptatach szpiku kostnego. Autorzy ci stwierdzili większą ekspresję tej cytokiny w prekursorowych komórkach linii erytroidalnej we wszystkich podtypach MDS (z wyjątkiem zespołu 5q-) w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. JednakŜe jedynie u chorych z podtypem RA róŝnica ta wykazywała znamienność statystyczną (p = 0,029). Wykazano ponadto dodatnią korelację pomiędzy ekspresją TNF-α a komórkowością szpiku kostnego (p = 0,019). Istnieją dane wskazujące, Ŝe TNF-α produkowany w szpiku kostnym przez komórki prekursorowe linii erytroidalnej oddziaływuje na nie w mechanizmie autokrynnym a jego ekspresja w komórkach tej linii koreluje z nasileniem niedokrwistości. U chorych z większą ekspresją TNF-α ( 10% prekursorowych komórek linii erytroidalnej) obserwowano znamiennie niŝsze stęŝenie hemoglobiny (Hb) niŝ w grupie o niskiej ekspresji TNF-α (<10% komórek szpiku) (p = 0,049). Podobnie w analizowanej grupie chorych wysoka ekspresja TNF-α ( 10% komórek) wiązała się z krótszym czasem przeŝycia.

172 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA TNF-α jako cytokina, której ekspresja w komórkach szpiku kostnego chorych na MDS związana jest z osłabieniem erytropoezy i skróceniem czasu przeŝycia, moŝe stanowić waŝny cel w terapii tych chorych, a w szczególności osób z hiperplastycznym szpikiem i znaczną anemią. KrąŜące komórki śródbłonka Ostatnie doniesienia wskazują, Ŝe proces angiogenezy moŝna oceniać równieŝ przy pomocy pomiaru ilości krąŝących komórek śródbłonka (CECs circulating endothelial cells) i ich prekursorów (CEPs circulating endothelial precursors). Zwiększoną liczbę CECs we krwi obwodowej opisywano w guzach litych a takŝe w niektórych nowotworach układu krwiotwórczego m.in. w szpiczaku mnogim, chłoniakach nieziarniczych i ostrych białaczkach (36, 46). Cortellezi i wsp. (36) wykazali, Ŝe liczba CECs, a takŝe ich form aktywowanych acecs (activated CECs) i prekursorowych CEPs we krwi obwodowej chorych na MDS mierzona za pomocą cytometrii przepływowej jest istotnie statystycznie wyŝsza niŝ w grupie kontrolnej osób zdrowych (p < 0,0001). W analizowanej grupie chorych stwierdzono ponadto dodatnią korelację między liczbą CECs a MVD. Wartości CECs nie róŝniły się znamiennie w poszczególnych podtypach wg FAB i IPSS. Podobnie nie stwierdzono zaleŝności pomiędzy liczbą CECs a czasem przeŝycia chorych. Wykazano, Ŝe stęŝenie bfgf koreluje z poziomem CECs i acecs, ale nie CEPs. PowyŜsze dane wskazują, Ŝe ocena liczby CECs, acecs i CEPs we krwi obwodowej moŝe być nieinwazyjnym markerem procesu angiogenezy w przebiegu MDS. Inhibitory angiogenezy Endostatyna jest jednym z najlepiej poznanych endogennych inhibitorów angiogenezy. Jest ona C-końcowym fragmentem kolagenu XVIII o masie 20-kD. Wykazano, Ŝe związek ten z wysoką skutecznością hamuje nowotworzenie naczyń krwionośnych i wzrost guzów litych (47). Lai i wsp. (48) nie wykazali znaczących róŝnic w stęŝeniu endostatyny w osoczu chorych na MDS i osób zdrowych, jednakŝe zauwaŝono, iŝ chorzy, którzy uzyskali całkowitą remisję mieli znacznie niŝsze wartości tego czynnika w osoczu. Poziom endostatyny wydaje się być niezaleŝnym czynnikiem prognostycznym (p = 0,03) w stosunku do całkowitego przeŝycia chorych. Autorzy wykazali bowiem związek pomiędzy wysokim stęŝeniem endostatyny (za punkt odcięcia przyjęto średnie stęŝenie endostatyny u osób zdrowych tj. 30,4 pg/ml) a krótszym czasem przeŝycia chorych na MDS. Prognostyczna wartość oceny poziomu endostatyny w osoczu chorych wydaje się być niezaleŝna od takich czynników jak wiek pacjenta czy jego przeszłość hematologiczna. Wysokie stęŝenie endostatyny u chorych o gorszym rokowaniu moŝe być wynikiem znacznego zaawansowania procesu angiogenezy. UwaŜa się bowiem, Ŝe źródłem enzymów, niezbędnych do odszczepiania endostatyny od kolagenu XVIII m.in. metaloproteinaz i katepsyny L są przede wszystkim komórki śródbłonka, fibroblasty, jednojądrowe komórki szpiku kostnego a takŝe blasty nowotworowe, których ilość w przebiegu MDS znacznie wzrasta.

