Streszczenie Metaloproteazy macierzy pozakomórkowej (MMP) należą do enzymów biorących udział w licznych procesach zarówno o charakterze fizjologicznym (np. jak gojenie się ran), jak również patologicznym, w tym przede wszystkim w onkogenezie. Ze względu na swój wielostronny wpływ na rozwój i progresję nowotworów złośliwych, nadekspresja genów kodujących MMP - zwłaszcza żelatynazę A i B (MMP-2 i MMP-9) - jest uważana za jeden z głównych czynników prognozujących nasiloną inwazyjność nowotworu. W pracy przedstawiono wyniki analizy wpływu wybranych tetracyklin (doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny), które wykazują zdolność do modulacji ekspresji i aktywności MMP, na inwazyjność komórek nowotworowych raka płuc oraz raka pęcherza in vitro (linie komórkowe A549 i T24). Do wyznaczenia optymalnych stężeń i czasu traktowania zastosowano test MTT. Następnie zbadano wpływ tetracyklin na ekspresję żelatynazy A i B na poziomie mrna i białka. Wykazano zależność ekspresji mrna genów kodujących żelatynazy od stężenia badanych modulatorów, choć różnice w zależności od użytego związku oraz linii komórkowej były dość istotne. Na poziomie białka, za pomocą zymografii, wykazano zależny od dawki spadek ekspresji obu żelatynaz we wszystkich badanych hodowlach. W kolejnym etapie badań analizowano wpływ badanych modulatorów MMP na efekty fenotypowe w hodowlach komórek nowotworowych. Wykazano istotny spadek potencjału inwazyjnego komórek obu linii po traktowaniu tetracyklinami - ruchliwość i migracja komórek nowotworowych w teście wound healing assay malała wraz ze wzrostem stężenia danego modulatora. Badanie adhezji komórek do białek matriżelu wykazało, iż proces ten jest silnie hamowany głównie przez tetracyklinę, jednak tylko w przypadku komórek raka płuc. Ogólnie najsilniejszy wpływ modulacyjny, zarówno na ekspresję żelatynaz, jak i na inwazyjność komórek nowotworowych, wykazała doksycyklina, co znajduje odzwierciedlenie w doniesieniach innych autorów. Słowa kluczowe: metaloproteazy macierzy pozakomórkowej (MMP), żelatynaza A i B (MMP-2 i MMP-9), tetracykliny, inwazyjność nowotworów, rak płuca, rak pęcherza. Abstract Matrix metalloproteinases (MMPs) are enzymes involved in numerous physiological (e.g. wound healing), as well as pathological processes where oncogenesis is the most significant one. Due to their multifunctionality in tumour promotion and progression, MMPs - especially gelatinase A and B (MMP-2, MMP-9) - overexpression is considered to be the major prognostic factor in cancer invasiveness. In this study we performed analysis of the influence of selected tetracyclines (doxycycline, oxytetracycline, tetracycline, and limecycline), which were postulated to be capable of modulating MMPs expression, on the lung cancer and bladder cancer cells invasiveness in vitro (A549 and T24 cell lines). MTT test was used to determine optimal concentrations and treatment intervals in the experiments. Then, we analysed the influence of the tetracyclines on gelatinase A and B expression both at mrna, and protein level. Generally, mrna expression depended on the concentration of the modulators, although there were significant differences depending on the cell line or modulator type. At the protein level there was a concentration-dependent decrease in the gelatinases expression in all studied cultures, as was ascertained zymographically. Further research was focused on the problem how MMP modulators effected cancer cells phenotype. Obtained results indicate there was a decrease in invasive potential of both cell lines after tetracyclines treatment; cell motility and migration decreased as the concentration of the certain modulator increased, as was shown in wound healing assay. Cell adhesion to matrigel proteins showed that only tetracycline performed significant inhibitory effect on that process in lung cancer cell cultures. Taken together our results indicated that the strongest inhibition on both gelatinases expression, and on cancer invasiveness was performed by doxycycline. These results are in concordance with other papers. Key words: matrix metalloproteinases (MMPs), gelatinase A and B (MMP-2 and MMP-9), tetracyclines, cancer invasiveness, lung cancer, bladder cancer. * Praca sfinansowana częściowo ze środków na badania własne (KNW-2-133/08) oraz statutowe ŚUM (KNW-1-145/08).
