Mgr Ewa Śnieżek. Rozprawa na stopień doktora nauk o zdrowiu

Mgr Ewa Śnieżek Oznaczanie prokancerogennych i neurotoksycznych heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin w termicznie przetwarzanej żywności wysokobiałkowej Rozprawa na stopień doktora nauk o zdrowiu Promotor: dr hab. n. chem. Beata Janoszka oraz Promotor pomocniczy: dr n. med. Magdalena Szumska Katedra i Zakład Chemii Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Bytom, rok 2018

mgr Ewa Śnieżek Katedra i Zakład Chemii Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze e-mail: mgr.ewawaluga@gmail.com. Recenzenci: Prof. dr hab. n. chem. Irena Staneczko-Baranowska Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii Wydział Chemiczny Politechnika Śląska w Gliwicach Prof. dr hab. n. przyr. Jerzy Kwapuliński, Emerytowany Kierownik Katedry i Zakładu Toksykologii, Wydział Farmaceutyczny Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach. 2

SPIS TREŚCI str.: WYKAZ SKRÓTÓW 6 WYKAZ TABEL I RYCIN 8 1.WSTĘP 11 1.1 Budowa chemiczna i klasyfikacja heterocyklicznych amin aromatycznych 11 1.2. Występowanie związków z grupy karbolin w środowisku 14 1.3 Reakcje powstawania związków z grupy karbolin 15 1.4 Przemiany metaboliczne i aktywność biologiczna karbolin 17 1.4.1 Przemiany metaboliczne 17 1.4.2 Aktywność muta- i kancerogenna związków z grupy karbolin 20 1.4.3 Neurotoksyczność -karbolin 23 1.4.4 Badania epidemiologiczne dotyczące związków z grupy karbolin 24 1.5 Czynniki wpływające na tworzenie się heterocyklicznych amin aromatycznych w żywności wysokobiałkowej poddawanej obróbce termicznej 25 1.6 Metody wyodrębniania i oznaczania karbolin w żywności 26 1.6.1 Wyodrębnianie z żywności wysokobiałkowej frakcji karbolin 26 1.6.2 Techniki instrumentalne stosowane do oznaczania karbolin 28 2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY 30 3. MATERIAŁ I METODY 32 3.1 Aparatura i odczynniki 32 3.2 Dodatki pochodzenia roślinnego do mięs 33 3.3 Przedmiot badań 34 3.3.1 Wzorce heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy i karbolin 34 3

3.3.2 Próbki żywności (mięsa i sosy) 34 3.4 Dobór warunków oznaczania heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją fluorescencyjną (FLD) 37 3.5 Opracowanie metody izolowania frakcji karbolin 38 3.5.1 Izolowanie frakcji karbolin przy użyciu mieszaniny wzorców techniką SPE 39 3.5.2 Izolowanie ekstraktów karbolin z próbek żywności z dodatkiem wzorców 41 3.6 Wyodrębnianie i oznaczanie karbolin w próbkach żywności poddanej obróbce termicznej 42 3.7 Wyznaczanie parametrów walidacyjnych metody oznaczania karbolin 45 3.8 Metody wyznaczania potencjału antyoksydacyjnego i całkowitej zawartości polifenoli w składnikach roślinnych zastosowanych jako dodatki do potraw 46 3.8.1 Oznaczanie właściwości przeciwutleniających ekstraktów owoców, cebuli i czosnku metodą FRAP 47 3.8.2 Oznaczanie właściwości przeciwutleniających metodą DPPH 47 3.8.3 Oznaczanie całkowitej zawartości polifenoli metodą Folin-Ciocalteau 47 3.9 Analiza statystyczna 48 4.WYNIKI 49 4.1 Parametry walidacyjne metody oznaczania karbolin 49 4.2 Wyniki opracowania metody oznaczania heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin techniką HPLC-DAD-FLD przy użyciu mieszaniny wzorców 53 4.3 Wyniki opracowania metodyki izolowania i oznaczania karbolin w żywności 54 4

4.4 Wyniki oznaczeń stężeń związków z grupy karbolin w próbkach żywności 56 4.4.1 Wyniki oznaczeń karbolin w próbkach potraw mięsnych (rolady, sznycle, schab pieczony w folii) sporządzonych bez dodatków roślinnych 61 4.4.2 Karboliny w próbkach potraw mięsnych (rolady i sznycle) sporządzonych z dodatkiem cebuli i czosnku 61 4.4.3 Wyniki oznaczeń karbolin w schabie pieczonym w foliowym rękawie 64 4.4.4 Wyniki oznaczeń karbolin w sosach z sznycli i rolad 67 4.5 Wyniki analizy statystycznej oznaczeń karbolin w żywności 69 4.6 Wyniki oznaczeń właściwości przeciwutleniających roślinnych dodatków do mięs 71 5. DYSKUSJA 72 5.1 Metoda oznaczania karbolin w próbkach żywności 72 5.2 Wpływ sposobu przygotowania potraw mięsnych na stężenie karbolin 74 5.3 Związki z grupy karbolin w sosach powstających podczas smażenia mięsa bez dodatków roślinnych 77 5.4 Wpływ dodatków roślinnych na stężenie karbolin w potrawach mięsnych 78 5.4.1 Wpływ dodatków roślinnych na stężenie -karbolin (norharmanu i harmanu) w próbkach mięsa i sosów 79 5.4.2 Wpływ dodatków roślinnych na stężenie i -karbolin w próbkach mięsa i sosów 82 5.5 Podsumowanie 90 6. WNIOSKI 92 7. PIŚMIENNICTWO 93 8. STRESZCZENIE 105 9. ABSTRACT 106 5

WYKAZ SKRÓTÓW: AαC - 2-amino-9H-pirydo[2,3-b]indol B(a)P - benzo(a)piren DAD - detektor UV z matrycą diodową 4,8-DiMeIQx - 2-amino-3,4,8-trimetyloimidazo[4,5-f]chinoksalina DPPH - 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl FLD - detektor fluorescencyjny FRAP spektrofotometryczna metoda oznaczania zdolności redukowania jonów żelaza (ang. ferric ion reducing antioxidant parameter) GA - kwas galusowy Glu-P-1-2-amino-6-metylodipirydo-[1,2-a:3,2d]imidazol Glu-P-2-2-aminodipirydo-[1,2-a:3,2-d]imidazol HAA- heterocykliczne aminy aromatyczne H - Harman; 1-metylo- 9H-pirydo[4,3-b]indol Harman - 1-metylo- 9H-pirydo[4,3-b]indol HPLC - wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC-FLD- wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją przy użyciu detektora fluorescencyjnego IARC - Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (ang. International Agency for Research on Cancer) IQ - 2-amino-3-metyloimidazo[4,5-f]chinolina LOD - limit of detection; granica wykrywalności LOQ - limit of quantification; granica oznaczalności MeAαC - 2-amino-3-metylo-9H-pirydo[2,3-b]indol MeIQ - 2-amino-3,8-dimetyloimidazo[4,5-f]chinoksalina MeIQx - 2-amino-3,8-dimetyloimidazo[4,5-f]chinoksalina n - liczba powtórzeń przeprowadzonych analiz NH - Norharman; 9H-pirydo[4,3-b]indol Norharman - 9H-pirydo[4,3-b]indol NAT2 - acetylotransferazy PhIP- 2-amino-1-metylo-6-fenyloimidazo[4,5-b]pirydyna PRS - faza stała do SPE, zawierająca żel krzemionkowy modyfikowany grupami propylosulfonowymi SPE - ekstrakcja do fazy stałej 6

SULT - sulfotransferazy TPTZ - 2,4,6 tri(2-pirydylo)-s-triazyna T - troloks (kwas (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylo-chromano-2-karboksylowy) Trp-P-1-3-amino-1,4-dimetylo-5H-pirydo[4,3-b]indol Trp-P-2-3-amino-1-metylo-5H-pirydo[4,3-b]indol UV - promieniowanie ultrafioletowe WWA - wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne 7

WYKAZ TABEL I RYCIN: Tabele: Tabela I. Niepolarne heterocykliczne aminy aromatyczne z grupy karbolin. Tabela II. Zawartość harmanu i norharmanu w wybranych produktach spożywczych pochodzenia roślinnego oraz w używkach. Tabela III. Mutagenność α-, - i γ-karbolin względem szczepów bakterii S.typhimurium. Tabela IV. Kancerogenne działanie karbolin względem zwierząt doświadczalnych. Tabela V. Charakterystyka próbek żywności. Tabela VI. Równania krzywych kalibracyjnych i współczynników korelacji dla heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin oznaczanych techniką HPLC-FLD. Tabela VII. Granice wykrywalności i oznaczalności karbolin oznaczanych techniką HPLC-FLD. Tabela VIII. Średnie wartości odzysków wzorców dodawanych do próbek mięsa i sosów. Tabela IX. Powtarzalność i precyzja pośrednia metody oznaczania karbolin techniką HPLC-FLD. Tabela X. Stężenia heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin oznaczone w próbkach potraw mięsnych techniką HPLC-FLD Tabela XI. Właściwości przeciwutleniające produktów roślinnych wyznaczone metodą FRAP i DPPH oraz oznaczona metodą Folin-Ciocalteau zawartość polifenoli. Tabela XII. Sumaryczna zawartość -, - i -karbolin (AαC, MeAαC, Trp-P-1, Trp-P-2, Glu-P-1 i Glu-P-2) w próbkach rolad i sznycli sporządzonych bez- i z dodatkami oraz procent obniżenia ich stężeń pod wpływem cebuli i czosnku (w stosunku do próbek bez dodatku). Tabela XIII. Sumaryczna zawartość -, - i -karbolin (AαC, MeAαC, Trp-P-1, Trp-P- 2, Glu-P-1 i Glu-P-2) w próbkach schabu pieczonego bez i z dodatkiem suszonych owoców oraz procent obniżenia stężeń (w stosunku do próbki mięsa bez dodatku). 8

Ryciny: Rycina 1. Schemat syntezy -karbolin w termicznie przetwarzanej żywności. Rycina 2. Schemat metabolicznej aktywacji i detoksykacji MeAαC. Rycina 3. Metabolizm -karbolin zachodzący przy udziale enzymów cytochromu P 450. Rycina 4. Przemiana związków niemutagennych: norharmanu i aniliny do biologicznie aktywnego aminofenylonorharmanu i jego adduktu z DNA, zachodząca pod wpływem enzymów cytochromu P450. Rycina 5. Schemat postępowania prowadzący do uzyskania ekstraktu karbolin z danej próbki mięsa i odpowiadających jej dwóch próbek wzbogaconych we wzorce. Rycina 6. Schemat procesu ekstrakcji zastosowanej do wydzielania karbolin z hydrolizatu próbek mięsa. Rycina 7. Chromatogram HPLC-FLD mieszaniny wzorcowej heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin. Rycina 8. Chromatogram HPLC-DAD mieszaniny wzorcowej aminoazaarenów rozdzielanej w warunkach wybranych dla związków z grupy karbolin. Rycina 9. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji karbolin wyizolowanych z próbki mięsa (sznycla) wzbogaconej dodatkiem wzorców. Rycina 10. Widma UV wybranych karbolin. Rycina 11. Porównanie stężeń 8 karbolin w próbkach potraw mięsnych sporządzonych bez dodatków: w roladach, sznyclach i w schabie pieczonym w rękawie z folii. Rycina 12. A: Stężenia karbolin w próbkach rolad przygotowanych bez dodatków oraz z dodatkiem cebuli i czosnku; 12 B: Stężenia karbolin w próbkach sznycli przygotowanych bez oraz z dodatkiem cebuli i czosnku. Rycina 13. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji β- i γ-karbolin z z próbek potraw bez dodatków oraz z cebulą i czosnkiem. Rycina 14. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji i karbolin z próbek potraw bez dodatków oraz z cebulą i czosnkiem. Rycina 15. Stężenia karbolin w próbkach schabu pieczonego w rękawie z folii bez dodatków oraz z dodatkiem suszonych śliwek, moreli i żurawiny. Rycina 16. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji β- i γ-karbolin wyizolowanych z próbki schabu pieczonego w folii bez dodatków oraz z dodatkami suszonych śliwek, moreli i żurawiny. 9

Rycina 17. Fragmenty chromatogramu HPLC-FLD frakcji -i -karbolin wyizolowanej z próbki schabu pieczonego w folii bez dodatków. Rycina 18. Stężenia karbolin w próbkach mięs i sosów. Rycina 19. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji karbolin wyizolowanych z próbek sosu: Rycina 20. Zależność pomiędzy obniżeniem całkowitego stężenia α-, γ- i δ-karbolin w próbkach schabu z owocami, a właściwościami przeciwutleniającymi suszonych owoców wyznaczonych metodą (A) FRAP, (B) DPPH oraz całkowitą zawartością polifenoli (C). 10

