Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Rolniczego im. Hugona Kołłątaja w Krakowie nr 525 ISSN 1899-3486 rozprawy zeszyt 402 Aleksandra Duda-Chodak Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka Praca wykonana w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie Kraków 2015
Badania zostały sfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji nr DEC-2011/01/B/NZ9/00226. Pracę opiniowali: Prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki (Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu) Dr hab. inż. Agnieszka Filipiak-Florkiewicz (Uniwersytet Rolniczy w Krakowie) Redaktor Naczelny Wydawnictwa Prof. dr hab. inż. Józef Bieniek Redaktor Naukowy Prof. dr hab. Genowefa Bonczar Wydano za zgodą Rektora Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie Copyright Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, Kraków 2015 Projekt okładki: Monika Wojtaszek-Dziadusz Publikacje Wydawnictwa UR w Krakowie można nabyć w siedzibie Wydawnictwa. Prowadzona jest również sprzedaż wysyłkowa (tel.: 12 662 51 60). Księgarnia internetowa: www.wydawnictwo.ur.krakow.pl Wydawnictwo UR w Krakowie 31-425 Kraków, al. 29 Listopada 46 tel.: (12) 662 51 57, 662 51 59 e-mail: wydawnictwo@ur.krakow.pl www.wydawnictwo.ur.krakow.pl Ark. wyd. 14. Ark. druk. 11,75. Nakład 120 egz. Druk i oprawa: DRUKMAR, 32-080 Zabierzów, ul. Rzemieślnicza 10 ISSN 1899-3486
Spis treści Wykaz skrótów stosowanych w pracy List of symbols used in the work... 5 1. Wstęp... 7 2. Przegląd literatury... 11 3. Materiał i metody... 43 3.1. Materiał badawczy... 43 3.2. Przebieg doświadczeń... 46 3.3. Metody analityczne... 50 4. Wyniki i dyskusja... 60 4.1. Potencjał antyoksydacyjny i skład polifenolowy badanych ekstraktów i suplementów... 60 4.2. Potencjał antyoksydacyjny związków polifenolowych najczęściej pobieranych z racjami pokarmowymi... 85 4.3. Wpływ związków polifenolowych na bakterie jelitowe... 95 4.4. Wpływ bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny polifenoli zawartych w diecie... 127 4.5. Zmiany związków polifenolowych pod wpływem bakterii jelitowych... 151 5. Wnioski... 162 6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów... 164 Literatura... 166 Summary... 187
Wykaz skrótów stosowanych w pracy List of symbols used in the work AOX B BAC BEZ BF CAT CC CCH CIT CN D EC EN EUB G GT H HR IM KMP LCB M MIC N potencjał antyoksydacyjny / antioxidant potential ekstrakt z owoców borówki brusznicy / lingonberry fruit extract Bacteroides galacturonicus ekstrakt z owoców czarnego bzu / elderberry fruit extract Bifidobacterium catenulatum (+)-katechina / (+)-catechin ekstrakt z owoców czerwonej cebuli / red onion extract ekstrakt z owoców cytryńca chińskiego / Schisandra fruit extract Citrosept, ekstrakt z pestek i miąższu grejpfruta / grapefruit seed-pulp extract ekstrakt z ziela czosnku niedźwiedziego / bear s garlic extract ekstrakt z owoców derenia jadalnego / cornelian cherry fruit extract Escherichia coli Enterococcus caccae Eubacterium cylindroides ekstrakt z jagód goji / goji berries extract ekstrakt z zielonej herbaty / green tea extract hesperetyna, 3,5,7-trihydroksy-4 -metoksyflawanon / hesperetin, 3,5,7-trihydroxy-4 -methoxyflavanone hesperydyna, hesperetyno-7-o-rutynozyd (glikozyd hesperetyny) / hesperidin, hesperetin-7-o-rutinoside (hesperetin glycoside) mikrobiota jelitowa / intestinal microbiota kemferol / kaempferol Lactobacillus sp. ekstrakt z owoców malin / raspberry fruit extract minimalne stężenie hamujące / minimum inhibitory concentration naringenina, 4,5,7-trihydroksyflawanon / naringenin, 4,5,7-trihydroxyflavanone
6 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... NO sok z noni / noni juice NR naringina, naringenino-7-o-ramnozydoglukozyd (glikozyd naringeniny) / naringin, 7-O-rhamnoglucoside (naringenin glycoside) P ekstrakt z owoców pigwowca japońskiego / Japanese quince fruit extract PF polifenole / polyphenols PHL florydzyna / phloridzin PO ekstrakt z ziela pokrzywy / nettle herb extract Q kwercetyna / quercetin RFT reaktywne formy tlenu / reactive oxygen species RS rezweratrol / resveratrol RUMI Ruminococcus gauvreauii RUT rutyna, kwercetyno-3-o-rutynozyd (glikozyd kwercetyny) / rutin, quercetin-3-o-rutinoside (quercetin glycoside) S ekstrakt z nasion soi / soybean extract SP ekstrakt z preparatu spirulina / spirulina extract Ż ekstrakt z owoców żurawiny / cranberry fruit extract