Wykaz skrótów: DPBS (Dulbecco s phosphate buffered saline) sól fizjologiczna buforowana fosforanami, EGF (epidermal growth factor) naskórkowy czynnik wzrostu, FBS (fetal bovine serum) bydlęca surowica płodowa, MMP (matrix metalloproteinases) metaloproteazy macierzy pozakomórkowej, MTT - bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, RNAi (RNA interference) interferencja RNA, TIMP (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases) tkankowe inhibitory metaloproteaz macierzy pozakomórkowej. Badania nad białkami z grupy metaloproteaz macierzy pozakomórkowej (MMPs matrix metalloproteinases) prowadzone są od ponad dwudziestu lat. Na ich podstawie wykazano, iż podstawowa funkcja tych enzymów, jaką jest proteolityczna degradacja i przebudowa białek macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływa zarówno na przebieg procesów fizjologicznych, takich jak gojenie ran, przebudowa i wzrost kości, apoptoza, jak i zjawisk patologicznych, z których szczególnie ważnym jest proces nowotworzenia. Udział MMP w rozwoju nowotworu jest szczególnie ważny, gdyż uczestniczą one we wszystkich jego etapach począwszy od wzrostu guza pierwotnego, angiogenezy, poprzez etap związany z przerwaniem integralności bariery błony podstawnej, naciekaniem okolicznych tkanek i przerzutowaniem mechanizmy związane z inwazyjnością komórek nowotworowych - aż po rozwój guzów wtórnych [1, 2, 3]. Równocześnie prowadzone są badania dotyczące inhibitorów MMP, mające na celu wprowadzenie ich do lecznictwa w terapii chorób nowotworowych. Istotą działania terapeutycznego inhibitorów MMP ma być zahamowanie funkcji enzymatycznej docelowych metaloproteaz, a w rezultacie zahamowanie rozwoju nowotworów [4, 5, 6]. Ekspresję i aktywność MMP reguluje wiele czynników o charakterze endogennym, jak też coraz liczniej opisywane czynniki zewnętrzne [7]. Badania nad inhibitorami MMP o zastosowaniu terapeutycznym dotyczą małocząsteczkowych związków niebiałkowych, w tym bifosfonianów i tetracyklin, naturalnych inhibitorów o budowie peptydowej (np. TIMP tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), jak też prób wykorzystania metod terapii genowej (np. interferencyjnego RNA RNAi, czy też aptamerów). Ponieważ prowadzone do tej pory próby wprowadzenia do lecznictwa leków z grupy białkowych, niebiałkowych inhibitorów oraz bifosfonianów zakończyły się niepowodzeniem, głównie z powodu poważnych działań niepożądanych występujących po zastosowaniu tych preparatów, w ostatnich latach szczególną uwagę skupiono na tetracyklinach, zarówno naturalnych, jak i ich półsyntetycznych pochodnych [8, 9]. Podstawową zaletą tej grupy leków jest szerokie spektrum działania inhibitorowego - odpowiadają za hamowanie aktywności zarówno kolagenaz, jak i żelatynaz oraz działanie na poziomie zarówno ekspresji genów, jak i aktywacji latentnych form MMPs. Istotną cechą tej grupy modulatorów jest też wysoka biodostępność po podaniu doustnym (wchłaniają się z przewodu pokarmowego w około 80%) oraz dobra penetracja tkanek - tetracykliny przenikają przez barierę krew-mózg, przez łożysko, do dróg oddechowych, moczowo-płciowych, wątroby, a nawet zębów i kości [10]. Z uwagi na wielokierunkowy udział MMP w procesach nowotworzenia istnieje konieczność dokładnej charakterystyki mechanizmów ich roli w wyżej wymienionych procesach. Celem badań przedstawionych w pracy była analiza udziału metaloproteaz macierzy pozakomórkowej w inwazyjności i progresji nowotworów w modelu in vitro. W tym celu zaprojektowano schemat badań służących ocenie wpływu wybranych modulatorów z grupy tetracyklin, hamujących aktywność metaloproteaz macierzy pozakomórkowej, na efekty fenotypowe związane z inwazyjnością komórek nowotworowych niedrobnokomórkowego raka płuc (linia A549) i raka pęcherza (linia T24). Warunki hodowli in vitro Badania przeprowadzono na hodowlach in vitro ludzkich linii nowotworowych A549 (ATCC: CCL-185) oraz T24 (ATCC: HTB-4) wywodzących się odpowiednio z raka płuc oraz raka pęcherza. Hodowle prowadzone były w standardowych warunkach (37 C, 5% wysycenie atmosfery CO 2 ), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (PAA) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) (PAA) oraz gentamycyny (2 μg/ml) (PAA), w inkubatorze Hera-Cell (Heraeus). Monitoring prowadzonych hodowli (liczba komórek żywych i martwych, morfologia komórek) prowadzono metodą mikroskopii świetlnej z użyciem 0,4% roztworu błękitu trypanu w soli fizjologicznej (Sigma-Aldrich) w komorze hemocytometrycznej Neubauera przy użyciu mikroskopu odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). Warunki traktowania hodowli komórkowych badanymi modulatorami ekspresji żelatynaz Komórki nowotworowe w prowadzonych hodowlach in vitro poddawano działaniu wybranych modulatorów ekspresji MMP z grupy tetracyklin: hyklatu doksycykliny (Sigma- Aldrich), chlorowodorku oksytetracykliny (Sigma-Aldrich), chlorowodorku tetracykliny (Polfa Tarchomin) i limecykliny (Galderma). Odpowiednią liczbę komórek wysiewano na płytki hodowlane 96-dołkowe lub 24-dołkowe i inkubowano przez noc. Następnego dnia usuwano pożywkę, przepłukiwano płytki 2-krotnie roztworem Dulbecco PBS (DPBS), po czym dodawano świeżo przygotowaną pożywkę bez surowicy zawierającą odpowiednie stężenia badanych modulatorów. Zastosowano następujące stężenia badanych tetracyklin w kolejnych procedurach badawczych: testy MTT - 200μM, 100μM, 50μM, 25μM, 12,5μM, 6μM, 3μM; zymografia, RT-PCR - 50μM, 12,5μM, 3μM; badanie adhezji komórek do matriżelu, wound healing assay - 50μM, 25μM, 12,5μM, 6μM, 3μM. Czas traktowania hodowli w teście cytotoksyczności (MTT) wynosił 6h, 12h i 24h; dla pozostałych badań - 24 godziny. Wyniki badań odnoszono do odpowiednich hodowli kontrolnych prowadzonych w identycznych warunkach jak hodowle badane, jednak bez dodatku żadnego z badanych modulatorów. Badanie cytotoksyczności testem MTT Liczbę żywych komórek w badanych hodowlach oceniano za pomocą testu cytotoksyczności MTT (Sigma-Aldrich). Komórki badanych linii wysiewano na płytki hodowlane 96- dołkowe (20 tys. kom./dołek). Po przeprowadzeniu inkubacji
w pożywce zawierającej odpowiedni modulator w badanym stężeniu, pożywkę usuwano, przepłukiwano hodowle roztworem DPBS, po czym dodawano do każdego dołka po 100 μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierające substrat bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Płytki inkubowano przez 2 godziny, a następnie dodawano po 100 μl mieszaniny etanol- DMSO (1:1) w celu rozpuszczenia barwnych kryształów produktu redukcji MTT (formazanów). Po 2-godzinnej inkubacji dokonywano pomiarów spektralnych w czytniku mikropłytek Triad LT (Dynex) przy fali długości 570 nm. Oznaczanie ekspresji mrna żelatynaz techniką Real-Time RT-PCR Ekspresję genów kodujących żelatynazy: MMP-2 i MMP-9 na poziomie mrna określono stosując ilościową technikę RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (Real-Time RT-PCR) z użyciem barwnika fluorescencyjnego SYBR Green I. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: 2 μl 10x buforu A, 2 μl (4 μl w przypadku MMP-2) 25 mm MgCl 2, po 1,35 μl 3 μm roztworów starterów F i R, 0,7 μl 1x SYBR Green I, 0,1 μl odwrotnej transkryptazy Multiscribe RT (50 U/μl), 0,1 μl polimerazy DNA Ampli TaqGold (5 U/μl), 160 ng matrycowego RNA oraz wodę do 20 μl. Wszystkie odczynniki zakupiono w Applied Biosystems, z wyjątkiem starterów (IBB PAN, Warszawa) oraz SYBR Green I (Invitrogen). Skład mieszaniny reakcyjnej dla każdego badanego transkryptu był identyczny z wyjątkiem starterów, których sekwencje były specyficzne dla danego mrna badanego genu. Zastosowano następujące sekwencje starterów: do detekcji mrna MMP-2 starter F (forward, sensowy): 5 CAGGGAGCGCTACGATGGAG3, starter R (reverse, antysensowy): 5 TCCTTGGGGCAGC- CATAGAA 3 (sekwencje zaprojektowane w programie EMBOSS); dla mrna MMP-9 starter F: 5 GCTCAC- CTTCACTCGCGTG3, starter R: 5 CGCGACACCA- AACTGGATG3 [11]. Równocześnie, w każdej próbce prowadzono detekcję mrna genu kontrolnego - β-aktyny stosując dostępny komercyjnie zestaw starterów o sekwencjach: F: 5 TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3, R: 5 CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3. Matrycę w reakcjach RT-PCR stanowiły ekstrakty RNA z komórek badanych hodowli in vitro uzyskane metodą fenolowo-chloroformową przy użyciu odczynnika Tri-Reagent (Sigma-Aldrich). Profil