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 173 TERAPIA ANTYANGIOGENNA U CHORYCH NA MDS Dokładne poznanie mechanizmów kontrolujących zjawisko angiogenezy stwarza moŝliwość wprowadzenia nowych metod leczniczych. Wiele naturalnie występujących w organizmie a takŝe syntetycznych inhibitorów procesu angiogenezy przechodzi obecnie próby kliniczne. Dotyczy to inhibitorów metaloproteinaz 1 i 2 (TIMP1 i 2), inhibitorów płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF platelet derived growth factor), kompetycyjnego inhibitora VEGFR-1 i VEGFR-2 (SU5416), a takŝe przeciwciał monoklonalnych anty - VEGF. Podjęto równieŝ próby zbadania skuteczności działania interferonu-α, IL-1, IL-12, kwasu retinowego, thalidomidu oraz przeciwciał przeciwko integrynom (23, 49). Takie podejście terapeutyczne wydaje się być bardzo obiecujące ze względu na znacznie mniejszą toksyczność leczenia. Silne działanie przeciwnowotworowe przeciwciał monoklonalnych zostało juŝ udowodnione w badaniach doświadczalnych na modelach zwierzęcych (50). W pierwszej fazie badań klinicznych, podczas terapii 25 pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową rak sutka, płuca, nerki, mięsaki mysimi, humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi anty-vegf (Bevacizumab) nie zaobserwowano toksycznego wpływu leku w dawkach do 10mg/kg mc (51). Preparat ten przechodzi obecnie II fazę badań klinicznych u pacjentów z MDS. Innym lekiem, z którym wiązane są nadzieje skuteczniejszego leczenia chorych na MDS jest trójtlenek azotu (arsenic trioxide ATO; Trisenox) stosowany jak dotąd u osób z ostrą białaczką promielocytarną. Wstępne badania wskazują, Ŝe ze względu na szeroki zakres działania, które obejmuje indukcję apoptozy, supresję proliferacji komórek nowotworowych i hamowanie procesu neowaskularyzacji związek ten moŝe być skuteczny takŝe w innych nowotworowych chorobach układu krwiotwórczego. ATO ingeruje w zasadnicze mechanizmy kontrolujące wzrost nowotworów układu krwiotwórczego. Jego działanie antyproliferacyjne jest zaleŝne od wpływu na proces uwalniania cytokin z komórek oraz ingerencji w cykl komórkowy. W czasie leczenia trójtlenkiem azotu obserwuje się wydłuŝenie tego cyklu. Powoduje on takŝe zatrzymanie komórek nowotworowych w fazie G 1 i na pograniczu faz G 2 /M. Ponadto ATO stymuluje indukcję apoptozy w komórkach śródbłonka nowopowstałych naczyń krwionośnych oraz hamuje produkcję VEGF przez komórki nowotworowe. Próby kliniczne z zastosowaniem tego leku u chorych na MDS wskazują, Ŝe moŝe być on skuteczny szczególnie u pacjentów wysokiego ryzyka z zaawansowaną zaleŝnością od przetoczeń. WaŜne jest takŝe, Ŝe lek ten jest dobrze tolerowany przez chorych (52). PODSUMOWANIE W ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w zakresie poznania patogenezy zespołów mielodysplastycznych i roli neowaskularyzacji w ich rozwoju. Odkrycia w tej dziedzinie i coraz dokładniejsze poznanie mechanizmów kontrolujących zjawisko angiogenezy stwarzają moŝliwość wprowadzenia nowych, skuteczniejszych i dających

174 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA szansę pełnego wyleczenia metod leczniczych. Terapia antyangiogenna za pomocą trójtlenku azotu czy przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko VEGF znajduje się obecnie w fazie prób klinicznych i daje zachęcające wyniki, co sugeruje, Ŝe w przyszłości moŝe to być alternatywna metoda terapii chorych na MDS, u których jak dotąd jedynie allogeniczny przeszczep szpiku kostnego daje moŝliwość skutecznego wyleczenia. PIŚMIENNICTWO 1. Steensma DP, Tefferi A. The myelodysplastic syndrome(s): a perspective and review highlighting current controversies. Leuk Res 2003; 27: 95-120. 2. Greenberg PL, Young NS, Gattermann N. Myelodysplastic syndromes. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2002; 136-61. 3. Look A.T. Molecular Pathogenesis of MDS. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2005; 156-60. 4. Luna-Fineman S, Shannon KM, Lange BJ. Childhood monosomy 7: epidemiology, biology and mechanistic implications. Blood 1995; 85: 1985-99. 5. Brunning RD, Bennett JM, Flandrin G. WHO classification of tumours: pathology and genetics of tumours of the haematopoietic and lymphoid tissues. 2001; (3): 61-73. 6. Friedberg JW, Neuberg D, Stone RM i wsp. Outcome in patients with myelodysplastic syndrome after autologous bone marrow transplantation for non-hodgkin`s lymphoma. J Clin Oncol. 