1. WSTĘP Dane epidemiologiczne wskazują na istnienie wyraźnej korelacji pomiędzy dietą, a występowaniem u człowieka określonych chorób, w tym nowotworów [1]. Do głównych czynników wzrostu częstości zachorowań na choroby nowotworowe zalicza się m.in. częste spożycie mięsa (zwłaszcza czerwonego) oraz jego przetworów. Istotne znaczenie mają również przyzwyczajenia kulinarne, polegające na spożywaniu produktów wysokobiałkowych o znacznym stopniu termicznego przetworzenia [2]. W 2015 roku spożywanie mięsa poddanego obróbce termicznej zostało zaliczone przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (ang. International Agency for Research on Cancer, IARC) do 1 grupy kancerogenności, czyli do czynników bezpośrednio kancerogennych dla człowieka [1]. Wyniki badań epidemiologicznych potwierdzają, że duża zawartość mięsa w diecie zwiększa ryzyko wystąpienia nowotworów żołądka, jelita grubego, płuc, trzustki, piersi i prostaty [3, 4, 5]. Procesy przetwarzania mięsa, takie jak konserwowanie, wędzenie i obróbka termiczna przyczyniają się do zwiększenia jego trwałości i poprawy walorów smakowych, jednak mogą prowadzić również do powstania związków o działaniu rakotwórczym, takich jak nitrozoaminy i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) [1, 6, 7]. Badania rozpoczęte w latach 70-tych ubiegłego wieku wskazują, że w produktach o dużej zawartości białka poddawanych procesom termicznym zwykle stosowanych w warunkach domowych (smażenie, pieczenie, grillowanie) tworzą się muta- i kancerogenne związki z grupy heterocyklicznych amin aromatycznych (HAA) [8, 9, 10, 11, 12, 13]. Niektóre z nich zaliczane są również do czynników neurotoksycznych [8]. Człowiek, dla którego produkty mięsne są podstawą diety, nie jest w stanie uniknąć narażenia na występujące w nich ksenobiotyki, dlatego też od lat podejmowane są prace badawcze zmierzające do określenia warunków przygotowania potraw mięsnych o obniżonej zawartości składników szkodliwych dla zdrowia [6, 8, 11, 14, 15, 16]. 1.1 Budowa chemiczna i klasyfikacja heterocyklicznych amin aromatycznych Heterocykliczne aminy aromatyczne to grupa organicznych związków azotu, zbudowanych z 2 lub 3 skondensowanych pierścieni, z których jeden jest aromatyczny, a pozostałe heterocykliczne. Dotychczas poznane zostały struktury ponad 30 związków 11

z tej grupy. Za wyjątkiem trzech, w tym oznaczanych w tej pracy harmanu i norharmanu, wszystkie posiadają jedną egzocykliczną grupę aminową [8, 17]. Heterocykliczne aminy aromatyczne klasyfikuje się jako związki polarne i niepolarne [9, 17, 18]. Do grupy polarnych należą pochodne imidazochinoliny (np. IQ, MeIQ) i imidazochinoksaliny (np. MeIQx, 4,8-DiMeIQx) oraz imidazopirydyny (PhIP). Związki te tworzą się w temperaturze od 100 C do 300 C, między innymi podczas gotowania, pieczenia i wędzenia żywności wysokobiałkowej. Cechą charakterystyczną struktury tych związków jest połączenie grupy aminowej -NH2 z pierścieniem imidazolowym. Polarne HAA powstają zgodnie z mechanizmem wieloetapowej biochemicznej reakcji Maillarda, z występujących w żywności aminokwasów, cukrów redukujących i kreatyny [9, 17, 18]. Niepolarne heterocykliczne aminy aromatyczne tworzą się w wyższych temperaturach, między innymi podczas smażenia i grillowania żywności [17, 18, 19]. Zalicza się do nich pochodne pirydoindolu, pirydoimidazolu, fenylopirydyny, tetraazafluorantenu i benzoimidazolu. Większość z nich posiada w swej strukturze grupę aminową -NH2 połączoną z pierścieniem pirydynowym. Do najczęściej oznaczanych w żywności niepolarnych amin heterocyklicznych należą pochodne pirydoindolu i pirydoimidazolu [8, 18]. Związki te w zależności od położenia atomu azotu w pierścieniu pirydynowym związanym z fragmentem indolowym lub imidazolowym cząsteczki zalicza się do -, -, - lub -karbolin. Pochodne pirydoindolu (α-, β- i γ-karboliny) oraz pirydoimidazolu (δ-karboliny) nazywane są ogólnie karbolinami [8, 9, 17, 19]. Podział karbolin na podgrupy -, -, - i -, wzory strukturalne, nazwy systematyczne oraz stosowane skróty nazw związków, których oznaczanie w termicznie przetwarzanej żywności jest celem pracy, przedstawiono w Tabeli I. 12

Tabela I. Niepolarne heterocykliczne aminy aromatyczne z grupy karbolin. Skrót nazwy związku α karboliny AαC Nazwa Wzór pka 2-amino-9H-pirydo[2,3- b]indol 4,4 MeAαC b.d.* β karboliny Harman 2-amino-3-metylo-9Hpirydo[2,3-b]indol 1-metylo-9H-pirydo[3,4- b]indol b.d. Norharman 9H-pirydo[3,4-b]indol 6,8 γ karboliny Trp-P-1 8,6 Trp-P-2 6,8 δ karboliny Glu-P-1 3-amino-1,4-dimetylo-5Hpirydo[4,3-b]indol 3-amino-1-metylo-5Hpirydo[4,3-b]indol 2-amino-6-metylodipirydo- [1,2- :3,2 d]imidazol 6,0 Glu-P-2 2-aminodipirydo-[1,2- :3,2 -d]imidazol 5,9 * brak danych 13

1.2. Występowanie związków z grupy karbolin w środowisku Obecność heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin potwierdzona została w termicznie przetworzonej żywności o dużej zawartości białka: w potrawach z mięsa i ryb, w których związki te oznaczono na poziomie kilku do kilkudziesięciu ng/g, a także w dostępnych w sprzedaży zupach w proszku i ekstraktach z bulionów [8, 13, 19, 20, 21, 22]. Związki te zidentyfikowano również w oparach tworzących się podczas smażenia żywności, a także w powietrzu atmosferycznym, wodzie deszczowej, ściekach, wodach rzecznych oraz w produktach spalania drewna i gumy [19, 23]. Do najlepiej poznanych dotychczas karbolin należą harman i norharman. Związki te występują w niektórych roślinach tradycyjnie stosowanych w medycynie ludowej Indian Ameryki Południowej, wykorzystującej właściwości halucynogenne i lecznicze alkaloidów roślinnych, między innymi harminy będącej pochodną harmanu [19, 24]. Z ponad 120 gatunków roślin zawierających alkaloidy β-karbolinowe najwyższą zawartością pochodnych harmanu (od 2 do 6% suchej masy) charakteryzuje się ruta stepowa (Peganum harmala), od której wywodzi się nazwa zwyczajowa tego związku [19, 24, 25]. Harman i norharman oznaczono m.in. w męczennicy cielistej (Passiflora incarnata), której wyciąg wykazuje właściwości uspokajające, a także w suszonych liściach buzdyganka naziemnego (Tribulus terrestris L.), który jest składnikiem leku stosowanego w medycynie arabskiej i chińskiej, jako środek stymulujący produkcję testosteronu u mężczyzn [19, 25]. Norharman i harman występują ponadto w wielu produktach pochodzenia roślinnego, poddawanych procesom temperaturowym lub fermentacji, między innymi w occie, sosie sojowym i pomidorowym (keczup), a także w winie, piwie i innych alkoholach. Obecność tych związków wykryto w ziarnach zbóż, w soi i kukurydzy, a także w mleku i jego przetworach [19, 26, 27]. Karboliny oznaczono też w ziarnach palonej kawy, przy czym stężenia NH i H zależą od gatunku kawy, sposobu i czasu jej zaparzania [19, 28]. Istotnym źródłem narażenia na -karboliny jest tytoń oraz dym papierosowy. Ze względu na wysokie stężenie NH i H w strumieniu bocznym dymu tytoniowego, narażenie to dotyczy również tzw. palaczy biernych [27, 29]. Na podstawie danych literaturowych sporządzono Tabelę II, w której podano zakresy stężeń norharmanu i harmanu oznaczone w różnych produktach spożywczych i używkach. 14

Tabela II. Zawartość harmanu i norharmanu w wybranych produktach spożywczych pochodzenia roślinnego oraz w używkach [8, 19, 26, 29, 28, 27]. Rodzaj produktu (stężenie) Norharman Harman Ocet (ng/ml) 9-96 15-730 Sos sojowy (ng/ml) 15-71 130-250 Sos pomidorowy typu keczup (ng/g) 57,9±19,4 55,0±35,5 Skrobia kukurydziana (ng/g) 3,6 0,9 Białko ziaren soi (ng/g) 3,0 0,8 Mąka żytnia (ng/g) 39 12 Płatki śniadaniowe (ng/g) 0-188 0-92 Mleko krowie (ng/ml) 0,4±0,08 0,46±0,34 Ser (ng/g) 3,25±1,22 10,7±14,3 Napoje alkoholowe (pg/ml) - Piwo - Wino białe i czerwone - Whisky - Brandy - Sake Kawa espresso (ng/ml) Kawa zaparzana ( g/g kawy) 2,7-22,7 0,2-0,5 0,4-2,3 0,5 0,2-5,2 23,6-16.6 1-2,4 1,7-5,4 8,5-14 0,6-5,7 0,2 4,1-42,4 5-41 0,2-0,5 Tytoń - dym tytoniowy (ng/papieros) 152-1966 55-814 1.3 Reakcje powstawania związków z grupy karbolin Badania modelowe z użyciem aminokwasów wykazały, że niepolarne heterocykliczne aminy aromatyczne tworzą się w wysokiej temperaturze z tryptofanu, kwasu glutaminowego, fenyloalaniny, lizyny i ornityny. -, - i -Karboliny powstają głównie z tryptofanu, natomiast -karboliny (Glu-P-1 i Glu-P-2)- z kwasu glutaminowego [16, 17, 19, 30]. Związki te tworzą się w temperaturze wyższej od 300 C, dlatego karboliny nazywane są czasem aminami pirolitycznymi [17, 19]. Rozkład termiczny aminokwasów zaczyna się jednak już w niższych temperaturach, nawet począwszy od 180 C [30]. 15

Liczne badania wykazały, że związki z grupy karbolin mogą tworzyć się między innymi w wyniku grillowania i smażenia produktów wysokobiałkowych [16, 19, 20, 31, 32, 33]. Prawdopodobnie synteza tych związków podczas obróbki termicznej mięsa zależy nie tylko od stężenia i rodzaju aminokwasów, ale też od obecności innych składników, organicznych i nieorganicznych, towarzyszących aminokwasom w matrycy żywności [27]. W piśmiennictwie naukowym niewiele jest informacji na temat mechanizmów tworzenia się niepolarnych HAA. Dotychczas najlepiej poznany został proces powstawania związków z grupy -karbolin z tryptofanu [18, 34, 35]. Cząsteczka tego aminokwasu zawiera strukturę heterocykliczną indolu, występującą w norharmanie i harmanie, a także w - i -karbolinach (A C, MeA C, Trp-P-1 i Trp-P-2). Schematyczny zapis mechanizmu powstawania harmanu i norharmanu w termicznie przetwarzanej żywności zaproponowany przez Herraiz a przedstawiono na Rycinie 1 [27, 35]. W początkowym etapie reakcji zachodzi kondensacja L-tryptofanu z aldehydami (np. cukrami redukującymi) lub ketokwasami występującymi w żywności bądź utworzonymi podczas jej ogrzewania. Powstały w wyniku kondensacji produkt pośredni- zasada Schiffa, ulega cyklizacji do kwasu tetrahydro- karbolinowego. Wydajność tej reakcji zależy od stężenia substratów, ph produktu, temperatury i czasu ogrzewania. W kolejnym etapie zachodzi utlenienie i dekarboksylacja kwasu tetrahydro -karbolinowego, z utworzeniem związku aromatycznego: harmanu lub norharmanu. Reakcja utleniania przebiega w obecności składników naturalnie występujących lub w żywności, między innymi pod wpływem enzymów peroksydazy hemowej, H2O2 oraz wolnych rodników [35]. Rycina 1. Schemat syntezy -karbolin w termicznie przetwarzanej żywności [27, 35]. 16

1.4 Przemiany metaboliczne i aktywność biologiczna karbolin 1.4.1 Przemiany metaboliczne Prace prowadzone z udziałem zwierząt doświadczalnych wykazały, że wszystkie heterocykliczne aminy aromatyczne są związkami prokancerogennymi i ulegają aktywacji metabolicznej przy udziale katalitycznym izoenzymów cytochromu P450 (głównie CYP1A2 oraz CYP1A1 i 1B1) wchodzącego w skład systemu oksydacyjnoredukującego S-9 ssaków [36, 37, 38, 39, 40]. Bioaktywacja karbolin, których cząsteczki posiadają egzocykliczną grupę aminową zachodzi według mechanizmu charakterystycznego dla związków z grupy polarnych heterocyklicznych amin aromatycznych [41, 42]. Schemat przemian metabolicznych karbolin na przykładzie MeA C przedstawiono na Rycinie 2. W początkowym etapie aktywacji tego związku egzocykliczna grupa aminowa ulega N-hydroksylacji do hydroksyaminowej (-NHOH). Następnie przy udziale enzymów z grupy N-acetylotransferaz i sulfotranferaz powstają wysoce aktywne metabolity (estry i siarczany), które łączą się z deoksyguanozyną (dg) cząsteczek DNA lub z cząsteczkami białek, tworząc trwałe addukty. Addukty mogą wywoływać błędy w replikacji DNA, co może prowadzić do wystąpienia mutacji, a w dalszej kolejności do rozwoju nowotworu [36, 39, 40, 41]. Równocześnie z mikrosomalną aktywacją zachodzi w wątrobie metaboliczna detoksykacja (Rycina 2), która polega na utlenieniu, przy udziale izoenzymów cytochromu P450, nieheterocyklicznego pierścienia aromatycznego cząsteczki MeA C do hydroksylowych pochodnych, a następnie na katalizowanej przez enzymy (sulfotransferazy i glukuronylotransferazy) reakcji sprzęgania cząsteczek OH-MeA C z grupami siarczanowymi i glukuronowymi. Możliwa jest też bezpośrednia N- glukuronidacja egzocyklicznej grupy aminowej MeA C. Powstałe w wyniku detoksykacji polarne metabolity mogą zostać wydalone z organizmu przez układ moczowy. 17