termiczny reakcji był następujący: 48ºC przez 30 minut (RT), 95ºC 10 min., następnie 40 cykli złożonych z 30-sekundowej inkubacji w 95ºC i 1-minutowej inkubacji w 60ºC, po czym przeprowadzano końcową elongację przez 10 min., w 72ºC. Wszystkie analizy przeprowadzono w aparacie Mx3000P (Stratagene). Zmianę ekspresji MMP-2 i MMP-9 określano metodą ΔΔCt w odniesieniu do poziomu mrna genu β-aktyny jako kontroli endogennej. Jako kalibrator w metodzie ΔΔCt posłużyły hodowle kontrolne (nie traktowane żadnym z modulatorów). Zymograficzna detekcja żelatynaz Ekspresję żelatynaz MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka określono wykorzystując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem żelatyny. Do studzienek 10% żeli poliakrylamidowych z SDS i żelatyną (2 mg/ml) nakładano po 30 μl mieszaniny złożonej z równych ilości 2x roztworu obciążającego (0,125 M Tris-HCl, ph=6,8; 20% glicerol; 4% SDS; 0,01% błękit bromofenolowy) i supernatantów z badanych hodowli uprzednio zagęszczonych za pomocą kolumienek chromatograficznych Vivaspin 500 (Sigma-Aldrich). Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego w buforze elektroforetycznym (1% SDS, 20 mm Tris, 190 mm glicyna; ph=8,3), żele 3-krotnie płukano w buforze renaturującym (2,5% Triton X-100), a następnie żele te inkubowano w buforze rozwijającym (50 mm Tris-HCl, ph=7,5; 200 mm NaCl; 5 mm CaCl 2 ; 2 μm ZnSO 4 ; 0,02% Brij-35) w temp. 37 C przez 48 godzin. Po inkubacji żele barwiono przez noc w 0,5% roztworze błękitu Coomassie. Następnego dnia żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, kwasu octowego i wody (5:4:1). Zymogramy rejestrowano w systemie dokumentacji żelowej LabWorks 4.0 (Cambridge, UK). Badanie adhezji komórek nowotworowych do podłoża matrigel Do badania adhezji wykorzystano płytki hodowlane 96- dołkowe pokryte matriżelem (BD Matrigel Cellware Basement Membrane, Becton-Dickinson). Warstwa macierzy pozakomórkowej wynosiła 100μg/cm 2. Po 24 h stymulacji modulatorami w podanym zakresie stężeń (od 50μM do 3μM), komórki odklejano, wirowano, a następnie zawieszano w 2% RPMI. Do każdej studzienki dodawano po 0,1 ml zawiesiny komórek (w stężeniu 200 tys/100μl). Płytki inkubowano przez 2 godziny w temp. 37 C. Po inkubacji 2 razy przepłukiwano studzienki roztworem DPBS. Komórki utrwalano w roztworze Cytofix (0,05 ml 4% paraformaldehydu w DPBS na każdą studzienkę) przez 30 min. Następnie usuwano utrwalacz i przeprowadzano barwienie (0,05 ml 0,1% roztworu fioletu krystalicznego w DPBS) przez 30 min. Po wybarwieniu przepłukiwano każdą studzienkę dwukrotnie roztworem DPBS. Płytki analizowano w mikroskopie odwróconym Axiovert 40CFL (Zeiss). Badanie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych testem Wound Healing Assay Komórki badanych linii wysiewano na 24-dołkowe płytki i prowadzono hodowlę przez około 48 godzin do uzyskania konfluentnych hodowli. Następnie w każdej studzience wykonywano rysę o szerokości 1 mm, po czym dwukrotnie intensywnie przepłukiwano płytkę roztworem PBS. Bezpośrednio po wykonaniu rysy rozpoczęto traktowanie komórek badanymi modulatorami w podanym zakresie stężeń (50-3 μm). Po 24 godzinach usuwano pożywkę i dodawano świeże, pełne medium. Obserwacje prowadzono przez kolejne 24 godziny prowadząc dokumentację za pomocą mikroskopu odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). Analiza statystyczna Dane ilościowe porównano za pomocą analizy wariancji (ANOVA). Do obliczeń wykorzystano program STATISTI- CA 6,0. Po przeanalizowaniu wyników testów MTT dla badanych tetracyklin w zakresie stężeń 200 μm - 3 μm, nie prowadzono dalszych badań z zastosowaniem stężenia 200 μm