1. Wstęp Mikrobiota jelitowa (ang. intestinal microbiota, IM) jest wyposażona w bogaty zestaw enzymów odpowiedzialnych za różnorodne przemiany składników pokarmowych, które docierają do jelita. Dzięki temu odgrywa ważną, o ile nie kluczową, rolę w metabolizmie substancji chemicznych dostarczanych z pożywieniem. Skład, jak również proporcje poszczególnych gatunków tworzących IM są bardzo różnorodne. Każdy człowiek ma swój własny, niepowtarzalny profil gatunkowy mikrobioty, który porównuje się nawet do odcisku palca. Z powodu tej ogromnej różnorodności gatunków tworzących IM u poszczególnych osobników profil powstających metabolitów oraz ich końcowy wpływ na organizm są bardzo zmienne w populacji ludzkiej. Część z tych metabolitów może być wykorzystana jako substancje wzrostowe przez komórki nabłonka jelita gospodarza, ale też przez mikroorganizmy obecne w jelicie. Często zdarza się, że jedynie produkt bakteryjnego metabolizmu danego składnika może zostać wchłonięty w jelicie i wpłynąć korzystnie na zdrowie człowieka. Brak odpowiednich gatunków bakterii w mikrobiocie osobnika oznacza, że spożyty związek nie będzie mógł wywrzeć oczekiwanego efektu. Z drugiej strony, zdarza się też, że na skutek metabolizmu bakteryjnego z obojętnego składnika obecnego w żywności powstają pochodne niekorzystnie oddziałujące na zdrowie konsumenta. Wykazano, że etiologia licznych chorób (nieswoiste zapalenia jelit, choroba Crohna, nowotwory jelita, alergie, otyłość) jest ściśle powiązana z IM. Równowaga między układem immunologicznym gospodarza a komensalnymi gatunkami mikrobioty jest niezbędna dla zachowania zdrowia, a jej zaburzenia (dysbioza) powodują rozwój chorób. Wszystkie wymienione kwestie wchodzą w obszar metabolomiki, będącej stosunkowo nową dziedziną nauki. Zgodnie z definicją, metabolomika to systematyczne badanie niepowtarzalnych odcisków palca pozostawianych przez swoiste procesy komórkowe, czyli jest to badanie profilu metabolitów. W ostatnich dekadach ukazało się wiele publikacji na temat korzystnego wpływu przeciwutleniaczy na zdrowie człowieka, jednak dopiero niedawno wykazano, że znaczenie ma nie ilość antyoksydantów w diecie, ale ich biodostępność. Biodostępność polifenoli w formie, w jakiej zwykle występują w diecie, jest raczej mała. Transformacje, które zachodzą w jelicie pod wpływem enzymów bakteryjnych (np. β-glukozydaz, β-glukuronidaz),
8 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... zmieniają zarówno biodostępność, jak i aktywność antyoksydacyjną polifenoli. Z tego też powodu liczne badania z ostatnich lat skupiają się na roli mikrobioty jelitowej w kształtowaniu biodostępności i bioprzyswajalności tych składników diety. Dość powszechnie spotyka się doniesienia wskazujące na hamowanie przez związki polifenolowe i inne przeciwutleniacze wzrostu różnorodnych patogenów, zarówno występujących w przewodzie pokarmowym człowieka, jak i obecnych w żywności. Ten pożądany efekt działania przeciwutleniaczy, a przede wszystkim wykazywany przez nie potencjał antyrodnikowy sprawiły, że znalazły one wielu zwolenników i entuzjastów. Jak wykazały liczne badania, dieta bogata w przeciwutleniacze zmniejsza ryzyko zachorowań na wiele chorób, w tym nowotwory, choroby serca i układu naczyniowego, alergie, choroby neurodegeneracyjne, cukrzycę i wiele innych. Nadmiar wolnych rodników i reaktywnych form tlenu uważany jest także za przyczynę starzenia się organizmu. Stąd dość powszechne i niejako modne stało się promowanie zdrowego stylu życia rozumianego jako suplementowanie diety przeciwutleniaczami. W wielu krajach na rynku dostępne są różnorodne preparaty, a ich producenci prześcigają się w reklamowaniu cudownych efektów, jakie może zapewnić ich spożywanie. Rzeczywiście, w wielu przypadkach wzbogacenie diety składnikami antyoksydacyjnymi pozwala uzupełnić ich niedobór i wspomaga organizm w obronie przed zanieczyszczeniami środowiska i skutkami stresu oksydacyjnego. Z drugiej jednak strony, ze względu na brak jakiejkolwiek kontroli nad sprzedażą tych specyfików istnieje ryzyko ich nadmiernego spożycia lub wystąpienia niebezpiecznych dla zdrowia interakcji, np. z lekami, jakie równocześnie zażywa konsument. Co więcej, standardową procedurą stało się dodawanie do żywności, na różnych etapach jej produkcji, substancji o działaniu antyoksydacyjnym, które mają zapobiec procesom utleniania składników żywności i w ten sposób przedłużyć