Rycina 2. Schemat metabolicznej aktywacji i detoksykacji MeAαC na podstawie publikacji [41]. Znaczenie skrótów: SULT - sulfotransferazy; NAT - acetylotransferazy; UDP - glukuronylotransferazy; Glu - grupa glukuronowa. Nowsze badania dotyczące przemian metabolicznych drugiej z -karbolin (A C) wykazały, że produkt jej enzymatycznej aktywacji, którym jest N-hydroksylowa pochodna (HONH-A C), pod wpływem sulfotransferaz ulega przemianie do siarczanu, z którego po oddysocjowaniu grupy siarczanowej powstaje silnie reaktywny jon nitroniowy + HN-A C, mogący utworzyć trwałe połączenie z deoksyguanozyną (dg) cząsteczki DNA. Takie addukty zidentyfikowano w komórkach wątroby, okrężnicy, pęcherza i płuc testowanych gryzoni [43]. Badania z użyciem albumin zawierających znaczony atom siarki i hepatocytów ludzkich udowodniły, że metabolit HONH-A C może ulec utlenieniu przy udziale enzymów cytochromu P450, metali o zmiennej wartościowości, a także naturalnie występujących w tkankach reaktywnych form tlenu, tworząc pochodne, które trwale modyfikują białka hepatocytów łącząc się z cysteiną albumin wiązaniem kowalencyjnym [44]. Związki z grupy -karbolin nie posiadają egzocyklicznej grupy aminowej, dlatego proces ich aktywacji metabolicznej przebiega inaczej niż dla pozostałych 18

heterocyklicznych amin aromatycznych. Badania kinetyczne in vitro z użyciem izoenzymów cytochromu P450 oraz mikrosomów ludzkich komórek wątrobowych, których działaniu poddane zostały harman i norharman wykazały, że związki te ulegają utlenieniu do pochodnych hydroksylowych, zawierających grupę -OH przy pierścieniu aromatycznym oraz do związków, w których utleniony zostaje atom azotu pierścienia pirydynowego [45, 46]. Schemat przemian metabolicznych zachodzących dla -karbolin przedstawiono na Rycinie 3. Rycina 3. Metabolizm -karbolin zachodzący przy udziale enzymów cytochromu P 450 (Cyp1A1, Cyp1A2 i Cyp2E1) [45]. Mechanizm aktywacji metabolicznej -karbolin prowadzący do utworzenia polarnych, dobrze rozpuszczalnych w wodzie hydroksylowych pochodnych, jest zaliczany do procesu ich detoksykacji. Jednakże obecność dodatkowej grupy funkcyjnej (-OH) w ich cząsteczce powoduje, że pochodne te stają się nowymi związkami bioaktywnymi, których szkodliwość dla człowieka zależy od aktywności jego enzymów wątrobowych [45]. Cząsteczki hydroksyharmanu mogą ulegać również sprzężeniu z kwasem glukuronowym, glutationem lub z grupami siarczanowymi i w tej formie zostają usunięte z organizmu wraz z moczem [45, 46]. 19

1.4.2 Aktywność muta- i kancerogenna związków z grupy karbolin Heterocykliczne aminy aromatyczne tworzące się w termicznie przetwarzanych produktach o dużej zawartości białka zaliczane są do jednych z najbardziej mutagennych składników żywności [13, 41]. Do oceny aktywności biologicznej związków chemicznych stosuje się często przesiewowy test bakteryjny in vitro, opracowany przez Ames a. Test ten wykorzystuje zdolność zmodyfikowanych szczepów bakterii w hodowlach komórkowych Salmonella typhimurium do rewersji mutacji pod wpływem czynników wywołujących mutację powrotną. Wyniki oznaczania mutagenności α-, - i γ-karbolin oraz dla porównania kilku polarnych aminoazaarenów i benzo(a)pirenu należącego do grupy WWA, przy użyciu testu Ames a względem szczepów TA98 i TA100 bakterii S. typhimurium, wyrażoną liczbą rewertantów na g testowanego związku przedstawiono w Tabeli III [3, 13, 36]. Tabela III. Mutagenność α-, - i γ-karbolin względem szczepów bakterii S.typhimurium [13, 36, 41] Testowany związek Liczba rewertantów / g związku TA98 TA100 Trp-P-2 104000 1800 Niepolarne HAA Trp-P-1 39000 1700 Glu-P-1 49000 3200 Glu-P-2 1900 1200 A C 300 20 MeA C 200 120 IQ 433000 7000 Polarne HAA MeIQ 661000 30000 MeIQx 145000 14000 4,8-DiMeIQx 183000 8000 PhIP 1800 120 WWA B(a)P* 320 600 *B(a)P benzo(a)piren 20

Aktywność mutagenna związków z grupy karbolin jest niska w porównaniu do mutagenności najczęściej oznaczanych w żywności polarnych imidazochinolin (IQ, MeIQ) i imidazochinoksalin (MeIQx, 4,8-DiMeIQx). Uwagę zwraca jednak wielokrotnie wyższa aktywność - i γ-karbolin w stosunku do biologicznego oddziaływania benzo[a]pirenu, który został uznany przez IARC za związek bezpośrednio kancerogenny dla człowieka [1]. β-karboliny harman i norharman nie wykazują aktywności mutagennej w teście Ames a. Związki te mogą jednak nasilać mutagenność innych karbolin, między innymi Trp-P-1 i Trp-P-2, dlatego są określane jako związki ko-mutagenne [41, 47]. Ponadto, zarówno harman, jak i norharman, w wyniku reakcji z aminami aromatycznymi, aniliną oraz o- i m-toluidyną, tworzą silnie mutagenne produkty, których aktywność względem szczepów bakterii Salmonella typhimurium TA98 jest bardzo wysoka [13, 47]. Dla przykładu amino-3-metylofenylo-norharman oraz aminofenylo-norharman indukowały powstawanie odpowiednio 41000 oraz 187000 rewertantów na g związku [47]. Równanie reakcji pomiędzy niemutagennymi związkami: norharmanem i aniliną, katalizowanej w organizmach żywych przez enzymy cytochromu P450 przedstawiono na Rycinie 4. Produkt tej reakcji - aminofenylonorharman ulega przemianom metabolicznym charakterystycznym dla związków z egzocykliczną grupę - NH2 tworząc N-hydroksylową pochodną, która pod wpływem acetylotransferaz może utworzyć addukt z cząsteczką DNA [47]. Rycina 4. Przemiana związków niemutagennych: norharmanu i aniliny do biologicznie aktywnego aminofenylonorharmanu i jego adduktu z DNA, zachodząca pod wpływem enzymów cytochromu P450, na podstawie piśmiennictwa [47]. 21

Chociaż aktywność mutagenna związków z grupy karbolin jest mniejsza niż polarnych HAA (Tabela III), to ich kancerogenność oceniana na podstawie długoterminowych badań z użyciem zwierząt doświadczalnych jest porównywalna dla tych obydwu grup heterocyklicznych amin aromatycznych [41]. Badania z wykorzystaniem szczurów i myszy, którym w pokarmie podawano heterocykliczne aminy aromatyczne z grupy karbolin, potwierdziły, że narażenie na działanie następujących związków: Glu-P-1, Glu-P-2, A C, MeA C, Trp-P-1 i Trp-P-2, może wywołać zmiany nowotworowe u gryzoni w obrębie wątroby, jelita cienkiego, okrężnicy, gruczołu sutkowego i gruczołu Zymbala oraz naczyń krwionośnych [13, 41, 48]. W Tabeli IV przedstawiono wyniki badań nad kancerogennością -, - i -karbolin. Tabela IV. Kancerogenne działanie karbolin względem zwierząt doświadczalnych [13,18, 48]. Związek Testowane zwierzę (rasa) Stężenie w diecie [ppm] Trp-P-1 szczury (F344) 150 Umiejscowienie nowotworu Dawka toksyczna (mg/kg masy ciała/dzień) wątroba 0,1 myszy (CDF 1) 200 wątroba 8,8 Trp-P-2 szczury (F344) 100 wątroba, pęcherz moczowy - myszy (CDF 1) 200 wątroba 2,7 Glu-P-1 szczury (F344) 500 wątroba, jelito cienkie i grube, gruczoł Zymbala 0,8 myszy (CDF 1) 500 wątroba, naczynia krwionośne 2,7 Glu-P-2 szczury (F344) 500 wątroba, jelito cienkie i grube, gruczoł Zymbala, 5,7 myszy (CDF 1) 500 wątroba, naczynia krwionośne 4,9 A C szczury (F344) 800 wątroba - myszy (CDF 1) 800 wątroba, jelito, naczynia krwionośne 15,8 MeA C szczury (F344) 100 wątroba 6,4 myszy (CDF 1) 800 wątroba, naczynia krwionośne 5,8 22

W 1993 roku Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem zaklasyfikowała wszystkie, - i -karboliny do grupy kancerogenności 2B, czyli do substancji możliwie rakotwórczych dla człowieka [49]. Ekstrapolacja wyników uzyskiwanych w badaniach z użyciem zwierząt doświadczalnych w stosunku do ustroju człowieka nie jest prosta, ze względu na występujące pomiędzy organizmami różnice w metabolizmie ksenobiotyków, a także ich absorpcji i w wydalaniu [13]. Narażenie człowieka na heterocykliczne aminy aromatyczne można ocenić na podstawie stężeń tych związków, ich metabolitów oraz adduktów z białkami lub z DNA we włosach, płynach ciała lub w tkankach pozyskiwanych w wyniku operacji [38, 40, 50, 51]. 1.4.3 Neurotoksyczność -karbolin Harman i norharman, jako związki naturalnie występujące w roślinach, zaliczane są do alkaloidów -karbolinowych. Pełnią one rolę inhibitorów enzymu monoaminooksydazy, który spowalnia metabolizm związków monoaminowych, m.in. serotoniny i dopaminy, powodując wzrost poziomu tych neuroprzekaźników w mózgu [52]. Wyniki badań wskazują, że duże stężenie -karbolin oraz ich metabolitów we krwi i tkance mózgowej może być czynnikiem rozwoju chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona [19, 52, 53] oraz drżenia samoistnego [54, 55, 56]. Badania wykazały, że stężenie harmanu we krwi obwodowej pacjentów, u których zdiagnozowano te choroby jest wyższe (u osób z chorobą Parkinsona nawet 2-krotnie) niż w krwi osób z grupy kontrolnej [53, 54, 55]. Wyższe niż w próbkach kontrolnych stężenie harmanu oznaczono również w pośmiertnie pobranych próbkach tkanki nerwowej z kory móżdżku pochodzącej od chorych z drżeniem samoistnym [56]. Neurotoksyczna aktywność harmanu wynika prawdopodobnie z jego strukturalnego i funkcjonalnego podobieństwa do 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP), związku o udowodnionym wpływie na powstawanie choroby Parkinsona [52, 53]. Chociaż etiologia chorób neurodegeneracyjnych nie została jeszcze dokładnie poznana, wyniki dotychczas przeprowadzonych badań wskazują, że narażenie środowiskowe na -karboliny (z żywności, alkoholu oraz dymu papierosowego) może być jednym z czynników decydujących o rozwoju drżenia samoistnego oraz choroby Parkinsona [19, 27, 52, 53, 54]. 23

1.4.4 Badania epidemiologiczne dotyczące związków z grupy karbolin Badania epidemiologiczne mają na celu ocenę narażenia ludzi na ryzyko rozwoju chorób w zależności od długotrwałej ekspozycji organizmu człowieka na działanie określonych czynników, między innymi pochodzących z diety. Korzystając z odpowiednio opracowanych ankiet ocenia się- w oparciu o znajomość rodzaju spożywanych produktów, sposobu ich przygotowania, zawartości w nich związków i wielkości porcji - dawkę ksenobiotyków wprowadzanych do organizmu w określonym przedziale czasowym. O ile głównym źródłem narażenia na heterocykliczne aminy aromatyczne z grupy imidazochinolin i imidazochinoksalin jest żywność, to narażenie człowieka na karboliny może wynikać nie tylko z diety, lecz również z innych źródeł, zwłaszcza z dymu tytoniowego [27, 29, 48, 57]. Wyniki badań epidemiologicznych wskazują, że związki z grupy heterocyklicznych amin aromatycznych spożywane z mięsem poddanym obróbce termicznej mogą zwiększać ryzyko wystąpienia nowotworów u człowieka, między innymi jelita grubego, żołądka, płuc, piersi i prostaty [3, 58, 59]. Osoby, u których związki te ulegają szybkiej bioaktywacji do N-acetylowych pochodnych wykazują większą tendencję do zachorowania na nowotwory jelita grubego [36, 58]. Opublikowane dotychczas opracowania epidemiologiczne dotyczące poszukiwania zależności między dietą, a rozwojem chorób nowotworowych u ludzi nie uwzględniały narażenia na występujące w żywności związki z grupy karbolin, a dotyczyły wyłącznie polarnych HAA, głównie PhIP, MeIQx oraz 4,8-DiMeIQx [3, 58]. Badania epidemiologiczne powinny uwzględniać różne czynniki narażenia na związki szkodliwe dla człowieka, co jest szczególnie trudne, gdy występują one w wielu elementach środowiska, np. w diecie i w używkach [57]. W 2018 roku [60] opublikowane zostały dane z NHANES (ang. National Health and Nutrition Examination Survey) dla populacji Stanów Zjednoczonych dotyczące stężeń czterech heterocyklicznych amin aromatycznych (AαC, PhlP, harmanu i norharmanu) w moczu osób w wieku od 6 do 65 lat. Badania wykazały występowanie różnic w stężeniach tych związków u osób odmiennych ras: niższe u Azjatów i Latynosów niż u osób rasy białej i czarnej. Najwyższe stężenia AαC, harmanu i norharmanu oznaczono w moczu osób palących papierosy. Z przeprowadzonych badań wynika, że palenie tytoniu silniej niż dieta wpływa na narażenie na -karboliny oraz AαC, a stopień oddziaływania tych związków na organizm człowieka zależy od płci i rasy osób na nie narażonych [60]. 24

1.5 Czynniki wpływające na tworzenie się heterocyklicznych amin aromatycznych w żywności wysokobiałkowej poddawanej obróbce termicznej Rodzaj heterocyklicznych amin aromatycznych (w tym związków z grupy karbolin) i ich stężenie w poddawanych obróbce termicznej produktach o dużej zawartości białka zależą od wielu czynników. Należą do nich: - temperatura i czas trwania obróbki cieplnej, - sposób tej obróbki (smażenie, grillowanie, pieczenie, gotowanie), - rodzaj mięsa, - kształt, wielkość i grubość porcji mięsa poddawanej procesom termicznym, - rodzaj tłuszczu używanego do smażenia, - rodzaj użytych do przygotowania dodatków, zawierających przeciwutleniacze [8, 10, 11, 14, 18, 30, 31, 32, 33, 61, 62]. Potrawy sporządzone w identyczny sposób, w jednakowych warunkach temperaturowych, ale z różnych gatunków mięsa mogą znacznie różnić się pod względem ilości i rodzaju powstałych w nich heterocyklicznych amin aromatycznych [33]. Badania prowadzone w układach modelowych oraz z użyciem żywności wysokobiałkowej dowodzą, że najsilniejszy wpływ na tworzenie się heterocyklicznych amin aromatycznych w potrawach mięsnych mają temperatura oraz czas obróbki cieplnej, przy czym im temperatura jest wyższa i czas ogrzewania żywności dłuższy, tym więcej związków z grupy HAA może się utworzyć [22, 30, 32, 63, 64]. Heterocykliczne aminy aromatyczne powstają już po kilku minutach od chwili rozpoczęcia smażenia mięsa i występują również w daniach o nieznacznym stopniu spieczenia [17]. Najwięcej związków z grupy HAA tworzy się w potrawach grillowanych na ruszcie węglowym oraz smażonych. W czasie gotowania lub duszenia mięsa powstają jedynie niewielkie ilości tych związków [10, 11, 31]. Sposobem na obniżenie stężeń heterocyklicznych amin aromatycznych w żywności jest gotowanie mięsa w szybkowarze [10], a także krótkotrwałe, poprzedzające właściwą obróbkę cieplną, ogrzewanie w kuchence mikrofalowej, podczas którego dochodzi do usunięcia prekursorów tych związków (m.in. aminokwasów) wraz z cieczą wypływającą podczas tego zabiegu z porcji mięsa [65]. Wyniki innych badań nie potwierdzają jednak, by ogrzewanie mięsa w kuchence mikrofalowej pozwoliło obniżyć zawartość HAA w żywności [66]. 25