Ryc. 1. Wykres zależności absorbancji od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 24 godzinach w hodowlach komórek linii A549 i T24. przedstawiono wartości średnie +/- odchylenie standardowe. * - istotna statystycznie różnica w odniesieniu do hodowli kontrolnej. i 100 μm, ponieważ stężenia te powodowały zbyt silny efekt cytotoksyczny w stosunku do hodowli komórkowych linii A549 i T24, co uniemożliwiałoby wiarygodną analizę badań inwazyjności. Wybrano także optymalny czas traktowania hodowli badanymi tetracyklinami (24 godziny). Zakres działania cytotoksycznego obserwowany w testach MTT dość istotnie różnił się pomiędzy poszczególnymi badanymi modulatorami (Ryc. 1). Badania poziomu ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 na poziomie mrna dokonano za pomocą ilościowej techniki RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym. Zastosowano metodę relatywnej oceny ekspresji genów (ΔΔCt) w odniesieniu do ekspresji genu β-aktyny. W przypadku linii A549 wykazano spadek poziomu ekspresji genu MMP-2 po stymulacji wszystkimi z zastosowanych tetracyklin przy niemal wszystkich stężeniach (Ryc. 2). Obniżenie ekspresji genu MMP-9 na poziomie istotnym statystycznie wykazano po zastosowaniu limecykliny w stężeniu 3 μm (p<0,001) oraz oksytetracykliny w stężeniu 50 μm (p<0,001). Oksytetracyklina w stężeniu 12,5 μm powodowała wzrost ekspresji genu MMP-9 (p=0,021). Doksycyklina i tetracyklina nie wpłynęły w istotnym stopniu na ekspresję genu MMP-9. Po traktowaniu komórek linii T24 oksytetracykliną w stężeniu 12,5 μm oraz tetracykliną w stężeniach 50 μm i 3 μm wykazano istotne statystycznie zahamowanie ekspresji genu MMP-2. Doksycyklina i limecyklina nie wpłynęły w istotnym stopniu na ekspresję genu MMP-2. Obniżenie ekspresji genu MMP-9 w komórkach linii T24 wykazano po zastosowaniu wszystkich badanych modulatorów, przy czym był to spadek na poziomie istotnym statystycznie w przypadku doksycykliny i oksytetracykliny 2a 2b we wszystkich stosowanych stężeniach (z wyjątkiem oksytetracykliny w stężeniu 3 μm);. tetracyklina i limecyklina nie obniżyły ekspresji MMP-9 w istotny sposób. Uzyskane wyniki wskazują na wpływ tetracyklin na ekspresję żelatynaz na poziomie mrna (transkrypcji), przy czym efekt ich działania jest różny w zależności do rodzaju żelatynazy oraz stężenia, w jakim stosowano tetracykliny. Badania ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka dokonano za pomocą zymografii. Analiza otrzymanych zymogramów obrazujących aktywność MMP-2 i MMP-9 w hodowlach obu linii komórkowych wykazała obecność produktów odpowiadających żelatynazie A i żelatynazie B (Ryc. 3). W przypadku linii A549 zdecydowanie bardziej intensywny prążek obserwowano w przypadku MMP-2, co wskazuje na wyższą aktywność tej żelatynazy w badanej linii. W przeci- Ryc. 2. Zmiany aktywności transkrypcyjnej genów kodujących MMP-2 i MMP-9 w hodowlach komórek linii A549 (ryc. 2a) i T24 (ryc. 2b) wyznaczone metodą ΔΔCt po traktowaniu doksycykliną, oksytetracykliną, tetracykliną i limecykliną przez 24 godzinyw odniesieniu do hodowli nietraktowanych (kontrolnych). Przedstawiono wartości średnie dla równania 2 -ΔΔCt +/- odchylenie standardowe. * - zmiana istotna statystycznie w odniesieniu do kontroli.
Ryc. 3. Zymogramy przedstawiające aktywność proteolityczną żelatynaz MMP-2 i MMP-9 w supernatantach z hodowli komórkowych linii A549 (ryc. A) i T24 (ryc. B) po 24 godzinach traktowania doksycykliną, oksytetracykliną, tetracykliną i limecykliną. Ryc. 4. Wykres zależności ilości komórek ulegających adhezji po podłoża matriżel od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 24 godzinach hodowli komórek linii A549 i T24 (* - istotna statystycznie różnica w odniesieniu do hodowli kontrolnej). wieństwie do linii A549, w komórkach linii T24 obie metaloproteazy wykazywały podobną aktywność. W przypadku obu badanych linii komórkowych obserwowano obniżenie intensywności prążków wraz ze wzrostem stężenia zastosowanych modulatorów. Opisana zależność miała charakter krokowy (gradacyjny), co wskazuje na zmiany aktywności MMP w sposób zależny od dawki stosowanego modulatora. Bardzo słabo widoczne były prążki odpowiadające metaloproteazom MMP-2 i MMP-9 przy 50 μm stężeniu doksycykliny. Wskazuje to bądź na działanie cytotoksyczne doksycykliny w stosowanym stężeniu - co dodatkowo znalazło odzwierciedlenie w badaniach za pomocą testu MTT - lub bardzo wysokie zahamowanie ekspresji MMP. Do oceny wpływu badanych modulatorów na fenotyp komórek linii A459 i T24 posłużono się badaniem adhezji komórek nowotworowych do podłoża matriżel testu stosowanego w badaniach adhezji, propagacji, wzrostu oraz podziałów komórkowych - oraz testem Wound Healing Assay stosowanego w analizie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych. Badanie adhezji komórek do podłoża matriżel