1999; 17: 3128-3135. 7. Szymała K, Komarnicki M. Zespoły mielodysplastyczne. Współcz Onkol 2003; 7: 692-701. 8. Aul C, Bowen DT, Yoshida Y. Pathogenesis, etiology and epidemiology of myelodysplastic syndromes. Haematologica 1998; 83: 71-86. 9. Hellstrom-Lindberg E, Le Beau MM, List AF. The global changing approach to managing MDS. Highlights from a symposium presented during the 8 th International Symposium on Myelodysplastic Syndromes, which took place on May 13, 2005, in Nagasaki, Japan. 10. Uchida T, Kinoshita T, Nagai H i wsp. Hypermethylation of the p15 INK4h gene in myelodysplastic syndromes. Blood 1997; 90: 1403-09. 11. Padua RA, Guinn BA, Al-Sabah AI i wsp. RAS, FMS and p53 mutations and poor clinical outcome in myelodysplasias: a 10-year follow-up. Leukemia 1998; 12: 887-92. 12. Raza A, Alvi S, Borok RZ i wsp. Excessive proliferation matched by excessive apoptosis in myelodysplasyic syndromes: the cause-effect relationship. Leuk Lymphoma 1997; 27: 111-8. 13. Parker JE, Mufti GJ, Rasool F, Mijovic A, Devereux S, Pagliuca A. The role of apoptosis, proliferation and Bcl-2-related proteins in the myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia secondary to MDS. Blood 2000; 96: 3932-8. 14. Gersuk GM, Lee JW, Beckham CA, Anderson J, Deeg HJ. Fas (CD95) receptor and Fas-ligand expression in bone marrow cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood 1996; 88: 1122-3. 15. Fontenay-Roupie M, Bouscary D, Guesnu M i wsp. Ineffective erythropoiesis in myelodysplastic syndromes: correlation with Fas expression but not with lack of erythropoietin receptor signal transduction. Br J Haematol 1999; 106: 464-73. 16. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT i wsp. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. BR J Haematol 1982; 51: 198-99. 17. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. World Health Organisation classification of tumours: pathology and genetics of tumours of the haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2001. 18. Asahara T, Murohara T, Sullivan A i wsp. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964-7.

Angiogeneza w zespołach mielodysplastycznych 175 19. Klagsburn M, Moses MA. Molecular angiogenesis. Chem Biol 1999; 6: 217-24. 20. Cines DB, Pollak ES, Buck CA i wsp. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood 1998; 9: 3527-61. 21. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular rheumatoid arthritis and other diseases. Nature Med 1995; 1: 27-31. 22. Aguayo A, Giles F, Albitar M. Vascularity, Angiogenesis and Angiogenic Factors in Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Leuk Lymphma 2003; 44: 213-222. 23. Mangi MH, Newland AC. Angiogenesis and angiogenic mediators in haematological malignancies. Br J Haematol 2000; 111: 43-51. 24. Tischer E, Mitchell R, Hartman T i wsp. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 1991; 266: 11947-11954. 25. Verstovsek S, Estey E, Manshouri T i wsp. Clinical relevance of vascular endothelial growth factors 1 and 2 in acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome. Br J Haematol. 2002; 118: 151-156. 26. Ferrara N, Bunting S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Curr Opin Nephrol Hypertens 1996; 5: 35-44. 27. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989; 264: 1306-1309. 28. Bellamy WT, Richter L, Sirjani D i wsp. Vascular endothelial cell growth factor is an autocrine promoter of abnormal localized immature myeloid precursors and leukemia progenitor formation in myelodysplastic syndromes, Blood 2001; 97: 1427-34. 29. Mergia A, Eddy R, Abraham JA, Fiddes JC, Shows TB. The genes for basic and acidic fibroblast growth factors are on different human chromosomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 138, 644-651. 30. Chodak GW, Scheiner CJ, Zetter BR. Urine from patients with transitional-cell carcinoma stimulates migration of capillary endothelial cells. N Engl J Med 1981; 305: 869-874. 31. Jiang W, Hiscox S, Matsumoto K, Nakamura T. Hepatocyte growth factor/scatter factor, its molecular, cellular and clinical implications in cancer. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1999; 29: 209-248. 32. Verstovsek S, Kantarjian H, Estey E i wsp. Plasma hepatocyte growth factor is a prognostic factor in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia 2001; 15: 1165-1170. 