trwałość produktu. Należy podkreślić, że wykazano także, iż niektóre polifenole lub ich metabolity mogą działać niekorzystnie na organizm ludzki (np. wywierać wpływ mutagenny, genotoksyczny, hamować aktywność topoizomerazy czy syntezę tyroksyny). Oczywiście, jest mało prawdopodobne, aby dawki przeciwutleniaczy przyjmowanych ze zbilansowaną dietą mogły negatywnie wpływać na zdrowie, jednakże dostępne bez recepty suplementy diety zawierają te związki w stężeniach nawet 20-krotnie wyższych od występujących w typowej diecie wegetariańskiej. Jak dotąd nie ma naukowo potwierdzonych danych na temat efektów długotrwałego spożywania zwiększonej ilości polifenoli. Jest to istotna kwestia, gdyż stosowanie suplementów bogatych w mieszaniny ziołowe i polifenole, które są zalecane w dawkach wyrażanych raczej w gramach niż miligramach, może powodować ekspozycję na potencjalnie toksyczne stężenia tych składników. Nie było także badań wyjaśniających, jak składniki przeciwutleniające obecne w diecie czy tych suplementach wpływają na skład jakościowy i ilościowy prawidłowej mikrobioty jelitowej. Biorąc pod uwagę niedostatek wiedzy z zakresu wspomnianych zagadnień, w prezentowanej pracy skoncentrowano się na ocenie wpływu bioaktywnych składników
1. Wstęp 9 żywności o charakterze przeciwutleniaczy na wybrane gatunki bakterii będące przedstawicielami ludzkiej mikrobioty jelitowej. Do badań wybrano rośliny, których właściwości prozdrowotne, lecznicze czy wspomagające są powszechnie uznane, a także te, które jako źródło naturalnych antyoksydantów są dodawane do żywności w celu jej utrwalenia. Ponadto analizowano czyste związki polifenolowe, które są najczęściej spożywane wraz z typową dietą, a mogą się także znaleźć w suplementach diety i preparatach farmaceutycznych. Ostatni etap pracy obejmował ocenę wpływu bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających, w tym także składników występujących w badanych surowcach roślinnych i suplementach. Cel pracy Głównym celem pracy było poznanie interakcji między przeciwutleniającymi składnikami roślin i suplementów diety a bakteriami będącymi przedstawicielami mikrobioty jelita ludzkiego. Oprócz celu głównego sformułowano trzy cele szczegółowe: 1) ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego wybranych surowców roślinnych i suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka, 2) określenie wpływu związków polifenolowych zawartych w ekstraktach z surowców roślinnych i suplementów diety, a także czystych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej, 3) zbadanie wpływu poszczególnych gatunków bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających występujących w badanych surowcach. Hipotezy badawcze Dostępna literatura przedmiotu wskazuje, że polifenole wywierają hamujący wpływ na różne mikroorganizmy, w tym patogenne gatunki bakterii jelitowych. Z drugiej strony, stosowanie surowców roślinnych bogatych w te składniki do leczenia rozmaitych schorzeń oraz wspomagania funkcjonowania organizmu ludzkiego ma wielowiekowe tradycje, co może przemawiać za ich neutralnością wobec komensalnych gatunków mikrobioty. Opierając się na tych danych, sformułowano dwie hipotezy badawcze: 1) naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych i suplementach diety nie wywierają hamującego wpływu na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej,
10 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... 2) gatunki bakterii stanowiących fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwiększają na skutek swojego metabolizmu potencjał antyoksydacyjny składników polifenolowych obecnych w surowcach roślinnych i suplementach diety. Formułując hipotezy, przyjęto założenie wyjściowe, że badane surowce roślinne oraz suplementy diety zawierają składniki przeciwutleniające, w tym polifenole, w znaczących stężeniach. Aby zweryfikować to założenie oraz poszczególne hipotezy, na pierwszym etapie badań określono wyjściowy potencjał antyoksydacyjny oraz skład polifenolowy surowców roślinnych i komercyjnie dostępnych suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka. Jako źródło polifenoli i przeciwutleniaczy wybrano surowce o znanych właściwościach prozdrowotnych i/lub długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej różnych krajów: świeże owoce maliny, czarnego bzu, żurawiny, borówki brusznicy, pigwowca japońskiego i derenia, suszone owoce goji i cytryńca