Badania modelowe z użyciem prekursorów heterocyklicznych amin aromatycznych wykazały, że skutecznym sposobem na obniżenie wydajności procesu ich syntezy jest stosowanie dodatków o właściwościach przeciwutleniających, między innymi flawonoidów oraz witaminy C i E [14, 67, 68]. Źródłem naturalnych przeciwutleniaczy mogą być tradycyjnie stosowane przyprawy i dodatki do mięs, takie jak cebula, czosnek, przyprawy roślinne (pieprz, papryka, zioła) lub ekstrakty owocowe [12, 16, 69, 70, 71, 72]. Wyniki badań dotyczących oznaczania HAA, głównie z grupy amin polarnych, w potrawach sporządzonych z udziałem składników roślinnych wskazują jednak, że zależnie od ilości dodatków oraz rodzaju mięsa, do którego są wprowadzane, może następować obniżenie stężeń niektórych amin heterocyklicznych, przy równoczesnym wzroście stężeń innych związków z tej grupy [8, 15, 18, 72, 73, 74, 75]. Naturalne dodatki do mięs zawierają bowiem nie tylko związki przeciwutleniające, ale także cukry i aminokwasy, które są prekursorami heterocyklicznych amin aromatycznych [73, 76]. 1.6 Metody wyodrębniania i oznaczania karbolin w żywności Podstawowym problemem związanym z oznaczaniem heterocyklicznych amin aromatycznych w żywności wysokobiałkowej jest niskie stężenie tych związków (rzędu ng/g) oraz matryca próbek, która charakteryzuje się złożonym składem. Z tych dwóch powodów konieczne jest stosowanie procedur umożliwiających selektywne wyizolowanie z próbek potraw mięsnych koncentratu karbolin, w którym zawartość poszczególnych związków będzie wystarczająco duża, by mogły zostać oznaczone przy użyciu odpowiednio dobranej techniki analitycznej. 1.6.1 Wyodrębnianie z żywności wysokobiałkowej frakcji karbolin Karboliny należą do heterocyklicznych związków azotu, dlatego w początkowej fazie wielu procedur ich wyodrębniania z żywności są one ekstrahowane razem z innymi składnikami o podobnej budowie, między innymi z polarnymi aminami heterocyklicznymi, a także azaarenami [12, 77, 78, 79, 80, 81], a dopiero kolejne etapy, prowadzone najczęściej techniką ekstrakcji do fazy stałej, umożliwiają uzyskanie koncentratu karbolin. Ze względu na bardzo złożony skład próbek żywności wysokobiałkowej proces izolowania z nich heterocyklicznych amin aromatycznych poprzedzony zostaje zwykle 26

etapem wytrącania białka i hydrolizy alkalicznej tłuszczów [64, 71, 77, 79, 82, 83, 84, 85]. Początkowo do wyodrębniania heterocyklicznych amin aromatycznych z próbek mięsa stosowano klasyczną ekstrakcję cieczową, z użyciem rozpuszczalników organicznych, między innymi acetonitrylu, dichlorometanu, acetonu, octanu etylu, metanolu lub alkoholowych roztworów wodorotlenku sodu [9, 82]. Ekstrakty te były następnie oczyszczane techniką chromatografii jonowymiennej na żywicy typu Amberlit bądź przy użyciu, adsorbującej heterocykliczne aminy, bawełny z barwnikiem zawierającym kationy miedzi (blue rayon, blue cotton), umieszczonej w kolumnie szklanej lub bezpośrednio wprowadzanej do roztworu [82]. Gross i Grüter [62] opracowali procedurę izolowania heterocyklicznych amin aromatycznych, której podstawą była ekstrakcja cieczowa z użyciem obojętnej ziemi okrzemkowej (nazwa handlowa Kieselguhr lub Extrelut), jako nośnika fazy wodnej. Materiał ten może być stosowany do ekstrakcji roztworów o ph w zakresie od 1 do 13, a zatem również do próbek poddanych hydrolizie kwaśnej lub alkalicznej. Metoda opracowana przez Gross a i Grüter a oraz liczne jej modyfikacje były i wciąż są stosowane przez wielu autorów badań związków z grupy HAA [12, 71, 83, 86, 87, 88, 89, 90]. Do elucji związków organicznych z hydrolizatu próbek mięsa zmieszanego z ziemią okrzemkową używany jest najczęściej dichlorometan. Celem wyizolowania z tego ekstraktu frakcji zawierającej heterocykliczne aminy aromatyczne konieczne jest wprowadzenie kolejnego etapu - ekstrakcji do fazy stałej (SPE). W procedurze Gross a i Grüter a zastosowano kolumienki wypełnione wymieniaczem kationowym posiadającym związane z żelem krzemionkowym grupy propylosulfonowe (PRS). Utworzenie tandemu złożonego z kolumn PRS i SPE z fazą chemicznie wiązaną C-18 oraz jego przemywanie roztworem o słabo zasadowym ph umożliwia wyizolowanie zaadsorbowanych na złożu PRS amin heterocyklicznych i ich wzbogacenie na złożu kolumny SPE- C-18. W literaturze opisane zostały metody izolacji związków z grupy HAA przy użyciu innych kolumn SPE, między innymi z żelem krzemionkowym, z polimerycznym wymieniaczem kationowym modyfikowanym grupami siarczanowymi [23, 30, 67, 75, 82]. Procedura zaproponowana przez Gross a i Grüter a (z użyciem ziemi okrzemkowej, kolumn SPE z fazą kationowymienną i C-18) nadal jest jednak 27

powszechnie stosowana, zwłaszcza w badaniach próbek żywności wysokobiałkowej [81, 82, 86, 89, 91]. Z nowszych technik izolowania i zatężania frakcji niepolarnych heterocyklicznych amin aromatycznych warto wymienić mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) [21, 92], ekstrakcję z użyciem polipropylenowych rurek membranowych [64] oraz połączenie ekstrakcji rozpuszczalnikowej wspomaganej ultradźwiękami z mikroekstrakcją [93, 94]. Zastosowanie tych szybkich i przyjaznych środowisku technik związane jest jednak z dostępem do specjalistycznej, drogiej aparatury analitycznej. 1.6.2 Techniki instrumentalne stosowane do oznaczania karbolin Ze względu na niskie stężenia heterocyklicznych amin aromatycznych w ekstraktach wyizolowanych z próbek żywności wysokobiałkowej oraz możliwość ich występowania w mieszaninie związków o podobnej strukturze chemicznej, oznaczanie karbolin wymaga zastosowania czułych i selektywnych technik analizy instrumentalnej. Najczęściej wykorzystywana jest w tym celu technika chromatografii cieczowej (LC) z detekcją fluorescencyjną (FLD) lub w sprzężeniu ze spektrometrią mas (MS). HPLC-FLD i HPLC-DAD. Związki z grupy karbolin, w przeciwieństwie do aminoazaarenów (imidazochinoliny i imidazochinoksaliny) wykazują zdolność do fluorescencji w polarnych rozpuszczalnikach, dlatego mogą być oznaczane przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją fluorescencyjną (FLD) [18, 72, 75, 79, 82, 84, 89, 91.95]. Detektor UV z matrycą diodową (DAD) jest zwykle stosowany do analizy polarnych amin heterocyklicznych, chociaż bywa też wykorzystywany do oznaczania związków z grupy karbolin [20, 74, 77, 87, 95]. LC-MS i LC-MS/MS. Bardzo czułą techniką oznaczania związków organicznych, pozwalającą zarazem na jednoznaczną ich identyfikację, jest chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) lub z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Pomimo znacznych kosztów takich zestawów analitycznych w ostatnim dziesięcioleciu ukazało się wiele publikacji prezentujących wyniki oznaczeń karbolin przy zastosowaniu tej techniki [30, 64, 81, 85, 86, 90, 96]. UPLC-MS. Ultrasprawna chromatografii cieczowa UPLC (ang. Ultra- Performance Liquid Chromatography) to nowoczesna technika, która dzięki użyciu krótkich kolumn chromatograficznych z wypełnieniem o bardzo małych rozmiarach 28

pozwala na skrócenie czasu analizy do kilku minut. Jej zaletą jest dobra rozdzielczość i duża czułość oraz powtarzalność. W ostatnich latach UPLC w sprzężeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest coraz częściej wykorzystywana do oznaczania karbolin w żywności [23, 67, 71, 83, 88]. W odróżnieniu od technik chromatografii cieczowej zastosowanie chromatografii gazowej (GC), również w sprzężeniu ze spektrometrią mas, wiąże się z koniecznością przeprowadzenia heterocyklicznych amin aromatycznych w mniej polarne, lotne pochodne. Jedynie -karboliny (harman i norharman), które nie posiadają grupy aminowej mogą być oznaczane przy użyciu tej techniki bez konieczności wprowadzenia dodatkowego etapu modyfikacji związków. Prawdopodobnie z tego powodu GC-MS stosowano tylko w nielicznych pracach dotyczących oznaczania karbolin w żywności [82, 97]. 29

2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY Badania epidemiologiczne wskazują na istotny wpływ środowiska życia człowieka na stan jego zdrowia i podatność na choroby cywilizacyjne, w tym nowotworowe i neurodegeneracyjne [6, 7, 57, 58]. Jednym z czynników ryzyka rozwoju chorób nowotworowych jest duże spożycie przetworów mięsnych [1-5], w których podczas obróbki termicznej w warunkach powszechnie stosowanych w gospodarstwach domowych i zakładach gastronomicznych mogą tworzyć się mutagenne i kancerogenne związki. Należą do nich między innymi wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, nitrozoaminy i heterocykliczne aminy aromatyczne. Ocena stopnia narażenia człowieka na ksenobiotyki pochodzące z diety jest możliwa pod warunkiem poznania składu i stężeń związków w potrawach często przez niego spożywanych. Zagadnienie będące przedmiotem badań, to jest: występowanie heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin w żywności przetwarzanej termicznie w sposób często stosowany w polskich kuchniach stanowi jak dotąd niewystarczająco rozpoznany problem, mimo iż związki te zostały zaliczone przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC) do czynników przypuszczalnie rakotwórczych dla ludzi [49]. Zgodnie z najnowszymi doniesieniami niektóre z karbolin wykazują również działanie neurotoksyczne [55, 57]. Celem podjętych badań było oznaczenie stężeń heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin w próbkach potraw mięsnych przygotowanych w warunkach domowych, w sposób odpowiadający tradycyjnym przepisom kulinarnym stosowanym w polskich gospodarstwach domowych, zwłaszcza na Górnym Śląsku, a także ocena nowoczesnego sposobu przygotowania potraw poprzez pieczenie mięsa w rękawie foliowym w odniesieniu do tworzenia się ksenobiotyków z grupy karbolin. Ze względu na częste spożywanie sosów, które zgodnie z tradycją kuchni polskiej stanowią nieodłączny składnik dania mięsnego, poddano badaniom również ten materiał w celu sprawdzenia czy i w jakim stopniu przenikają do nich karboliny podczas duszenia potrawy z dodatkiem wody. Należy podkreślić, że kompleksowa analiza związków z grupy karbolin w daniach mięsnych, z uwzględnieniem ich występowania zarówno w mięsie jak i w sosie powstającym podczas smażenia, jest zagadnieniem nowym w Polsce oraz na świecie. Kolejnym celem badań była próba odpowiedzi na pytanie: czy istnieje możliwość obniżenia stężeń związków z grupy karbolin w daniach mięsnych poprzez zastosowanie dodatków zawierających substancje o działaniu przeciwutleniającym, 30

tradycyjnie używanych w kuchni polskiej, takich jak czosnek, cebula lub suszone owoce? Ten etap pracy zaplanowano z uwagi na nie zawsze jednoznaczne wyniki opublikowanych badań, wskazujące że antyoksydanty polifenolowe wywierają na ogół hamujący wpływ na rodnikowy mechanizm syntezy heterocyklicznych amin aromatycznych, chociaż w zależności od stężenia mogą również powodować wzrost stężeń tych związków [15,18, 70, 71]. W literaturze przedmiotu brak jest danych na temat wpływu suszonych śliwek, moreli i żurawiny na tworzenie się heterocyklicznych związków azotu. Należy podkreślić, że nieliczne badania dotyczące roli czosnku i cebuli w syntezie HAA przeprowadzono dotychczas głównie w warunkach laboratoryjnych i w układach modelowych. Cząstkowe cele podjętych w tej pracy badań, zmierzających do oznaczenia wybranych prokancerogennych i neurotoksycznych heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin tworzących się podczas termicznego przetwarzania żywności wysokobiałkowej były następujące: 1. Opracowanie metody identyfikacji i oznaczania ilościowego związków z grupy α-, β-, γ-, i δ-karbolin techniką chromatografii cieczowej z detekcją fluorescencyjną i UV. 2. Opracowanie metody izolowania z matrycy próbek mięs oraz sosów frakcji heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin. 3. Oznaczenie wybranych karbolin w próbkach potraw mięsnych przygotowanych w warunkach domowych w sposób tradycyjny dla kuchni polskiej. 4. Określenie wpływu przypraw (cebuli i czosnku) oraz dodatku suszonych owoców na powstawanie wybranych karbolin w potrawach przygotowywanych z jednego gatunku mięsa. Uzyskane wyniki pozwolą poszerzyć wiedzę na temat warunków tworzenia się karbolin i sposobów ograniczenia ich syntezy w termicznie przetwarzanej żywności wysokobiałkowej. 31