po traktowaniu komórek oksytetracykliną wykazało, że nie ma ona wpływu na adhezję komórek linii A549 (p=0,078) i T24 (p=0,196) do podłoża, bądź różnica w stopniu adhezji w porównaniu z kontrolą jest na granicy istotnych statystycznie różnic; jedynie w stężeniu 3 μm wykazano spadek adhezyjności komórek linii A549 (p=0,016). Doksycyklina indukowała wzrost adhezyjności w stężeniu 3 μm w hodowlach komórek linii T24 (p=0,040). Limecyklina w największym użytym stężeniu (50 μm) indukowała istotne obniżenie adhezyjności komórek linii A549 (p=0,003), natomiast w pozostałych stężeniach nie wykazano istotnego wpływu na komórki obu badanych linii. Co ciekawe, zaobserwowano wzrost stopnia przylegania komórek linii T24 do powierzchni matrigelu po stymulacji tetracykliną w najniższych użytych w badaniu stężeniach, tj. 6 μm i 3 μm. Natomiast w stosunku do komórek linii A549 wykazano istotne obniżenie adhezyjności w stężeniach 12,5 μm (p=0,028), 6 μm (p=0,022) i 3 μm (p=0,008) (Ryc. 4). Badanie za pomocą Wound Healing Assay wykazało zmiany, jakie zaszły w adherentnych hodowlach komórek linii A549 i T24 po stymulacji zastosowanymi modulatorami. W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano brak całkowitego zarastania rysy przez komórki linii A549 o niskim potencjale migracyjnym, a po 24 godzinach obumieranie hodowanych komórek tworzących zbyt gęste skupiska (Ryc. 5). W hodowlach obu linii komórkowych zaobserwowano cytotoksyczne działanie doksycykliny w stężeniu 50 μm (obserwacje mikroskopowe). W przypadku pozostałych antybiotyków zauważono wyraźną zależność stopnia zarastania rysy od stężenia badanego modulatora - im większe stężenie tetracyklin, tym mniejszy stopień zarastania rysy. Zauważono również różnicę w potencjale migracyjnym i inwazyjności komórek linii A549, które nie zarastały całkowicie rysy, a po 24 godzinach hodowli obumierały, a komórkami linii T24, które po prowadzeniu hodowli przez 72 godziny całkowicie zarastały rysę. Rak płuc i rak pęcherza moczowego są jednymi z najczęściej występujących nowotworów charakteryzującymi się wysokim potencjałem przerzutowym oraz inwazyjnością [12, 13]. Stąd też do badań opisanych w pracy wykorzystano ustalone linie komórkowe A549 i T24 stanowiące modele eksperymentalne in vitro wymienionych nowotworów. Hodowle badanych linii posłużyły do oceny wpływu wybranych tetracyklin na procesy związane z inwazyjnością komórek nowotworowych. W pierwszej kolejności przeprowadzono testy cytotoksyczności (MTT), pozwalające na wyznacze-
5a 5b Ryc. 5. Zdjęcia przedstawiające zmiany, jakie zaszły w przeciągu 72 godzin w hodowli komórek linii T24 (ryc. 5a) oraz 24 godzin hodowli komórek linii A549 (ryc. 5b) po stymulacji doksycykliną. Na zdjęciach z hodowli po traktowaniu doksycykliną w stężeniu 50μM dostrzegalny jest wyraźny efekt cytotoksyczny (potwierdzony testem MTT). W przypadku pozostałych stężeń widać wyraźną zależność stopnia zarastania wolnej powierzchni naczynia hodowlanego od stężenia modulatora. W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano brak całkowitego zarastania powierzchni przez komórki linii A549, a po 24 godzinach obumieranie hodowanych komórek tworzących zbyt gęste skupiska. nie optymalnych stężeń oraz czasu ekspozycji komórek na badane tetracykliny, a także na opisanie ogólnego wpływu badanych modulatorów na proliferację i apoptozę komórek nowotworowych linii raka płuc i raka pęcherza. Szczególnie wysoki efekt cytotoksyczny w stosunku do badanych linii nowotworowych wykazywała doksycyklina, co znajduje potwierdzenie w danych literaturowych [14, 15, 16]. Przedstawione wyniki w części dotyczącej wpływu doksycykliny na ekspresję genu MMP-9 dla linii T24 znalazły odzwierciedlenie w badaniach prowadzonych przez Hanemaaijer i wsp. na komórkach śródbłonka (HUVEC) oraz fibroblastach izolowanych z torebki stawowej [17]. Z kolei inne badania dotyczące ekspresji mrna MMP-2 i MMP-9 w tętniaku aorty brzusznej wykazał trzykrotne obniżenie ekspresji MMP-2 i czterokrotne obniżenie ekspresji MMP-9 w ścianie aorty po zastosowaniu doksycykliny [18]. Analogię w stosunku do prowadzonych badań znaleziono również w analizie wpływu doksycykliny na komórki czerniaka linii B16, w których wykazano obniżenie ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 po zastosowaniu tego modulatora aktywności w porównaniu z kontrolą. Łączyło się to z zahamowaniem wzrostu guza o 35,63% [15]. Inne badania pokazały, że doksycyklina w farmakologicznie dostępnych, nietoksycznych dawkach hamuje syntezę mrna, produkcję i aktywację MMP-9 stymulowaną przez TGF-β w komórkach nabłonka rogówki [19]. Wyniki te korespondują z badaniami przeprowadzonymi przez szereg ośrodków dotyczących wpływu doksycykliny i jej modyfikowanych analogów na aktywność MMP-2 i MMP-9 z zastosowaniem różnych linii komórkowych [15, 16, 19, 20]. Wpływ pozostałych tetracyklin (oksytetracyklina, tetracyklina i limecyklina) nie jest praktycznie opisywany w literaturze w kontekście nowotworów. Głównym problemem badawczym w przedstawionej pracy stanowiła analiza wpływu badanych modulatorów ekspresji MMP na inwazyjność komórek nowotworowych. Zjawisko inwazyjności warunkują przede wszystkim takie cechy, jak potencjał metastatyczny i proangiogenny guzów pierwotnych. Są one wynikiem aktywacji szlaków molekularnych uczestniczących w procesie pokonywania bariery błony podstawnej oraz śródbłonka sąsiadujących naczyń krwionośnych przez komórki nowotworowe, a z drugiej strony zwiększenia ekspresji białek powierzchniowych związanych z adhezją, co zapewnia komórkom nowotworu zagnieżdżenie w nowym miejscu organizmu i utworzenie guza wtórnego [21]. Niedostateczna siła oddziaływania komórek nowotworu z otaczającym środowiskiem zewnętrznym nie tylko uniemożliwia rozwój powstającego przerzutu, ale także śmierć komórek nowotworowych na drodze opisanej jako anoikis, czyli zależnej od adhezji. Uzyskane wyniki wskazują przede wszystkim na inhibitorowy wpływ tetracyklin w procesach migracji komórek nowotworowych linii A549 i T24. natomiast w przypadku analizy adhezji komórek do białek macierzy pozakomórkowej (matrigel) wpływ tetracyklin nie jest jednoznaczny wykazano zarówno hamowanie, jak i stymulację adhezji. Wykazano, iż wpływ tetracyklin na opisane procesy związany był z wyciszeniem ekspresji metaloproteaz MMP-2 i MMP-9 (zarówno na poziomie mrna, jak i białka). Należy podkreślić, iż w badaniach przeanalizowano wpływ badanych tetracyklin na ekspresję najczęściej opisywanych w literaturze metaloproteaz żelatynazy A i B - o najszerzej opisanym związku z rozwojem nowotworów złośliwych. Jednak badane modulatory z grupy tetracyklin wpływają także na ekspresję i/lub aktywność również wielu innych enzymów z tej grupy, co podkreślono we wstępie. Badane efekty wyciszenia ekspresji MMPs są więc z pewnością sumarycznym efektem wpływu tetracyklin na wiele różnych metaloproteaz. Otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych autorów. Chetty i wsp. wykazali, że genowo-specyficzne wyciszenie ekspresji MMP-2 za pomocą RNAi powoduje obniżenie migracji komórek raka płuc A549 przez matrigel oraz angiogenezy in vitro, a in vivo (u myszy) obniżenie tempa przerzutowania [22]. Wpływ doksycykliny na różne aspek-
ty nowotworzenia jest opisany w literaturze najlepiej ze wszystkich tetracyklin. Wykazano między innymi, iż hamuje ona o 28% stopień zagnieżdżania się komórek raka piersi w kościach u myszy [23], a także w istotny sposób hamuje rozwój przerzutów czerniaka u myszy poprzez obniżenie ekspresji MMP-2 i MMP-9 i związane z tym zahamowanie angiogenezy [15]. Według Franco i wsp. doksycyklina (31 i 104 μm) hamuje o 20% migrację komórek mięśniowych in vitro w teście wound healing assay, a także adhezyjność tych komórek do podłoża pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej [24]. Inhibitory metaloproteaz - Col-3 (Metastat - modyfikowana pochodna doksycykliny) i AG1478 (bloker receptora EGF) - wykazują istotny wpływ hamujący inwazyjność komórek raka tarczycy in vitro poprzez zahamowanie ekspresji MMP-2 [16]. Col-3 oraz inne modyfikowane pochodne tetracyklin wpływają także hamująco na inwazyjność komórek raka prostaty in vitro oraz stopień ich przerzutowania [14]. Potwierdzono hamujący wpływ doksycykliny na ekspresję żelatynazy A i B na poziomie mrna i białka. Podobny, choć słabszy efekt wykazały inne tetracykliny (oksytetracyklina, tetracyklina, limecyklina). Badane tetracykliny hamowały migrację komórek nowotworowych A549 i T24 w sposób zależny od dawki. Wpływ badanych tetracyklin na procesy adhezji komórek nowotworowych A549 i T24 nie był wyraźny i istotnie różnił się w zależności od typu badanego związku oraz jego stężenia. Dziękujemy pracownikom Katedry Analizy Instrumentalnej za udostępnienie czytnika mikropłytek. Piśmiennictwo 1. Deryugina E, Quigley J. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 9-34. 2. Jodele S i wsp. Modifying the soil to affect the seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer progression. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 35-43. 3. Stefanidakis M, Koivunen E. Cell-surface association between matrix metalloproteinases and integrins: role of the complexes in leukocyte migration and cancer progression. Blood 2006; 108: 1441-50. 4. Pavlaki M, Zucker S. Matrix metalloproteinases inhibitors(m- MPIs): the beginning of phase I or the termination of phase III clinical trials. Cancer Metastasis Rev 2003; 22: 177-203. 5. Ramnath N, Creaven P. Matrix metalloproteinases inhibitors. Curr Oncol Rep 2004; 6: 96-102. 6. Pirard B. Insight into the structural determinants for selective inhibition of matrix metalloproteinases. Drug Discover Today 2007; 12: 640-6. 7. Chakraborti S i wsp. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Mol Cell Biochem 2003; 253: 269-85. 8. Chu Q i wsp. A phase II and pharmacological study of the matrix metalloproteinase inhibitor (MMPI) COL-3 in patients with advanced soft tissue sarcomas. Invest New Drugs 2007; 25: 359-67. 9. Syed S i wsp. A phase I and pharmacokinetic study of Col-3 (Metastat), an oral tetracycline derivative with potent matrix metalloproteinase and antitumor properties. Clin Cancer Res 2004; 10: 6512-21. 10. Reese R, Betts R, Gumustop B. Handbook of antibiotics. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia 2000. 11. Quintero M i wsp. Nitric oxide is a factor in the stabilization of hypoxia-inducible factor-1α in cancer: role of free radical formation. Cancer Res 2006; 66: 770-4. 12. Goodman G. Lung cancer 1: prevention of lung cancer. Thorax 2002; 57: 994-9. 13. Pashos C i wsp. Bladder cancer: epidemiology, diagnosis, and management. Cancer Pract 2002; 10: 311-22. 14. Lokeshwar B i wsp. Inhibition of cell proliferation, invasion, tumor growth and metastasis by an oral non-antimicrobial tetracycline analog (Col-3) in a metastatic prostate cancer model. Int J Cancer 2002; 98: 297-309. 15. Sun B i wsp. Doxycycline influences microcirculation patterns in B16 melanoma. Exp Biol Med 2007; 232: 1300-7. 16. Yeh M i wsp. Differentiated thyroid cancer cell invasion is regulated through epidermal growth factor receptor-dependent activation of matrix metalloproteinase (MMP)-2/gelatinase A. Endocrine-Related Cancer 2006; 13: 1173-83. 17. Hanemaaijer R i wsp. Inhibition of MMP synthesis by doxycycline and chemically modified tetracyclines (CMTs) in human endothelial cells. Adv Dent Res 1998; 12: 114-8. 18. Thompson R, Baxter B. MMP inhibition in abdominal aortic aneurysm. Rationale for a prospective randomized clinical trial. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: 159-78. 19. Kim H i wsp. Doxycycline inhibits TGF-β1-induced MMP-9 via Smad and MAPK pathways in human corneal epithelial cells. Invest Ophtalmol Vis Sci 2005; 46: 840-8. 20. Fiotti N i wsp. Short term effects of doxycycline on matrix metalloproteinases 2 and 9. Cardiovasc Drugs Ther 2009; 23: 153-9. 21. Ziober L, Silverman S, Kramer R. Adhesive mechanisms regulating invasion and metastasis in oral cancer. Crit Rev Oral Biol Med 2001; 12: 499-510. 22. Chetty C i wsp. Adenovirus-mediated small interfering RNA against matrix metalloproteinase-2 suppresses tumor growth and lung metastasis in mice. Mol Cancer Ther 2006; 5: 2289-99. 23. Duivenvoorden W i wsp. Doxycycline decreases tumor burden in a bone metastasis model of human breast cancer. Cancer Res 2002; 62: 1588-91. 24. Franco C i wsp. Doxycycline alters vascular smooth muscle cell adhesion, migration, and reorganization of fibrillar collagen matrices. Am J Pathol 2006; 168: 1697-1709. Adres do korespondencji: Dr n. farm. Daniel Sypniewski Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej ŚUM ul. Narcyzów 1; 41-200 Sosnowiec tel. (032) 364-10-02, e-mail: dsypniewski@sum.edu.pl