chińskiego, czerwoną cebulę, czosnek niedźwiedzi, pokrzywę, spirulinę, zieloną herbatę i nasiona soi, a także suplementy diety Citrosept (ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta) i sok z noni. Wszystkie wymienione surowce i suplementy zawierają antyoksydanty, w tym różne polifenole, i są wykorzystywane (często równocześnie) do leczenia rozmaitych schorzeń jako preparaty dostępne bez recepty, a zatem poza wszelką kontrolą. Ponieważ ich dawkowanie, sposób przyrządzania i stosowania zależą od leczonego schorzenia oraz od tradycji w danym regionie świata, postanowiono w celu ujednolicenia i uproszczenia porównań uzyskanych wyników przygotować z wszystkich surowców jednakowe ekstrakty etanolowe (nie dotyczyło to gotowych suplementów, tj. soku z noni i Citroseptu). W doświadczeniach zostały także zastosowane, w postaci czystych związków, najczęściej spożywane z dietą polifenole: (+)-katechina, kwercetyna, rutyna, naringenina, naringina, hesperydyna, hesperetyna, kemferol i florydzyna, będące przedstawicielami różnych klas flawonoidów, oraz rezweratrol reprezentant stilbenów. Drugi etap prac miał na celu określenie wpływu badanych surowców oraz poszczególnych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej. Ponieważ najważniejsze i najliczniej reprezentowane w jelicie ludzkim rodzaje bakterii to Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus i Bacteroides, gatunki wybrane do doświadczeń należały przede wszystkim do tych rodzajów i zgodnie z informacją od dostawcy wszystkie zostały wyizolowane z jelita ludzkiego. W przypadku wykazania działania hamującego rozwój bakterii wyznaczano wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla danego składnika. Ostatni etap prac dotyczył oceny wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe. W tym celu określono potencjał antyoksydacyjny wybranych polifenoli i/lub ekstraktów oraz produktów, które z nich powstały na skutek metabolizmu bakteryjnego. Zbadano także zmiany stężeń wybranych związków polifenolowych pod wpływem ekspozycji na poszczególne gatunki bakterii.
2. Przegląd literatury Reaktywne formy tlenu, wolne rodniki i stres oksydacyjny Tlen to jeden z najbardziej na Ziemi rozpowszechnionych pierwiastków, bez którego większość organizmów naszej planety nie mogłaby istnieć. Jest on stosunkowo mało reaktywny w stanie podstawowym, czyli trypletowym ( 3 O 2 ) [Tarko i in. 2007], ale może też występować w innych formach. Na skutek dostarczenia energii do 3 O 2 powstaje tlen w stanie singletowym ( 1 O 2 ), o znacznie wyższej reaktywności, z łatwością reagujący z innymi, rozpowszechnionymi w przyrodzie pierwiastkami w stanie singletowym. Alotropową odmianą tlenu i naturalnym składnikiem atmosfery jest ozon (O 3 ). Powstaje w stratosferze, na wysokości około 30 km, jako wynik działania promieni ultrafioletowych na tlen w stanie trypletowym. Jest bardziej reaktywny niż 3 O 2, a w wyniku różnych reakcji tworzy wysoce reaktywne ozonki i nadtlenki oraz rodniki OH i HO 2. W komórkach organizmów tlenowych procesy oddychania, czyli utleniania substancji odżywczych przy udziale tlenu z jego jednoczesną redukcją do wody, są podstawowymi przemianami gwarantującymi pozyskanie energii niezbędnej do funkcjonowania organizmu. Całkowita redukcja cząsteczki tlenu oznacza przyłączenie do niej czterech elektronów i czterech protonów, w wyniku czego powstają dwie cząsteczki wody. Cząsteczka tlenu, ze względu na rozkład elektronów na swych orbitalach, nie zawsze jednak ulega pełnej redukcji. Podczas niepełnej redukcji tlenu cząsteczkowego zostają uwolnione reaktywne formy tlenu (RFT), z których większość jest wolnymi rodnikami. Wolny rodnik to zdolna do samodzielnego istnienia cząsteczka zawierająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów na orbitalu walencyjnym. Rodniki przeważnie są obojętne elektrycznie i bardzo reaktywne, dzięki czemu szybko wchodzą w reakcje z innymi cząsteczkami, dążąc do sparowania elektronów poprzez ich przyłączenie lub oddanie [Beckman i Ames 1998]. W wyniku niepełnej redukcji tlenu (ryc. 1) w komórce (przede wszystkim w mitochondriach) powstają wysoce reaktywne pochodne: anionorodnik ponadtlenkowy O 2 (ang. superoxide radical anion), nadtlenek wodoru H 2 O 2 (ang. hydrogen peroxide), rodnik wodoronadtlenkowy HO 2 (ang. hydroperoxyl radical) oraz rodnik hydroksylowy OH (ang. hydroxyl radical) [Tarko i in. 2007, Burton i Jauniaux 2011].