3. MATERIAŁ I METODY 3.1 Aparatura i odczynniki Aparatura. Dejonizator wody typ Milli-Q firmy Millipore GesmbH, (Wiedeń, Austria) Homogenizator laboratoryjny MPW-120 firmy Med. Instruments (Warszawa) System do ekstrakcji do fazy stałej SPE-12G firmy Baker Zestaw do odparowywania nadmiaru rozpuszczalnika w atmosferze azotu model VLM EVA firmy VLM GmbH (Niemcy) ph-metr laboratoryjny firmy Five Easy FE20 firmymettler Toledo AG (Szwajcaria) Chromatograf cieczowy Ultimate 3000 TSL firmy Dionex Softron z detektorem z matrycą diodową DAD (Niemcy) Detektor fluorescencyjny firmy Shimadzu RF-2000 (Japonia). Rozpuszczalniki i odczynniki Dichlorometan i toluen, cz.d.a (Avantor Performance Materials Poland S.A.) Acetonitryl do HPLC, gradient grate (Avantor SA) Metanol do HPLC (Avantor SA) Trietyloamina, do HPLC (Fisher Sci. UK) Octan amonu cz.d.a. (Avantor SA) Wodorotlenek sodu cz.d.a. (Avantor SA), Kwas solny cz.d.a. (Avantor SA) 85% -owy kwas fosforowy (V) (Merck) Amoniak 25%, cz.d.a. (Avantor SA) Złoże do ekstrakcji- ziemia okrzemkowa Extrelut NT 20 (Merck, Niemcy). Do oznaczenia właściwości przeciwutleniających dodatków roślinnych zastosowano odczynniki: Chlorek żelaza(iii) sześciowodny (cz.d.a., Chempur) Odczynnik TPTZ (2,4,6 tri-(2-pirydylo)-s-triazyna) (98%, do oznaczeń spektrofotometrycznych, Sigma) Odczynnik DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (98%, Sigma-Aldrich) Troloks- kwas (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylo-chromano-2-karboksylowy (Aldrich), z którego sporządzono roztwór bazowy o stężeniu 2,5 mm/l. Z tego 32

roztworu sporządzano następnie rozcieńczenia, których użyto do wyznaczenia krzywej kalibracji. Kwas galusowy (Sigma Aldrich), z którego sporządzono roztwór bazowy o stężeniu 0,5 g/l (etanol + woda, 1:9 v/v). Kolumny do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) Wypełnione kwasem propylosulfonowym (PRS) 500 mg (J. T. Baker, Niemcy) Wypełnione fazą chemicznie wiązaną (C-18) 500 mg (J. T. Baker). Kolumna analityczna do HPLC TSK gel ODS 80 TM o wymiarach 250 x 4,6mm x 5 m (uziarnienie) firmy Tosoh Biosep (Niemcy) z odpowiednią dla niej przedkolumną z filtrem ODS, Octyl, Phenyl, 4mm x ID x 4mm (Tosoh Biosep). Substancje wzorcowe: Wzorce karbolin: 1-metylo-9H-pirydo[3,4-b]indol (norharman) i 9H-pirydo[3,4- b]indol (harman) firmy Sigma Aldrich; 2-amino-9H-pirydo[2,3-b]indol (A C); 2- amino-3-metylo-9h-pirydo[2,3-b]indol (MeA C); 3-amino-1,4-dimetylo-5Hpirydo[4,3-b]-indol (Trp-P-1); 3-amino-1-metylo-5H-pirydo[4,3-b]indol (Trp-P-2); 2- amino-6-metylodipirydo-[1,2-a:3,2d]-imidazol (Glu-P-1); 2-aminodipirydo-[1,2-a:3,2- d]imidazol (Glu-P-2) wszystkie firmy Toronto Research Chemicals (Ontario, Kanada). Wzorce heterocyklicznych amin aromatycznych, stosowane na etapie opracowania metody izolowania frakcji karbolin i ich oznaczania techniką HPLC-DAD- FLD: 2-amino-3-metyloimidazo[4,5-f]chinolina (IQ); 2-amino-3,8- dimetyloimidazo[4,5-f]chinoksalina (MeIQ); 2-amino-3,4-dimetyloimidazo[4,5- f]chinolina (MeIQ); 2-amino-3,4,8-trimetyloimidazo[4,5-f]chinoksalina (4,8-DiMeIQx); 2-amino-1-metylo-6-fenyloimidazo[4,5-b]pirydyna (Toronto Research Chemicals, Ontario, Kanada) 3.2 Dodatki pochodzenia roślinnego do mięs Cebulę (Allium cepa L.) i czosnek (Allium sativum L.) oraz suszone owoce: śliwki, morele i żurawinę kupiono w lokalnych sklepach. Cebulę w ilości 2 kg i czosnek 33

produkcji polskiej w ilości 1 kg obrano z łusek, rozdrobniono nożem oraz blenderem, uzyskując dwie porcje dodatków zastosowanych następnie do przygotowania rolad i sznycli. Suszone owoce wykorzystano do sporządzenia nadziewanych pieczeni ze schabu. Owoce zakupiono w opakowaniach o masie 200g. Przed użyciem owoce zostały rozdrobnione za pomocą noża i blendera. Śliwki suszone, produkcji polskiej, nie zawierały konserwantów. Suszone morele, produkcji niemieckiej, według deklaracji na etykiecie zawierały konserwant- SO2. Żurawina suszona, produkcji niemieckiej, zawierała jako konserwant kwas sorbowy (kwas heksa-2,4-dienowy). 3.3 Przedmiot badań 3.3.1 Wzorce heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy -, -, - i - karbolin Do określenia optymalnych warunków oznaczania karbolin techniką HPLC-FLD i detekcji z użyciem detektora z matrycą diodowa (DAD), jak również do opracowania procedury izolacji tych związków z próbek żywności oraz ich oznaczania w frakcjach wyodrębnionych z dań mięsnych wykorzystano roztwory ośmiu najczęściej oznaczanych w żywności karbolin, tj. A C, MeA C, norharmanu, harmanu, Trp-P-1, Trp-P-2, Glu-P-1 i Glu-P-2 [10, 15, 19, 26, 64, 75, 84, 88, 91]. Wzory tych związków przedstawiono w Tabeli I. Roztwór wzorcowy karbolin o stężeniu 1 mg/l (czyli 1 g/ml = 1 ng/ l) w metanolu sporządzono z roztworów bazowych poszczególnych związków o stężeniu 0,2 g/ml metanolu. 3.3.2 Próbki żywności (mięsa i sosy) Przedmiotem badań były próbki pochodzące z następujących potraw mięsnych: 1. sznycle bez panierki, 2. zrazy zawijane (zwane na Śląsku roladami), 3. schab pieczony w foliowym rękawie. Dania te przygotowywano w warunkach domowych według przepisów kulinarnych często stosowanych w gospodarstwach domowych na terenie Górnego Śląska (rolady i sznycle), a schab w folii - według procedur podawanych w prasie i na stronach internetowych dotyczących gotowania. Charakterystykę i sposoby 34

przygotowania próbek żywności, z uwzględnieniem temperatury, czasu obróbki termicznej oraz stosowanych dodatków zawarto w Tabeli V. Wszystkie potrawy sporządzono ze schabu wieprzowego zakupionego w lokalnym sklepie. Kości oraz niektóre fragmenty tkanki tłuszczowej zostały usunięte przed przygotowaniem potraw, które sporządzono z świeżego (niemrożonego) mięsa w dniu jego zakupu, a obróbce cieplnej poddano następnego dnia. Sznycle i rolady przygotowano ze schabu pochodzącego od jednego zwierzęcia, podobnie jak cztery rodzaje pieczeni w foliowym rękawie ze schabu od kolejnego zwierzęcia. Badaniom poddane zostały dania mięsne przygotowane bez dodatków oraz z zastosowaniem składników pochodzenia roślinnego: cebuli (30g/100g mięsa), czosnku (15g/100g mięsa) oraz suszonych owoców (200g/kg mięsa pieczonego w folii). Poszczególne porcje przygotowano i poddawano procesom termicznym z zachowaniem powtarzalności takich parametrów jak: grubość oraz masa porcji mięsa, temperatura, czas obróbki termicznej. Sznycle i rolady smażono na kuchence gazowej, z użyciem tej samej patelni, jednorazowo po dwie porcje mięsa. Wszystkie potrawy zostały przygotowane bez dodatku soli i innych przypraw (poza wymienionymi w Tabeli V). Ze względu na możliwy wpływ tłuszczu na tworzenie się heterocyklicznych amin aromatycznych, smażenie sznycli i rolad przeprowadzono bez dodatku tłuszczu. Mięso poddawano próbce termicznej do momentu, kiedy można było je uznać za dobrze wypieczone. Po wystudzeniu przygotowanych dań mięsnych usunięto z nich pozostałości dodatków roślinnych, a następnie wszystkie porcje danego rodzaju potrawy zmielono dwukrotnie przy użyciu elektrycznej maszynki do mielenia mięsa i wymieszano mikserem elektrycznym. Z 400-gramowych porcji surowego mięsa, z którego sporządzono rolady oraz sznycle uzyskano po około 300g każdej z próbek uśrednionych (sznycle bez dodatków, sznycle z cebulą, sznycle z czosnkiem, rolady bez dodatków, rolady z cebulą i rolady z czosnkiem), natomiast z 1 kilogramowych porcji schabu pieczonych w folii otrzymano po około 550g próbek uśrednionych (schab bez dodatków, schab ze śliwkami, schab z morelami i schab z żurawiną). Z tak uzyskanych uśrednionych próbek potraw odważono odpowiednie porcje, które poddawano procedurze analitycznej, zmierzającej do wyizolowania i oznaczenia karbolin. 35

Tabela V. Charakterystyka próbek żywności. Rodzaj potrawy Sznycle ze schabu, bez panierki Rolady (zrazy) ze schabu Schab pieczony w foliowym rękawie Rodzaj próbki żywności -mięso - sos -mięso - sos -mięso Rodzaj dodatku 1. brak 2. cebula (0,3g/g mięsa) 3. czosnek (0,15g/ g) 1. brak 2. cebula (0,3g/g) 3. czosnek (0,15g/ g) 1. brak 2. suszone śliwki (0,2g/ g) 3. suszone morele (0,2g/g) 4. suszona żurawina (0,2g/g) Sposób przygotowania Porcje mięsa o masie 100g i grubości 1cm lekko utłuczono do grubości ok 0,7cm. Rozdrobnioną cebulę lub czosnek rozprowadzono po obu stronach plastra (połowa porcji z każdej strony). Każdą porcję mięsa (bez dodatku oraz z cebulą lub czosnkiem) owinięto folią spożywczą i pozostawiono na 12 godzin w temp. 4 C. Przed smażeniem cebula oraz czosnek zostały usunięte. Tak przygotowane sznycle smażono przez 6 minut z każdej strony bez tłuszczu na patelni z powłoką teflonową wstępnie ogrzanej do 200 C. Podczas smażenia temperatura wewnątrz porcji mięsa wynosiła około 170 C. Następnie dodano 100 ml wody i duszono pod przykryciem, przez 10 minut w temperaturze 95-98 C. Porcje mięsa o masie 100g i grubości 1cm utłuczono i zwinięto (bez wypełniania oraz wypełnione cebulą lub czosnkiem), tworząc rolady o średnicy ok 3cm i długości ok 10 cm. Każdą porcję mięsa (bez dodatku oraz z cebulą lub czosnkiem) owinięto folią spożywczą i pozostawiono na 12 godzin w temp. 4 C. Rolady smażono przez 20 minut na patelni wstępnie ogrzanej do 200 C. Temperatura wewnątrz mięsa wynosiła około 170 C. Następnie do naczynia dodano 200 l wody i duszono pod przykryciem przez 1 godzinę w temperaturze 95-98 C. Przygotowano 4 porcje schabu o masie 1kg. W 3 z nich przez całą długość porcji wydrążono otwory o średnicy ok 3cm, które wypełniono suszonymi owocami. Każdą porcję o długości ok 20cm, szerokości 10 cm oraz obwodzie ok 18cm zapakowano w folię spożywczą i przechowywano przez 12 godzin w temp. 4 C.. Następnie kawałki schabu umieszczono oddzielnie w rękawie do pieczenia (polskiej firmy Paclan), w taki sposób, by po każdej stronie porcji mięsa pozostało ok 10 cm rękawa. Oba końce folii zamknięto szczelnie klipsem. Porcje schabu ułożono na blasze do pieczenia, umieszczono w piekarniku nagrzanym do 200 C i pieczono przez 30 minut. Następnie temperaturę obniżono do 180 C i pieczono przez kolejne 60 minut. Na 10 minut przed końcem folię rozcięto w celu zarumieniania pieczeni. 36

Ciekłe pozostałości (sosy) powstałe podczas smażenia wszystkich porcji danego rodzaju potrawy połączono, uzyskując 6 uśrednionych próbek (sosy z sznycli i rolad, bez dodatków oraz z cebulą i czosnkiem), z których po odparowaniu nadmiaru wody za pomocą strumienia azotu otrzymano materiał badawczy w postaci brązowej gęstej cieczy. Masy poszczególnych próbek sosów wynosiły około 60g. Określanie dokładnej masy każdej próbki sosu oraz znajomość masy mięsa, z której go otrzymano jest istotne do przeprowadzenia analizy ilościowej i wyrażenia wyników uzyskanych dla sosu w ng/g smażonego mięsa. W czasie przygotowania potraw w folii nie otrzymano sosu (dno rękawa pozostało suche). 3.4 Dobór warunków oznaczania heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją fluorescencyjną (FLD) Oznaczanie wybranych związków z grupy karbolin przeprowadzono techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy użyciu chromatografu cieczowego z detektorem UV z matrycą diodową DAD i fluorescencyjnym. Optymalne warunki oznaczania karbolin określono na podstawie wyników analiz roztworu wzorcowego zawierającego 8 związków stanowiących przedmiot badań, to jest: A C, MeA C, NH, H, Trp-P-1, Trp-P-2, Glu-P-1 i Glu-P-2 oraz 5 związków z grupy aminoazaarenów (IQ, MeIQ, MeIQx, 4,8-diMeIQx i PhIP). Do rozdzielenia składników tej mieszaniny zastosowano kolumnę TSK gel ODS 80TM (250mm - 4,6mm, 5 m) firmy Tososoh Biosep (Niemcy) i elucję gradientową, przy użyciu acetonitrylu (A) oraz roztworu (B) zawierającego acetonitryl (5%) i bufor o ph 3,3, który sporządzono z wodnego roztworu trietyloaminy i z kwasu fosforowego (V). Elucja prowadzona była w temperaturze 40º C, przy przepływie fazy ruchomej wynoszącym 1ml/min. Program elucji był następujący: 100% roztworu B przez 2 minuty, wzrost liniowy do uzyskania składu fazy ruchomej 25% A i 75% B w ciągu 20 minut, następnie wzrost do 55% A w ciągu 10 minut i stały przepływ eluentu o tym składzie przez następne 10 minut. W celu uzyskania na chromatogramie sygnałów o maksymalnej dla badanych związków intensywności, wprowadzono program zmian długości fal wzbudzenia i emisji ex/ em detektora fluorescencyjnego, optymalnie dostosowany do czasów retencji oznaczanych związków. Program ten był następujący: 37