33. Van Belle E, Witzenbichler B, Chen D i wsp. Potentiated angiogenic effect of scatter factor/ hepatocyte growth factor via induction of vascular endothelial growth factor: the case for paracrine amplification of angiogenesis. Circulation 1998; 97: 381-90. 34. Perez-Atayde AR, Sallan SE, Tedrow U, Connors S, Folkman J. Spectrum of tumor angiogenesis in marrow of children with acute lymphoblastic leukemia. Journal of Pathology 1997; 150: 815-21. 35. Albitar M. Angiogenesis in Acute Myeloid Leukemia and Myelodysplastic Syndrome. Acta Haematol. 2001; 106: 170-6. 36. Cortelezzi A, Fracchiolla NS, Moronetti Mazzeo L i wsp. Endothelial precursors and mature endothelial cells are increased in the peripheral blood of myelodysplastic syndromes. Leuk Lymphoma 2005; 46: 1345-1351. 37. Alexandrakis MG, Passam FH, Kyriakou DS i wsp. Expression of the proliferation-associated nuclear protein MIB-1 and its relationship with microvascular density in bone marrow biopsies of patients with myelodysplastic syndromes. J Mol Histol. 2004; 35: 857-63. 38. Mancuso P, Burlini A, Pruneri G, Goldhirsch A, Martinellu G, Bertolini F. Resting and activated endothelial cells are increased in the peripheral blood of cancer patients. Blood 2001; 97: 3658-3661. 39. Stifter G, Heiss S, Gastl G, Tzankov A, Stauder R. Over-expression of tumor necrosis factoralpha in bone marrow biopsies from patients with myelodysplastic syndromes: relationship to anemia and prognosis. Eur J Haematol 2005; 75: 485-491. 40. Wierzbowska A, Wrzesień-Kuś A, Robak T. Angiogeneza i jej znaczenie w biologii ostrej białaczki szpikowej. Acta Haematol Polonica 2002; 33: 5-17.

176 M. WOŹNIACKA, A. WIERZBOWSKA 41. Aguayo A, Kantarjian HM, Estey EH i wsp. Plasma vascular endothelial growth factor levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes. Cancer 2002; 95: 1923-30. 42. Wimazal F, Krauth MT, Vales A, Bohm A i wsp. Immunohistochemical detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the bone marrow in patients with myelodysplastic syndromes: correlation between VEGF expression and FAB category. Leuk Lymphoma. 2006; 47: 451-460. 43. Hu Q, Dey AL, Yang Y i wsp. Soluble vascular endothelial growth factor receptor 1, and not receptor 2, is an independent prognostic factor in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes Cancer 2004; 100(9): 1884-91. 44. Alexandrakis MG, Passam FH, Pappa CA i wsp. Relation between bone marrow angiogenesis and serum levels of angiogenin in patients with myelodysplastic syndromes. Leuk Res 2005; 29: 41-46. 45. Maciejewski J, Swlleri C, Anderson S, Young NS. Fas antigen expression on CD34 + human marrow cells is induced by interferon γ and tumor necrosis factor α and potentiates cytokine-mediated hematopoietic suppression in vitro. Blood 1995; 85: 3183-90. 46. Mancuso P, Colleoni M, Calleri A i wsp. Circulating endothelial-cell kinetics and viability predict survival in breast cancer patients receving metronomic chemotherapy. Blood 2006; 108: 452-9. 47. Halfer W, Dong S, Schurer B, Cole GJ. Collagen XVIII is a basement membrane heparan sulfate proteoglycan. J Biol Chem 1998; 273: 25404-12. 48. Lai R, Estey E, Shen Y i wsp. Clinical Significance of Plasma Endostatin in Acute Myeloid Leukemia/Myelodysplastic Syndrome. Cancer 2002; 94: 14-7. 49. Giles FJ, Stopeck AT, Lewis R i wsp. SU5416, a small molecule tyrosine kinase receptor inhibitor, has biologic activity in patients with refractory acute myeloid leukemia or myelodysplastic syndrome. Blood 2003; 102: 795-801. 50. Giles FJ. The vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway: a therapeutic target in patients with hematological malignancies. The oncologist 2001; 6 Suppl 5: 32-9. 51. Gordon MS, Margolin K, Talpaz M i wsp. Phase I safety and pharmacocinetic study of recombinant human anti-vascular endothelial growth factor in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 2001; 19: 843-50. 52. List A, Beran M, DiPersio J i wsp. Opportunities for Trisenox (arsenic trioxide) in the treatment of myelodysplastic syndromes. Leukemia 2003; 17: 1499-1507. Praca wpłynęła do Redakcji 15.02.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 8.06.2007 r. Adres do korespondencji: Katedra i Klinika Hematologii UM w Łodzi 93-513 Łódź, ul. Pabianicka 62 tel. 042 689 51 91, fax 042 690 51 92 e-mail: robaktad@csk.umed.lodz.pl