12 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... Ryc. 1. Powstawanie wolnych rodników i reaktywnych form tlenu w trakcie kolejnych etapów redukcji tlenu [Tarko i in. 2007] Fig. 1. Generation of free radicals and reactive oxygen metabolites during successive stages of oxygen reduction [Tarko et al. 2007] Powstające w komórce wolne rodniki lub RFT dążą do sparowania elektronów. Jeśli w pobliżu tworzących się rodników znajdują się inne rodniki, to będą one ze sobą reagowały. Zwykle jednak stężenie wolnych rodników w komórce jest bardzo niskie, stąd rodniki reagują z sąsiadującymi cząsteczkami biologicznymi, czyli aminokwasami, białkami, lipidami. O ile anionorodnik ponadtlenkowy jest zbyt słabym utleniaczem, by zainicjować reakcję peroksydacji lipidów, o tyle powstający z niego rodnik wodoronadtlenkowy czyni to bez trudu. Nierodnikowa forma tlenu, jaką jest H 2 O 2, charakteryzuje się mniejszą reaktywnością niż inne RFT, jednak ma duże znaczenie biologiczne. Po pierwsze, łatwo przenika przez błony lipidowe, co powoduje, że reaktywne formy tlenu rozprzestrzeniają się po komórce i organizmie. Po drugie, w obecności metali przejściowych (Fe i Cu) ulega w reakcji Fentona rozkładowi do rodnika hydroksylowego ( OH) z jednoczesnym utlenieniem jonów żelaza lub miedzi. Rodnik hydroksylowy, o niezwykle krótkim czasie połowicznego rozkładu (10 9 s), reaguje z większością struktur komórkowych, jakie występują w jego otoczeniu [Sies 1993], inicjuje łańcuchowe reakcje rodnikowe z lipidami i białkami, a także reaguje z kwasami nukleinowymi, co często prowadzi do groźnych mutacji. Oprócz reakcji Fentona, rodnik hydroksylowy może też powstawać w wyniku reakcji Habera-Weissa, w której jednym z substratów również jest nadtlenek wodoru. Do reaktywnych form tlenu należą też pochodne azotu, takie jak tlenek azotu (NO ) wytwarzany z L-argininy przez kilka izoform syntazy tlenku azotu (NOS) oraz jego pochodne [Burton i Jauniaux 2011]. Tlenek azotu jest znakomitym przykładem rodnika, który pełni wiele ważnych funkcji fizjologicznych u ssaków, m.in. odgrywa rolę neuromodulatora i neurotransmitera w układzie nerwowym, reguluje ciśnienie tętnicze i hamuje agregację płytek krwi [Wolin 2009, Kvietys i Granger 2012]. Ze względu na niewielkie rozmiary cząsteczki i lipofilowość, tlenek azotu łatwo przenika przez błony biologiczne, bez pośrednictwa układów transportujących. W niskim stężeniu NO powoduje zazwyczaj przerwanie wolnorodnikowej reakcji łańcuchowej wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, natomiast w wyższym
2. Przegląd literatury 13 stężeniu przyczynia się do tworzenia rodników nadtlenkowych i alkoksylowych. W reakcji NO z anionorodnikiem ponadtlenkowym z kolei powstaje nadtlenoazotan(iii) (nadtlenoazotyn), który charakteryzuje się silnymi właściwościami utleniającymi, może reagować z grupami tiolowymi białek i nienasyconymi resztami kwasów tłuszczowych, a w reakcji z anionem HCO 3 tworzyć rodnik wodorowęglanowy (HCO 3 ) [Wolin 2009]. Protonowanie nadtlenoazotynu prowadzi zazwyczaj do powstania kwasu nadtlenoazotowego(iii) (nadtlenoazotawego), który z kolei ulega rozkładowi do dwóch rodników zdolnych do dalszych reakcji [Guzik i in. 2003]. Do nierodnikowych związków o silnych właściwościach utleniających należą także chlorany(i), bromiany(i), podtiocyjaniany (OSCN ) i podjodany (IO ) [Tarko i in. 2007]. Należy podkreślić, że wolne rodniki i reaktywne formy tlenu są niezmiernie istotne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Przede wszystkim pełnią rolę przekaźników sygnału [Bartz i Piantadosi 2010, Finkel 2011, Poljsak i in. 2013], a zatem regulują procesy metaboliczne [Dröge 2002] i odpowiadają za niektóre procesy fizjologiczne, jak prawidłowe krążenie krwi [Wolin 2009], za odpowiedź immunologiczną i stan zapalny [Guzik i in. 2003], starzenie się organizmu czy apoptozę [Beckman i Ames 1998, Tchirkov i Lansdorp 2003]. Z wymienionych względów dla każdego układu (komórki czy całego organizmu) ważne