360nm/450nm do 14 min, czyli w zakresie, w którym z kolumny wyeluowane zostają Glu-P-2 i Glu-P-1; 300nm/440nm do 18min, celem oznaczenia NH i H; 263nm/400nm do 25 min (Trp-P-2 i Trp-P-1); 335nm/410nm do końca analizy (AαC i MeAαC). Podane powyżej wartości ( ex/ em) wybrano w wyniku porównania intensywności sygnałów FLD zarejestrowanych dla poszczególnych związków wprowadzonych na kolumnę w roztworze metanolowym w ilości 10ng oraz na podstawie danych bibliograficznych [21,32, 79, 98]. Zastosowany układ chromatograficzny HPLC-DAD-FLD pozwala na równoczesne z detekcją fluorescencyjną monitorowanie wyników rozdzielenia składników mieszaniny przy określonych długościach fal UV. Jako optymalną wybrano =263nm, stosowaną do oznaczania polarnych amin heterocyklicznych [12]. Intensywność sygnałów odpowiadająca polom powierzchni pików na chromatogramie rejestrowanym przy użyciu detektora DAD, przy długości fali 263nm była dla karbolin - zależnie od związku - od 200 (H, NH, Trp-P-2, Trp-P-1, A C, MeA C) do 400 (Glu- P1 i Glu P-2) razy niższa w porównaniu do intensywności sygnału FLD, dlatego też do oznaczenia ich stężeń w próbkach żywności wykorzystano wskazania detektora fluorescencyjnego. 3.5 Opracowanie metody izolowania frakcji karbolin Matryca próbek mięsa i produktów powstających podczas jego obróbki termicznej charakteryzuje się złożonym składem. Zawiera m.in. tłuszcze, białka i barwniki. Oznaczenie heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin w tym materiale wymaga poddania próbek żywności procesowi hydrolizy i ekstrakcji, celem wyizolowania frakcji karbolin i jej oddzielenia od innych związków, tworzących się podczas obróbki termicznej, a także naturalnie występujących w żywności. Procedury stosowane przez wielu autorów dotyczące analizy heterocyklicznych amin aromatycznych z żywności [12, 82, 86] są najczęściej modyfikacją metody opracowanej przez Gross a i Grüter a [62] dla gotowych komercyjnych ekstraktów mięsnych. Polega ona na ekstrakcji cieczowej z użyciem ziemi okrzemkowej 38

i ekstrakcji do fazy stałej (SPE) na kolumnach wypełnionych kwasem propylosulfonowym (PRS) oraz fazą chemicznie wiązaną C-18. SPE 3.5.1 Izolowanie frakcji karbolin przy użyciu mieszaniny wzorców techniką Wstępny etap badań miał na celu wyodrębnienie koncentratu karbolin i wyznaczenie optymalnych warunków oddzielenia frakcji karbolin od innych związków mogących występować w termicznie przetwarzanej żywności. Etap ten przeprowadzono z użyciem mieszaniny wzorcowej zawierającej 8 karbolin (Tabela I) i polarne aminy heterocykliczne (MeIQx i PhIP). Przetestowano dwie procedury oparte na metodzie Gross a i Grüter a [62]: pierwsza była stosowana przez Toribo i wsp. do wyodrębniania polarnych i niepolarnych związków z grupy HAA z komercyjnego ekstraktu mięsnego [80] (Procedura SPE I), natomiast druga została wykorzystana do wyizolowania frakcji polarnych amin heterocykliczcznych z żywności wysokobiałkowej [12] (Procedura SPE II). Procedura SPE I Kierując się wynikami badań Toribio i in. [80] dotyczących porównania kilku procedur wydzielania heterocyklicznych związków azotu z ekstraktu mięsnego, zastosowano metodykę o najlepszej wydajności dla karbolin do rozdzielenia składników w/w mieszaniny wzorcowej. Metodyka wydzielania karbolin obejmowała następujące etapy: Etap 1: Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) z użyciem kolumn wypełnionych fazą PRS (500mg) i C-18 (500mg), kondycjonowanych chlorkiem metylenu (SPE-PRS) oraz metanolem i wodą (SPE-C-18). Roztwór wzorcowy 8 karbolin i 2 amin heterocyklicznych w metanolu (po 200ng każdego wzorca /2ml) naniesiono na kolumnę SPE-PRS. Elucję prowadzono kolejno 6ml 0,01M HCl, 15ml roztworu metanolu z HCl (6:4 v/v) i 2ml wody. Uzyskany eluat w ilości 23ml zobojętniono za pomocą 0,5ml amoniaku, a następnie dodano 25ml wody dejonizowanej. Roztwór ten stopniowo wprowadzano na kolumnę SPE-C-18. Zgodnie z instrukcją [80] niepolarne HAA (karboliny) eluowano 39

z kolumienki SPE-C-18 roztworem metanolu z NH3 (9:1, v/v). Frakcję tę poddano następnie analizie techniką HPLC-DAD-FLD. Etap 2: Tandemowa ekstrakcja do fazy stałej w układzie SPE - PRS-C-18 Kolumnę ze złożem PRS z I etapu połączono w tandem z nową kolumną SPE-C- 18 (500mg) i przemywano 20ml 0,5M octanu amonu o ph=8. Po rozłączeniu tandemu kolumnę SPE-C-18 przemywano roztworem metanolu z amoniakiem (9:1, v/v), a ekstrakt uzyskany po odparowaniu rozpuszczalnika poddano analizie techniką HPLC- DAD-FLD. Frakcja ta powinna zawierać polarne HAA. Dodatkowo, dla sprawdzenia skuteczności tej procedury do wyodrębniania karbolin z mieszaniny wzorcowej, zastosowano przemywanie kolumny SPE-PRS 10ml wody dejonizowanej oraz roztworem metanolu z amoniakiem (9:1; v/v). Po odparowaniu rozpuszczalnika frakcję metanolową poddano analizie techniką HPLC- DAD-FLD. Procedura SPE II Druga z testowanych procedur była wcześniej stosowana do izolowania frakcji polarnych amin heterocyklicznych z próbek żywności, jednak nie została przebadana pod względem separacji związków z grupy karbolin [12]. Jej modyfikacja w stosunku do metodyki Gross a i Grüter a [62] polegała na użyciu kolumn SPE o większej zawartości złoża i dostosowaniu objętości eluentów umożliwiających wyizolowanie analitów z kolumn PRS i C-18. Schemat tej procedury izolowania karbolin techniką SPE był krótszy od metodyki Toribio i wsp. [80]. Obejmował on następujące etapy: Etap 1: Roztwór wzorcowy 8 karbolin i 2 amin heterocyklicznych w metanolu (po 200ng każdego wzorca/2ml) naniesiono na kolumnę SPE PRS (500mg) i przemywano kolejno 6ml 0,1M HCl i 2ml wody. Etap 2: Utworzono tandem złożony z tej kolumny PRS i kolumny SPE-C-18 (500 mg), który powoli przemywano 20ml 0,5M roztworu octanu amonu o ph=8. Po rozłączeniu tandemu, przemyciu każdej z kolumn wodą i ich osuszeniu, zaadsorbowane na nich związki eluowano roztworem metanolu z amoniakiem (9:1, v/v). Po odparowaniu rozpuszczalników każdą z frakcji poddano analizie techniką HPLC-DAD-FLD. 40

Na podstawie wyników oznaczeń składu frakcji wyizolowanych według Procedury SPE I i Procedury SPE II stwierdzono, że obydwie pozwalają na rozdzielenie mieszaniny heterocyklicznych amin aromatycznych na dwie podgrupy zawierające odpowiednio: - i -karboliny (A C, Me C, Glu-P-1 i Glu-P-2), które wymywano razem z aminoazaarenami (MeIQx i PhIP) z kolumn z fazą C-18 oraz mniej polarne - i -karboliny (NH, H, Trp-P-2 i Trp-P-1), które eluowano z kolumn SPE-PRS. Porównanie obydwu sposobów wyodrębniania frakcji karbolin z mieszaniny pozwala stwierdzić, że Procedura SPE II jest mniej pracochłonna i bardziej ekonomiczna: wymaga użycia tylko 2 kolumienek, a prowadzona w systemie połączonych ze sobą kolumn pozwala uniknąć dodatkowego etapu odparowania rozpuszczalników. Ponadto wydajność procesu ekstrakcji przy zastosowaniu obydwu procedur była porównywalna (wynosiła od 54% dla Glu-P-1 do 97% dla harmanu), dlatego też zdecydowano do dalszych etapów badań, zmierzających do ekstrakcji karbolin z próbek żywności, stosować Procedurę SPE II. 3.5.2 Izolowanie ekstraktów karbolin z próbek żywności z dodatkiem wzorców W celu optymalizacji warunków izolacji i oznaczania karbolin w żywności przeprowadzono badania z użyciem próbek mięsa i sosów wzbogaconych znaną ilością substancji wzorcowych. Zgodnie z procedurą stosowaną dla żywności o złożonej matrycy tłuszczowo-białkowej wybrane próbki poddano trwającej 3 godziny homogenizacji i hydrolizie alkalicznej [12,80, 99]. Uzyskany hydrolizat wzbogacono znaną ilością wzorców i zmieszano z ziemią okrzemkową typu Extrelut NT 20, po czym - po uformowaniu złoża w kolumnie - eluowano je roztworem dichlorometanu i toluenu (95+5; v/v) bezpośrednio na złoże wymieniacza jonowego PRS kolumny do ekstrakcji do fazy stałej. Kolejne etapy wyodrębniania frakcji karbolin prowadzono zgodnie z procedurą SPE II. Na podstawie wyników oznaczeń karbolin techniką HPLC FLD wyznaczono wartości odzysków wzorców dodanych do próbek żywności. 41

3.6 Wyodrębnianie i oznaczanie karbolin w próbkach żywności poddanej obróbce termicznej Badania przeprowadzono dla próbek mięsa i sosów z rolad (zrazów) oraz sznycli, a także ze schabu pieczonego w rękawie z folii, poddanych obróbce termicznej bez dodatków oraz z dodatkiem cebuli i czosnku (rolady, sznycle) lub owoców (schab w rękawie ). Równolegle z analizą każdej próbki mięsa i sosu prowadzono badanie próbki wzbogaconej wzorcami 8 karbolin. Procedura zastosowana do wyizolowania karbolin z wszystkich próbek mięsa stanowiących przedmiot badań obejmuje następujące procesy i czynności: 1. Hydrolizę alkaliczną próbek mięsa (33,33g) przy użyciu 100ml 1M NaOH. 2. Zmieszanie 20-gramowych porcji hydrolizatu z 10ml 1M NaOH i 15g ziemi okrzemkowej (Extrelut NT20) oraz uformowanie złoża w kolumnie. 3. Utworzenie tandemu: kolumna z Extrelutem nad kolumną SPE PRS. 4. Przemywanie złoża Extrelutu roztworem CH2Cl2 z toluenem (95+5, v/v). W wyniku tego procesu heterocykliczne związki azotu (w tym karboliny) zostają wyeluowane z hydrolizatu mięsa i zatrzymane na kolumnie SPE z wymieniaczem jonowym PRS. 5. Osuszenie złoża kolumny PRS i jej przemywanie roztworem 0,1M kwasu solnego w celu przeprowadzenia zaadsorbowanych na nich amin w formy kationowe. 6. Utworzenie kolejnego tandemu kolumn SPE-PRS+C-18. Powolne przemywanie tego układu roztworem octanu amonu (ph=8) pozwala wyeluować α- i δ-karboliny na złoże C-18, natomiast β- i γ-karboliny pozostają związane ze złożem kolumny PRS. 7. Po rozłączeniu tandemu, przemyciu kolumn wodą i osuszeniu, zaadsorbowane na nich związki eluowano za pomocą roztworu metanolu z amoniakiem (9:1, v/v). 8. Po odparowaniu rozpuszczalnika strumieniem azotu frakcje uzyskane z 4 porcji hydrolizatu bez dodatku wzorców łączono w jedną próbkę odpowiadającą 20g mięsa. 9. Frakcje karbolin wyizolowane z próbek mięsa roztwarzano w 200 l acetonitrylu, natomiast frakcje z próbek wzbogaconych wzorcami w 200 l lub 500 l (w zależności od stężenia wzorców). 10. Oznaczenie karbolin techniką HPLC FLD. Przed analizą wszystkie frakcje zostały oczyszczone przy użyciu filtrów o średnicy porów 0,45μm. 42

Ogólny schemat procedury izolowania karbolin z próbek mięsa przedstawiają Ryciny 5 i 6. Rycina 5. Schemat postępowania prowadzący do uzyskania ekstraktu karbolin z próbki mięsa (20g) i odpowiadających jej dwóch próbek wzbogaconych we wzorce (każda z 5g mięsa). Użyty tu skrót SPE dotyczy całkowitego procesu ekstrakcji, od tandemu Extrelut SPE-PRS, po wymycie frakcji karbolin z kolumn SPE - PRS oraz SPE C-18. 43

Hydrolizat próbki + ziemia okrzemkowa (Extrelut NT 20) 1. 60ml CH 2CL 2 toluen (95:5 v/v) SPE PRS (500mg) 2. 0,5M CH 3COONH 4 (ph=8) 3. CH 3OH/NH 3 H 20 (9:1) 1. 60ml CH 2CL 2 toluen (95:5 v/v) frakcja zawiera WWA SPE C-18 (500mg) - i -karboliny 4. CH 3 OH/NH. 3 H 2 O (9:1) 4. CH 3 OH/NH. 3 H 2 O (9:1) HPLC-DAD-FLD - i -karboliny HPLC-DAD-FLD Rycina 6. Schemat procesu ekstrakcji zastosowanej do wydzielania karbolin z hydrolizatu próbek mięsa (numery 1 i 2 odpowiadają kolejności elucji, nr 1 - elucja tandemu Extrelut + SPE PRS; nr 2 elucja tandemu kolumn SPE PRS + C-18; nr 3 i 4 wymywanie karbolin z kolumn SPE). Do hydrolizy pozostałości po smażeniu stosowano 55ml 1M NaOH na 55g sosu. Uzyskany hydrolizat dzielono na 6 porcji. Trzy z nich analizowano bez dodatku wzorców, a do trzech kolejnych wprowadzono znane ilości wzorców karbolin, celem wyznaczenia ich odzysków i oceny strat. Pozostała część procesu analitycznego prowadzona była tak jak dla próbek mięsa. 44

3.7 Wyznaczanie parametrów walidacyjnych metody oznaczania karbolin Walidacja zastosowanej metody oznaczania heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin miała na celu wyznaczenie takich parametrów jak: zakres liniowości metody, granice wykrywalności i oznaczalności, odzysk analitów, powtarzalność i precyzję pośrednią [100]. Zakres liniowości metody Oznaczenia ilościowe karbolin techniką HPLC-FLD prowadzono metodą wzorca zewnętrznego, korzystając z odczytanych wartości pól powierzchni pod pikiem analitu zarejestrowanego przy długościach fal wzbudzenia i emisji, wyznaczonych jako optymalne dla poszczególnych związków. Krzywe kalibracji sporządzono metodą najmniejszych kwadratów na podstawie wyników uzyskanych z co najmniej 3 pomiarów dla ośmiu punktów kalibracyjnych (za wyjątkiem Trp-P-1 i Trp-P-2, dla których wykreślono je dla sześciu punktów). Granice wykrywalności i oznaczalności Granice wykrywalności LOD (limit of detection) związków analizowanych techniką HPLC-FLD obliczono na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia odpowiednich krzywych kalibracyjnych, zgodnie z następującym wzorem: LOD = 3,3 s/b; gdzie: b - to współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej; s - wartość odchylenia standardowego wyników uzyskanych dla serii (n=6) próbek wzorcowych wprowadzonych na kolumnę w ilości 0,5ng. Za wartość granicy oznaczalności LOQ (limit of quantification) przyjęto 3- krotną wartość LOD. Odzysk wzorców Odzyski wzorców wyznaczono w wyniku analiz próbek żywności wzbogaconych wzorcami 8 karbolin. Badania tych próbek prowadzono równolegle z analizą próbek żywności bez dodatku karbolin. Ilość wzorców, którymi wzbogacano próbki mięs wynosiła 10 ng/g i 40 ng/g mięsa, a w przypadku sosów 7 ng/g i 15 ng/g mięsa, z którego otrzymano sos. Odzyski karbolin wyliczano z zależności: 45

gdzie: W odzysk [%]; C1 zawartość kaboliny w próbce obciążonej dodatkiem wzorców [ng/g]; C2 - zawartość karboliny w próbce nieobciążonej (ng/g); C zawartość wzorca dodanego do próbki obciążonej (ng/g). Powtarzalność i precyzja pośrednia Powtarzalność, czyli precyzję wyników uzyskanych w tych samych warunkach pomiarowych wyznaczono na podstawie wartości odchyleń standardowych oznaczeń wykonanych dla serii (n=5) próbek wzorcowych analizowanych techniką HPLC-FLD w jednym dniu (oznaczenia run-to-run ), zwierających karboliny na 3 poziomach stężeń: 0,5ng, 2,5ng oraz 5ng wprowadzonych do kolumny. Do wyznaczenia precyzji pośredniej, która określa rozrzut wyników w czasie długoterminowego procesu pomiarowego w danym laboratorium wykorzystano wyniki oznaczeń serii próbek przeprowadzonych w 5 dniowym okresie czasu (oznaczenia dayto day ). 3.8 Metody wyznaczania potencjału antyoksydacyjnego i całkowitej zawartości polifenoli w składnikach roślinnych zastosowanych jako dodatki do potraw Oznaczenia właściwości przeciwutleniających składników roślinnych zastosowanych jako dodatki do mięs przeprowadzono przy zastosowaniu dwóch spektrofotometrycznych metod zachodzących według mechanizmu przeniesienia pojedynczego elektronu z przeciwutleniacza na utleniacz. Są to metoda FRAP, która polega na wykorzystaniu siły redukcyjnej jonów żelaza (FRAP ferric ion reducing antioxidant parameter) oraz metoda DPPH, która polega na redukcji rodnika DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu) [101]. Całkowitą zawartości polifenoli oznaczono spektrofotometryczną metodą Folin- Ciocalteau [102]. Podstawą tej metody jest reakcja redukcji przez fenole w środowisku 46

alkalicznym molibdenu(vi) do molibdenu(v) zawartego w odczynniku Folina- Ciocalteau. 3.8.1 Oznaczanie właściwości przeciwutleniających ekstraktów owoców, cebuli i czosnku metodą FRAP [101] Do 1450μl roztworu sporządzonego z buforu octanowego o ph = 3,6, oraz z 10mM roztworu TPTZ i 20mM roztworu FeCl3 6H2O (zmieszanych w stosunku objętościowym 10:1:1) dodawano 50μl ekstraktu wodnego (1g owocu/10ml wody redestylowanej) badanej próbki i mieszano z użyciem worteksu, a po 8min mierzono absorbancję (spektrofotometrem HACH Lange GmbH DR 2800, Niemcy) przy λ=593nm. Próba zerowa zawierała 50μl wody redestylowanej. Wyniki oznaczeń wyrażono w równoważnikach troloksu [μm/g produktu]. 3.8.2 Oznaczanie właściwości przeciwutleniających metodą DPPH [101] Mieszano 50μl ekstraktów z 1450μl 0,10mMl roztworu DPPH i przechowywano w cieplarce o temp. 27 C przez 60min, po czym mierzono absorbancję odbarwionych roztworów przy λ=515nm. Czas reakcji wybrano jako optymalny dla wszystkich ekstraktów na podstawie krzywych zależności absorbancji od czasu. Wyniki oznaczeń wyrażono w równoważnikach troloksu [μm/g produktu]. 3.8.3 Oznaczanie całkowitej zawartości polifenoli metodą Folin-Ciocalteau Oznaczenie to przeprowadzono wg modyfikacji metody opublikowanej przez Lisanti i in. [102]. Do 125 l ekstraktu owoców dodano 1ml 0,2N odczynnika Folin- Ciocalteau, po 5min dodano 1ml 6% roztworu Na2CO3. Próbki przechowywano w temperaturze 40 o C przez 30min, po czym mierzono absorbancję przy λ=765nm względem próby zerowej zawierającej 125 l wody redestylowanej. Wyniki oznaczeń wyrażono w równoważnikach kwasu galusowego [mg GAE/g produktu]. Analizę ilościową przeprowadzono metodami krzywych kalibracyjnej sporządzonych w zakresie od 0,02 do 2 mm/l dla roztworów troloksu, wybranego jako wzorca związków o właściwościach przeciwutleniajacych w metodach FRAP i DPPH oraz dla kwasu galusowego - w zakresie od 0,025 do 0,4 mg/l - w oznaczeniach polifenoli metodą Folin-Ciocalteau. 47

3.9 Analiza statystyczna Do obliczeń statystycznych zastosowano program Statistica 13. Wyniki oznaczeń heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin poddano analizie statystycznej, przy wykorzystaniu podstawowych parametrów statystyki opisowej, takich jak średnia arytmetyczna, odchylenie standardowe oraz mediana. Normalność rozkładu dla grup sprawdzono testem W Shapiro - Wilka. Porównanie wyników oznaczeń stężeń poszczególnych karbolin w trzech rodzajach potrawach, przygotowanych z wykorzystaniem różnego rodzaju obróbki termicznej, tj. rolad, sznycli oraz schabu pieczonego w folii (wszystkie bez dodatków), przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA (dla prób wykazujących rozkład normalny) oraz nieparametrycznego testu ANOVA Kruskala - Wallisa dla prób nie wykazujących rozkładu normalnego. Dla oceny wpływu poszczególnych dodatków na stężenie badanych karbolin w trzech rodzajach potraw oraz w sosach przeprowadzono test t dla prób niezależnych (dla prób o rozkładzie normalnym) oraz U Manna - Whitneya dla porównania dwóch grup (dla prób nie wykazujących rozkładu normalnego). Wyniki oznaczeń potencjału oksydacyjnego dodatków do mięs przedstawiono przy wykorzystaniu podstawowych parametrów statystyki opisowej, takich jak wartość średnia i odchylenie standardowe. Dla zbadania korelacji pomiędzy zmiennymi uzyskanymi metodami FRAP i DPPH oraz pomiędzy nimi, a wynikami oznaczeń zawartości polifenoli metodą Folin-Ciocalteau obliczono współczynnik korelacji Pearsona. 48

4. WYNIKI 4.1 Parametry walidacyjne metody oznaczania karbolin Walidacja metody oznaczania karbolin polegała na wyznaczeniu następujących parametrów: zakresu liniowości, granic wykrywalności i oznaczalności, odzysku analitów, powtarzalności i precyzji pośredniej [100]. Tabela VI. Równania krzywych kalibracyjnych i współczynników korelacji r dla heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin oznaczanych techniką HPLC-FLD Nazwa związku (czas retencji) Glu-P-2 (9,2 min) Glu-P-1 (12,0 min) NH (17,0 min) H (18,8 min) Trp-P-2* (21,0 min) Trp-P -1* (23,0 min) A C (27,0 min) MeA C (30,2min) Zakres stężeń 0,1-10 ng/ kolumnę* Współczynnik korelacji r Zakres stężeń 0,1 2,5 ng/kolumnę Współczynnik korelacji r y = 19,72x - 0,7164 0,9993 y = 19,243x + 0,3548 0,9995 y = 17,022x - 0,9045 0,9997 y = 16,538x - 0,1692 0,9999 y = 15,796x - 0,8562 0,9996 y = 15,215x + 0,0119 0,9999 y = 18,066x - 1,2909 0,9996 y = 17,01x - 0,0253 1,0000 y = 44,203x +0,1172 1,0000 y = 44,366x + 0,0055 0,9999 y = 44,376x +1,3897 0,9997 y = 46,466x - 0,0458 1,0000 y = 16,824x - 1,2438 0,9997 y = 15,819x - 0,0967 1,0000 y = 18,138x - 0,6979 0,9998 y = 17,329x + 0,1356 1,0000 *) dla Trp P-1 i Trp-P-2 krzywe sporządzono w zakresie od 0,1 do 5 ng/kolumnę Zakres liniowości metody Krzywe kalibracyjne sporządzone dla 8 wzorców karbolin były liniowe w zakresie od 0,1ng do 10ng związku wprowadzonego do kolumny (dla Trp-P-1 i Trp- P-2 w zakresie 0,1ng do 5ng). Równania krzywych stosowanych do oznaczeń 49

ilościowych analitów w próbkach żywności (w zależności od poziomu stężeń, w jakich w niej występowały) przedstawiono w Tabeli VI. Granice wykrywalności i oznaczalności Opracowana metodyka analizy karbolin techniką HPLC-FLD z programem zmian długości fal wzbudzenia i emisji ( ex em) optymalnie dostosowanym do czasów retencji karbolin pozwoliła oznaczyć te związki na bardzo niskim poziomie stężeń, który wynosił od 0,01ng (Trp-P-1) do 0,18ng (NH) związku wprowadzonego do kolumny chromatograficznej. Wartości granic wykrywalności i oznaczalności wszystkich 8 karbolin zawarto w Tabeli VII. Objętość iniekcji roztworów acetonitrylowych frakcji karbolin wyizolowanych z próbek żywności podczas analizy chromatograficznej była stała i wynosiła 10 l. Obliczone dla próbek żywności granice LOD i LOQ wynosiły odpowiednio od 0,003 ng/g do 0,060 ng/g mięsa oraz od 0,010 ng/g do 0,181 ng/g mięsa (Tabela VII). Tabela VII. Granice wykrywalności i oznaczalności karbolin oznaczanych techniką HPLC-FLD. Nazwa związku (ng/kolumnę) LOD dla próbek mięsa (ng/g mięsa) dla sosów (ng/g mięsa) (ng/ kolumnę) LOQ dla próbek mięsa (ng/g mięsa) dla sosów (ng/g mięsa) Glu-P-1 0,016 0,016 0,014 0,047 0,047 0,043 Glu-P-2 0,037 0,037 0,034 0,112 0,112 0,102 Harman 0,029 0,029 0,027 0,087 0,087 0,080 Norharman 0,060 0,060 0,055 0,181 0,181 0,165 Trp-P-2 0,006 0,006 0,005 0,018 0,018 0,016 Trp-P-1 0,003 0,003 0,003 0,010 0,010 0,009 AαC 0,015 0,015 0,014 0,045 0,045 0,041 MeAαC 0,036 0,036 0,033 0,109 0,109 0,099 50

Odzysk wzorców Ze względu na złożony skład matrycy próbek żywności równolegle z analizą próbek mięsa i sosów prowadzono badania próbek wzbogaconych wzorcami. Miało to na celu wyeliminowanie wpływu matrycy na wyniki oznaczeń jakościowych i ilościowych poprzez wyznaczenie odzysku dla każdego z analizowanych związków. Ponadto takie postępowanie pozwoliło ocenić potencjalne straty, które mogły powstać podczas prowadzenia wieloetapowej procedury analitycznej wydzielania i oznaczania karbolin w próbkach żywności. Odzyski wzorców dodawanych do mięsa na dwóch poziomach stężeń wynosiły od 42,3% do 81,4%. Dla próbek sosów były nieco wyższe i wynosiły od 46,3 do 86%. Najwyższe odzyski wynoszące powyżej 72,7% zanotowano dla -karbolin: harmanu i norharmanu. Wartości odzysków wyznaczone dla wszystkich związków podano w Tabeli VIII. Względne odchylenia standardowe (RSD) obliczone dla wartości odzysków przedstawionych w tej tabeli wynosiły średnio 8,35% dla próbek mięsa i 15,10% dla próbek sosów. Tabela VIII. Średnie wartości odzysków wzorców dodawanych do próbek (n =12) mięsa w ilości 10 ng/g i 40 ng/g mięsa oraz sosów w ilości 7,5 ng/g i 15 ng/g mięsa. Nazwa związku Próbki mięsa Próbki sosów Odzysk [%] wzorca dodanego w ilości: Odzysk [%]wzorca dodanego w ilości: 10 ng/g 40 ng/g 7,5 ng/g 15 ng/g Glu-P-2 45,49 46,04 51,03 54,69 Glu-P-1 43,46 44,25 49,55 53,25 NH 72,68 72,74 80,90 78,55 H 76,41 81,39 85,98 82,66 Trp-P-2 45,24 47,93 61,25 63,74 Trp-P-1 60,15 60,26 65,01 65,78 A C 48,06 49,942 50,14 50,29 MeA C 42,30 43,72 46,30 52,54 51