jest wytworzenie stanu równowagi między procesami, w wyniku których są generowane RFT, a mechanizmami antyoksydacyjnymi, tak aby działanie tych aktywnych cząstek ograniczało się do funkcji fizjologicznych i nie było destrukcyjne. Stan naruszenia tej subtelnej równowagi na korzyść RFT nazywa się stresem oksydacyjnym i może być wywołany zarówno przez osłabienie mechanizmów antyoksydacyjnych, jak i przez nadmierną produkcję i/lub wydłużoną ekspozycję na RFT [Burton i Jauniaux 2011, Poljsak i in. 2013]. Z chwilą gdy ilość reaktywnych form tlenu w komórce (tkance, narządzie lub organizmie) staje się zbyt duża, zaczyna się uwidaczniać ich wysoka reaktywność i destrukcyjny wpływ na inne cząsteczki. Najlepiej poznane są reakcje peroksydacji lipidów [Niki i in. 2005], zarówno obecnych w błonach komórkowych, jak i zawartych w kompleksach lipoprotein we krwi. Wolnorodnikowa łańcuchowa reakcja utleniania lipidów tworzących szkielet dwuwarstwy lipidowej prowadzi do upośledzenia funkcji błon, zwiększenia ich przepuszczalności, zahamowania aktywności enzymów błonowych (co jest szczególnie istotne w przypadku błon mitochondriów) oraz rozprzężenia fosforylacji oksydacyjnej. W skrajnych przypadkach może nastąpić utrata integralności błony cytoplazmatycznej i błon wewnątrzkomórkowych, liza organelli i komórek oraz wyciek ich zawartości [Poljsak i in. 2013]. Wpływ RFT na lipoproteiny o małej gęstości (LDL) powoduje z kolei modyfikacje apolipoproteiny B (części białkowej), które sprzyjają agregacji lipoprotein i mogą prowadzić do rozwoju miażdżycy [Levitan i in. 2010]. Zmiany powstające pod wpływem RFT w cząsteczkach białek mogą zachodzić zarówno w szkielecie węglowym, jak i w bocznych łańcuchach aminokwasowych [Davies 1987, Davies i Delsignore 1987, Davies i in. 1987a i b, Burton i Jauniaux
14 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... 2011]. Niektóre z tych zmian są odwracalne, inne trwale zmieniają konformację cząsteczek, powodując utratę właściwości białek (np. enzymów) i zwiększając ich podatność na rozpad proteolityczny [Grune i in. 1997], co w efekcie prowadzi do zaburzenia metabolizmu komórki [Burton i Jauniaux 2011]. Destrukcyjnemu wpływowi RFT ulegają także cząsteczki cukrów. Wolne rodniki i RFT uczestniczą w patogenezie m.in. reumatoidalnego zapalenia stawów, gdyż inicjują i przyspieszają reakcję depolimeryzacji kwasu hialuronowego w stawach [McNeil i in. 1985]. Nadmierna ekspozycja na RFT prowadzi do uszkodzeń struktury kwasów nukleinowych, co sprzyja sieciowaniu i pękaniu nici oraz powstawaniu mutacji [Olinski i in. 2002]. Nagromadzenie się takich zmian, przy zaburzeniach mechanizmów naprawczych, skutkuje rozwojem nowotworu. Powstające pod wpływem H 2 O 2 produkty, takie jak np. 8-hydroksyguanina, są uważane za biomarkery oksydacyjnego uszkodzenia DNA i odgrywają znaczącą rolę w procesach skracania telomerów, nowotworzenia i starzenia się komórek [Campisi i in. 2001, Olinski i in. 2002, Tchirkov i Lansdorp 2003, Liou i Storz 2010, Ríos-Arrabal i in. 2013]. Generalnie przyjmuje się, że wolne rodniki i RFT w stężeniach fizjologicznych są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu [Dröge 2002, Bartz i Piantadosi 2010, Burton i Jauniaux 2011, Finkel 2011], jednakże ich nadmiar, wynikający albo ze zbyt dużej produkcji RFT, albo z niedostatku mechanizmów obronnych i antyoksydantów, prowadzi do powstania w komórce lub organizmie stresu oksydacyjnego. Szerokie badania nad wolnymi rodnikami i reaktywnymi formami tlenu dostarczyły wyników, na podstawie których od dawna uważa się stres oksydacyjny za przyczynę lub mechanizm pośredniczący w rozwoju licznych chorób i schorzeń. Wśród najważniejszych należy wymienić miażdżycę, cukrzycę, reumatoidalne zapalenie stawów, choroby Alzheimera i Parkinsona, astmę, malarię, chorobę niedokrwienną serca, zawał, chorobę popromienną, kataraktę, jaskrę, nowotwory, choroby autoimmunologiczne, porfirię, stwardnienie zanikowe boczne, zapalenie jelita grubego i chorobę Crohna, odrzucanie przeszczepu, zespoły przyspieszonego starzenia się i inne choroby cywilizacyjne [Kloner i in. 1989, Beckman i Ames 1998, Xu i Touyz 2006, Maiese i in. 2007, Niki 2011, Grahame i Schlesinger 2012, Jeong i in. 2012, Leuner i in. 2012, Percário i in. 2012, Webster 2012, Alzoghaibi 2013, Ríos-Arrabal i in. 2013, Yan i in. 2013, Miller i in. 2014, Muchová i in. 2014]. Co ciekawe, niebezpieczna może być również nadmierna ekspresja enzymów antyoksydacyjnych. Niektórzy badacze uważają nawet, że w organizmie osoby popełniającej błędy dietetyczne i/lub nadużywającej suplementów zawierających związki przeciwutleniające może zaistnieć stres antyoksydacyjny [Poljsak i in. 2013]. W takim przypadku zaburzeniu ulegają mechanizmy i procesy komórkowe będące pod kontrolą lub zależne od RFT (np. ochrona przed patogenami). Ponadto wiele przeciwutleniaczy w dużych dawkach działa prooksydacyjnie [Cao i in. 1997, Galati i in. 2002]. Jednym z przykładów zaburzonej równowagi antyoksydacyjnej jest zespół
2. Przegląd literatury 15 Downa, związany z trisomią chromosomu 21, który zawiera m.in. gen kodujący dysmutazę ponadtlenkową zależną od miedzi i cynku. U chorych z zespołem Downa następuje 50-procentowy wzrost aktywności tego enzymu, ale bez jednoczesnego wsparcia ze strony katalazy enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru (geny kodujące katalazę znajdują się na innym chromosomie). Nadtlenek wodoru w dużym stężeniu powoduje uszkodzenia nerwowo-mięśniowe, wzmaga peroksydację lipidów w osoczu i mózgu oraz wywołuje objawy typowe dla zespołów przyspieszonego starzenia się organizmu [Lee i in. 2001]. Systemy obronne organizmu przed stresem oksydacyjnym przeciwutleniacze Pierwszą linią obrony jest prewencja, czyli zapobieganie powstawaniu wolnych rodników, polegające na hamowaniu reakcji, w których te cząsteczki są generowane [Sies 1993]. Ponieważ część reakcji syntezy wolnych rodników jest katalizowana przez jony metali przejściowych, skutecznym sposobem prewencji jest wiązanie tych metali przez specjalne białka lub związki o zdolności chelatowania, np. polifenole [Duda-Chodak 2007]. Różne organizmy mają własne systemy ochrony przed wytworzeniem nadmiernej ilości RFT; są to przede wszystkim enzymy antyoksydacyjne, ale także niektóre cząsteczki wytwarzane w organizmie [Harris 1992]. Do najważniejszych enzymów antyoksydacyjnych należy dysmutaza ponadtlenkowa (oksydoreduktaza ponadtlenek: ponadtlenek, EC 1.15.1.1, ang. superoxide dismutase (SOD)), która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru. SOD ściśle współpracuje z kolejnym enzymem katalazą (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.6), który przyspiesza reakcję dysmutacji wytworzonego H 2 O 2, zanim ten przekształci się w bardziej reaktywne formy rodnikowe [Duda-Chodak 2007]. Nadtlenek wodoru stanowi substrat również dla peroksydaz grupy enzymów, które redukują go do wody, utleniając przy okazji różne związki. Wiadomo, że peroksydazy powszechnie występują u roślin, a w przypadku zwierząt najlepiej poznano peroksydazę glutationową (GPx, oksydoreduktaza glutation: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.9). Jest to enzym selenozależny, który przy udziale glutationu (GSH) usuwa nadtlenek wodoru, zaś sam GSH ulega utlenieniu do dwusiarczku glutationu (GSSG). Peroksydaza glutationu we współpracy z fosfolipazą A 2 bierze także udział w unieszkodliwianiu nadtlenków kwasów tłuszczowych, hamując peroksydację lipidów, m.in. w wątrobie. Pośrednio, antyoksydacyjne funkcje enzymów obejmują także redukcję GSSG do glutationu przez reduktazę GSSG oraz transport i eliminację związków reaktywnych (w czym uczestniczą S-transferazy glutationu i system transportu S-koniugatów glutationu). Jest to o tyle ważny mechanizm, że utleniona forma glutationu (GSSG) może tworzyć mieszane dwusiarczki z grupami tiolowymi w białkach lub utleniać te grupy, co prowadzi do powstawania mostków dwusiarczkowych i unieczynniania białek.