Powtarzalność i precyzja pośrednia Powtarzalność opracowanej metodyki oznaczania karbolin, czyli precyzja, wyrażona została jako względne odchylenie standardowe (RSD) wyników uzyskanych podczas analiz roztworów wzorcowych karbolin o 3 różnych stężeniach, przeprowadzonych 5-krotnie w ciągu jednego dnia przy użyciu techniki HPLC-FLD. Wynosiła ona od 0,13% do (AαC, 5 ng/kolumnę) do 2,2% ( Trp-P-2, 0,5 ng/kolumnę). Precyzja pośrednia, wyrażona została jako względne odchylenie standardowe (RSD) wyników uzyskanych podczas oznaczeń trzech róznych stężeń karbolin, przeprowadzonych w ciągu 5 kolejnych dni. Precyzja posrednia wynosiła od 0,45% (H, Trp-P-2, Trp-P-1, AαC, dla stężenia 5 ng/kolumnę) do 4,45% (NH, 0,5 ng/kolumnę). Wyznaczone parametry powtarzalności i precyzji pośredniej oznaczeń karbolin, wyrażone jako RSD [%], przedstawiono w Tabeli IX. Tabela IX. Powtarzalność i precyzja pośrednia metody oznaczania karbolin techniką HPLC-FLD (n=5) Nazwa związku Glu-P-2 0,5 2,5 5 Glu-P-1 0,5 2,5 5 NH 0,5 2,5 5 H 0,5 2,5 5 Trp-P-2 0,5 2,5 5 Trp-P-1 0,5 2,5 5 AαC 0,5 2,5 5 MeAαC 0,5 2,5 5 Stężenie wzorca [ng/kolumnę] Powtarzalność (wyznaczona w ciągu 1 dnia) jako RSD [%] 1,44 0,82 0,78 0,27 0,76 0,15 1,54 1,10 0,84 1,53 0,65 0,49 2,21 0,43 0,32 0,57 0,52 0,40 1,28 0,28 0,13 1,56 0,46 0,24 52 Precyzja pośrednia (wyznaczona w ciągu 5 dni) jako RSD [%] 2,93 3,10 1,89 1,22 2,77 0,45 4,45 3,92 1,17 2,21 2,14 0,46 2,12 2,33 0,50 0,80 1,99 0,48 1,14 1,51 0,45 2,78 1,44 0,59

4.2 Wyniki opracowania metody oznaczania heterocyklicznych związków azotu z grupy karbolin techniką HPLC-DAD-FLD przy użyciu mieszaniny wzorców Złoże kolumny TSK gel ODS 80TM, stosowanej do rozdzielenia składników ekstraktów wyizolowanych z żywności techniką chromatografii cieczowej jest stabilne w szerokim zakresie ph od 2,5 do 7,5. Możliwe było zatem zastosowanie buforu fosforanowo-trietyloaminowego o ph 3,3 jako roztworu wyjściowego do elucji heterocyklicznych amin aromatycznych w warunkach gradientowych. Kolumna TSK gel ODS 80TM należy do najczęściej stosowanych do oznaczania tych związków w żywności [12, 17, 19, 74]. W wybranym układzie chromatograficznym możliwe było rozdzielenie składników mieszaniny wzorcowej 8 związków należących do poszczególnych grup: -, -, - i -karbolin. Czasy retencji tych związków wynosiły od 9,2 min (Glu-P-2) do 30,3 min (MeA C). Na Rycinie 7 przedstawiono chromatogram uzyskany w wyniku rozdzielenia mieszaninyi wzorcowej karbolin i ich detekcji z użyciem detektora fluorescencyjnego. 900 mv 400 KARBOL ROL I SZNYC #23 Glu-P-2 9,2 Glu-P-1 12,6 NH 16,9 Karboliny 2.5ng/2,5ul H 18,7 Trp-P-2 21,0 Trp-P-1 23,0 Ex = 300, Em = 440 Ex = 263, Em = Ex = 335, Em = 400 410 A C 27,2 MeA C 30,2 Emissio n 0 6,0 10,0 15, 0 20,0 25, 0 30, 0 min Rycina 7. Chromatogram HPLC-FLD mieszaniny wzorcowej heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin. Biorąc pod uwagę, że frakcje wyizolowane z próbek żywności mogą zawierać poza karbolinami heterocykliczne aminy aromatyczne z grupy aminoazaarenów (pochodne chinoliny- IQ i MeIQ i chinoksaliny- MeIQx i 4,8-DiMeIQx oraz pirydyny- PhIP) przeprowadzono rozdzielenie chromatograficzne składników mieszaniny tych związków w warunkach elucji wybranych do oznaczania karbolin. Chromatogram HPLC- DAD (długość fali 263nm) zarejestrowany podczas rozdzielenia mieszaniny wzorcowej zawierającej 5 najczęściej oznaczanych w żywności aminoazaarenów [9, 23, 69] przedstawiono na Rycinie 8. Czasy retencji tych związków są różne od czasów 53

retencji karbolin, dlatego ewentualna obecność aminoazaarenów w frakcjach wyizolowanych z żywności nie powinna wpływać na wyniki oznaczeń karbolin. Ponadto aminoazaareny, za wyjątkiem PhIP, nie wykazują fluorescencji, a zatem nie generują sygnałów na chromatogramie uzyskanym przy użyciu detektora FLD. 30 HA5 KRZYWA #15 HA5 krzywa 25ng UV_VIS ma IQ 10,3 MeIQ 12,0 MeIQx 13,5 4,8 DiMeIQx 16,2 PhIP 21,9 263 nm 0 6,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 min Rycina 8. Chromatogram HPLC-DAD mieszaniny wzorcowej aminoazaarenów rozdzielanej w warunkach wybranych dla związków z grupy karbolin. 4.3 Wyniki opracowania metodyki izolowania i oznaczania karbolin w żywności Ze względu na konieczność usunięcia z matrycy potraw mięsnych tłuszczu, białka, barwników i innych substancji mogących zakłócać oznaczanie karbolin, każdą z próbek mięsa i sosu poddano 3-godzinnej hydrolizie alkalicznej. Zgodnie z wynikami badań prowadzonych przez Toribio i współautorów, taki czas hydrolizy pozwala skutecznie oczyścić matrycę próbek żywności wysokobiałkowej z wyżej wymienionych składników [80]. Kolejny etap procedury polegający na ekstrakcji cieczowej hydrolizatu z użyciem Extrelutu i roztworu dichlorometanu z toluenem (5%) umożliwił wyizolowanie z próbek żywności związków organicznych, w tym heterocyklicznych związków azotu. Zaletą ekstrakcji z wykorzystaniem ziemi okrzemkowej jest otrzymanie roztworu nie wykazującego cech emulsji, który następnie mógł zostać bezpośrednio wprowadzony na złoże kolumny SPE-PRS, połączonej w tandem z kolumną z Extrelutem [62]. Podczas tego procesu heterocykliczne aminy aromatyczne wyeluowane z hydrolizatu zostały związane przez grupy propylosulfonowe kolumny SPE-PRS. W wyniku przemywania wysuszonego złoża tej kolumny roztworem kwasu solnego uaktywniony został mechanizm wymiany jonowej, podczas którego grupy aminowe badanych związków były przeprowadzane w formy kationowe. Utworzenie i przemywanie kolejnego układu kolumn SPE: PRS i C-18 alkalicznym roztworem 54

octanu amonu o ph=8 doprowadziło do wyeluowania ze złoża PRS związków o słabszych właściwościach zasadowych [36] i ich zatrzymania na złożu kolumny C-18. Wykonane w dalszej kolejności oznaczenia techniką HPLC-FLD wykazały, że zastosowana procedura ekstrakcji umożliwia wyizolowanie z próbek żywności karbolin i ich rozdzielenie na dwie frakcje: pierwsza wyeluowana z kolumny SPE C-18 zawierała -karboliny (A C, MeA C) i -karboliny (Glu-P-1 i Glu-P-2), natomiast druga - z kolumny SPE PRS zawierała -karboliny (NH i H) i -karboliny (Trp-P-2 i Trp-P-1). Prawdopodobną przyczyną retencji NH, H oraz Trp-P-2 i 1 na złożu kolumny PRS są silniejsze od pozostałych karbolin właściwości zasadowe tych związków (wartości pka zawarto w Tabeli I) [36]. Na Rycinie 9 przedstawiono chromatogramy frakcji karbolin wyizolowanych z próbki mięsa (sznycla) wzbogaconej dodatkiem wzorców. 150 HA ROLADA I SZNYCEL HA Sznycel BEZ 5-8 spik 10 ng Emission mv A A C 27,0 MeA C 30,1 75 Glu- P-2 9,1 Glu-P-1 12,6 16,922 21,825 0 6,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 min 500 300 KARBOL ROL I SZNYC POWTORKI #18 AZA fr Sznycel bez 1-4 spik 10ng Emission mv B NH 16,9 H 18,7 Trp-P-2 21,0 Trp-P-1 23,0 0 6,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 min Rycina 9. Chromatogramy HPLC-FLD frakcji karbolin wyizolowanych z próbki mięsa (sznycla) wzbogaconej dodatkiem wzorców: (A) frakcja wyeluowana z kolumny SPE- C-18; (B) frakcja wyeluowana z kolumny SPE-PRS. Z danych z piśmiennictwa wynika, że stężenia związków z grupy karbolin w żywności są niewielkie, na poziomie kilku lub kilkudziesięciu ng/g [8, 16, 20]. Dlatego też, aby uzyskać koncentrat, w którym stężenia tych związków będą wyższe od ich granic oznaczalności (tabela VII, str. 50), cztery ekstrakty wyizolowane z danej próbki mięsa - zgodnie z procedurą przedstawioną na Rycinie 5 (str. 43) - łączono 55

w jeden, uzykując ekstrakt odpowiadający rozdziałowi 20g badanej próbki. Procedurę tę przeprowadzano trzykrotnie dla każdej próbki żywności, a wyniki uzyskane z co najmniej dwóch analiz przeprowadzonych techniką HPLC-FLD dla każdej wyizolowanej frakcji uśredniono. W obliczeniach stężeń karbolin, w ng/g żywności, uwzględniono odzyski (Tabela VIII, str. 55) oznaczone na podstawie wyników z równocześnie prowadzonych badań próbek wzbogaconych znaną ilością wzorców. Analiza identyfikacyjna związków zawartych w ekstraktach wyizolowanych z próbek żywności polegała na porównaniu czasów retencji wzorców karbolin z wartościami uzyskanymi dla związków zidentyfikowanych w próbkach żywności oraz w odpowiadających im próbkach wzbogaconych wzorcami karbolin, analizowanych w identycznych warunkach. Dodatkowo dla próbek, w których stężenia karbolin przekraczały granice wykrywalności tych związków w układzie HPLC-DAD możliwe było potwierdzenie ich obecności poprzez porównanie widm UV. Na Rycinie 10 przedstawiono przykładowe widma UV zarejestrowane dla wzorców i karbolin zidentyfikowanych w próbkach żywności. 4.4 Wyniki oznaczeń stężeń związków z grupy karbolin w próbkach żywności Stężenia heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin oznaczono techniką HPLC-FLD w potrawach sporządzonych ze schabu w warunkach domowych, w sposób często stosowany w polskich gospodarstwach domowych, zwłaszcza na Górnym Śląsku (sznycle, rolady), jak również w daniach pieczonych w rękawie foliowym. Badaniom poddano próbki mięsa oraz sosów powstałych podczas smażenia sznycli i rolad. Wyniki oznaczeń wraz z odchyleniami standardowymi uzyskanymi dla wszystkich próbek zawarto w zbiorczej Tabeli X (str. 60). Celem wyrażnego zobrazowania różnic pomiędzy tymi wynikami i ich szczegółowej interpretacji, w dalszej części pracy zosały one przedstawiono również w formie wykresów. Stężenia karbolin wynosiły od 0,0 ng/g do 19,1 ng/g w zależności od sposobu obróbki termicznej mięsa i zastosowanego roślinnego dodatku. 56

AαC wzorzec A C w roladzie bez dodatków 60 % at 27.00 min 60 % at 26.94 min 0 0-10 220 300 400 nm nm -10 220 300 400 MeAαC wzorzec 60 % at 30.15 min MeAαC w roladzie bez dodatków- 60 % at 31.00 min 0 0-10 220 300 400 nm -10 220 300 400 nm NH wzorzec 60 % at 16.99 min NH w roladzie bez dodatków- 60 % at 17.10 min 0 0 nm -10 220 300 400 nm -10 220 300 400 57

H wzorzec 60 % at 18.78 min H w roladzie bez dodatków 60 % at 18.88 min 0 0 nm -10 220 300 400 nm -10 220 300 400 Glu-P-1 wzorzec 60 % at 12.52 min Glu-P-1 w roladzie bez dodatków 60 % at 12.58 min 0 0 nm -10 220 300 400 nm -10 220 300 400 Glu-P-2 wzorzec 50 % at 9.25 min Glu-P-2 w roladzie bez dodatków 55 % at 9.20 min 0 220 300 400 nm 0 nm 220 300 400 58

NH wzorzec 60 % at 16.99 min NH w sznyclu z cebulą- 60 % at 17.13 min 0 0-10 220 300 400 nm -10 220 300 400 nm H wzorzec 60 % at 18.78 min H w sznyclu z cebulą 55 % at 18.98 min 0 10-10 220 300 400 nm 0 220 300 400 nm Rycina 10. Widma UV wybranych karbolin po lewej stronie widma odpowiadają wzorcom, po prawej widma zarejestrowane dla próbek żywności. 59

Tabela X. Stężenia [ng/g mięsa] heterocyklicznych amin aromatycznych z grupy karbolin oznaczone w próbkach potraw mięsnych techniką HPLC-FLD (n=6). SD odchylenie standardowe