16 Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety... Mechanizmy endogenne nie zawsze wystarczają. W takiej sytuacji do organizmu muszą być dostarczone substancje egzogenne, których głównym zadaniem jest przechwycenie i/lub ustabilizowanie aktywnej cząsteczki, zanim ta dokona zniszczeń (przeciwutleniacze interwencyjne). Ten proces dezaktywacji polega na oddaniu atomu wodoru lub przyjęciu elektronu przez przeciwutleniacz. Do antyutleniaczy interwencyjnych zalicza się m.in. witaminę C, tokoferole, karotenoidy, hemoproteiny, polifenole i metaloporfiryny [Duda-Chodak 2007]. Ponieważ w komórce występują dwie fazy: hydrofilowa (cytoplazma i wnętrze organelli) oraz hydrofobowa (dwuwarstwa lipidowa błon komórkowych), antyoksydanty powinny być przystosowane do pełnienia funkcji w obu środowiskach. Bardzo liczną grupę przeciwutleniaczy tworzą związki polifenolowe, które poprzez grupy funkcyjne mogą tworzyć kompleksy z jonami metali, głównie żelaza i miedzi [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004, Galleano i in. 2010], hamując w ten sposób ich zdolność do katalizowania reakcji Fentona i zapobiegając powstawaniu wolnych rodników. Polifenole działają też na dalszych stadiach ochrony, jako przeciwutleniacze interwencyjne. Zmiatając wolne rodniki (O 2 i OH), hamują na etapie inicjacji peroksydację lipidów [Galleano i in. 2010]. Mogą też kończyć łańcuchową reakcję rodnikową, oddając atom wodoru rodnikowi peroksylowemu z wytworzeniem rodnika flawonoidowego. Ze względu na strukturę podstawowego szkieletu węglowego polifenoli wyróżnia się kwasy fenolowe, flawonoidy, lignany i stilbeny. Do kwasów fenolowych należą hydroksylowe pochodne kwasu benzoesowego i kwasu cynamonowego, przy czym te drugie są silniejszymi antyoksydantami. O ile pochodne tych kwasów z jedną grupą OH nie są przeciwutleniaczami, o tyle pochodne dihydroksylowe wykazują właściwości przeciwutleniające zależne od pozycji grup OH w pierścieniu, np. kwas rezorcynowy (3,5-dihydroksybensoesowy) ma dwukrotnie większe zdolności przeciwutleniające niż pochodne 2,3- i 3,4- [Rice-Evans i in. 1996]. Im większa jest liczba grup hydroksylowych, tym wyższy potencjał antyoksydacyjny. Kwas galusowy, który ma aż trzy grupy OH (w pozycji 3, 4 i 5), jest bardzo wydajnym przeciwutleniaczem. Szczególnie bogate źródło kwasu galusowego stanowi herbata, która zawiera dużą ilość hydrolizujących tanin. Do najważniejszych polifenoli w tej grupie można zaliczyć kwasy kawowy, p-kumarowy, ferulowy i synapinowy oraz ich pochodne estrowe lub glikozydowe, np. kwas chlorogenowy. Obszerną klasą polifenoli są flawonoidy, zawierające w swej cząsteczce układ difenylopropanowy, złożony z dwóch pierścieni benzenowych połączonych łańcuchem trójwęglowym lub pierścieniem heterocyklicznym (ryc. 2). W obrębie tej grupy wyróżniono kilka podklas: flawony, flawonole, flawanony, flawany, antocyjany, izoflawony i chalkony (jako formę pośrednią), różniących się budową oraz wynikającą z niej aktywnością antyoksydacyjną [Robards i in. 1999]. Wzory najważniejszych przedstawicieli poszczególnych podklas flawonoidów oraz najobfitsze ich źródła zostały przedstawione w tabeli 1.