Bioszkła do wypełniania ubytków kostnych

Bioszkła do wypełniania ubytków kostnych mgr inż. Lidia Ciołek Instytut Ceramiki i Materiałów Budowlanych Zakład Bioceramiki Projekt współfinansowany z Europejskiego Funduszu Społecznego i Budżetu Państwa

1. Stan szklisty 2. Aktywność biologiczna szkieł 3. Badania biologiczne in vitro cytotoksyczność, aktywność przeciwbakteryjna

Stan szklisty jest podstawową formą stanu bezpostaciowego. Substancja znajdująca się w stanie szklistym jest to ciało stałe, jednorodne, kruche, w mniejszym lub większym stopniu mające przełom muszlowy. Substancje szkliste są układami metastabilnymi. Zapas energii wewnętrznej substancji szklistej jest większy od zapasu energii wewnętrznej odpowiedniej substancji krystalicznej. Zatem w sprzyjających warunkach temperaturowych substancje szkliste wykazują tendencję do krystalizacji.

Substancje w stanie szklistym charakteryzują się kilkoma wspólnymi cechami: - są izotropowe, tj. ich właściwości są jednakowe we wszystkich kierunkach - przy ogrzewaniu nie topią się jak kryształy, lecz stopniowo miękną (zmieniają swoje właściwości w sposób ciągły) - topią się i krzepną w sposób odwracalny

Na krzywej studzenia lub ogrzewania występuje charakterystyczny punkt, w którym następuje jedynie zmiana nachylenia krzywej zależności np. objętości od temperatury gdy lepkość przekroczy 10 13 dpas. Jest to punkt transformacji Tg (witryfikacji). Rys. 1: Zależność między szkłem, cieczą i ciałem krystalicznym

Rys. 2: Budowa sieci w układzie dwuwymiarowym a) regularny układ geometryczny więźby [SiO 4 ] 4- w krystobalicie b) nieregularny układ geometryczny więźby [SiO 4 ] 4- [SiO w szkle kwarcowym 4 ]4- c) schemat struktury szkła z układu Na 2 O-SiO 2

Pierwsze bioaktywne szkło należące do układu Na 2 O-CaO-SiO 2 -P 2 O 5 opracował w 1969 roku prof. Larry Hench. W 1985 roku nastąpiło pierwsze użycie kliniczne szkła bioaktywnego Bioglass o symbolu 45S5. Tabela 1: Przykładowe składy chemiczne bioszkieł dla medycyny Nazwa bioszkła Skład chemiczny, %wag. Na 2 O K 2 O MgO CaO Al 2 O 3 SiO 2 P 2 O 5 CaF 2 Bioglass 24,5 - - 24,5-45,0 6,0 - Ceravital 5-10 0,5-3,0 2,5-5,0 30-35 - 40-50 10-50 - Cerabone - - 4,6 44,7-34,0 16,2 0,5 Bioverit 3-8 - 2-21 10-34 8-15 19-54 2-10 3-23

Przykładowe zastosowania szkieł w medycynie - do wypełniania ubytków kostnych np. BIOGLASS, BIOGRAN, PERIOGLAS, - w chirurgii kostnej (np. szkło-ceramika BIOVERIT ), - w radioterapii (np. szkła z układu Y 2 O 3 - Al 2 O 3 -SiO 2 ), - do cementów ortopedycznych (np. szkła z układu CaO-SiO 2 -P 2 O 5 -CaF 2 ).

Otrzymywanie szkieł bioaktywnych 1. Metodą klasyczną na drodze procesów ogniowych przez stopienie odpowiednich surowców chemicznych i mineralnych 2. Metodą zol-żel (hydroliza alkoholanów i/lub estrów, a następnie polikondensacja) 25 o C 25 o C do 500 o C 600-800 o C Roztwór Zol Żel Tlenkowy materiał zagęszczone szkło amorficzny, porowaty

Zalety metody zol-żel: pozwala uzyskiwać szkła w formie monolitów, proszków lub włókien w temperaturach znacznie niższych niż w przypadku tradycyjnej metody topienia, szkła otrzymane w procesie zol-żel charakteryzuje wysoka czystość chemiczna, w związku z tym, że proces ten bazuje na mieszaninach cieczy np. Si(OC 2 H 5 ) 4 tetraetoksysilan, homogenizacja możliwa jest na skalę molekularną, specyficzna budowa szkieł wytworzonych metodą zol-żel powoduje ich wysoką aktywność chemiczną i biologiczną.

Bioaktywność Zdolność do modyfikacji powierzchni, polegająca na tworzeniu się warstwy aktywnego biologicznie hydroksyapatytu węglanowego, stanowiącego naturalne połączenie biomateriału z żywą tkanką kostną. Szkła bioaktywne Głównie krzemianowo-fosforanowe, ich składniki uczestniczą w procesach metabolicznych organizmów żywych i wiążą się trwale z tkankami. Wiązanie to odbywa się poprzez wytworzenie na powierzchni szkła warstwy hydroksyapatytu węglanowego czyli mineralnego składnika kości.

Zdolność wiązania z żywą tkanką kostną jest oceniana in vitro poprzez śledzenie zmian na powierzchni materiału pod wpływem roztworu symulującego osocze, np. SBF. Tabela 2: Skład chemiczny roztworu SBF Rodzaj i stężenie jonów (mm/dm 3 ) Na + K + Mg 2+ Ca 2+ Cl - HCO 3 - HPO 4 2- SO 4 2- SBF 142,0 5,0 1,5 2,5 148,8 4,2 1,0 0,5 osocze krwi 142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 27,0 1,0 0,5 Pod wpływem SBF następuje stopniowa destrukcja struktury szkła. Jony z SBF ulegają wymianie z jonami Ca 2+ i Na + ze szkła. Następuje depolimeryzacja więźby szkła. Składniki szkła są wymywane w formie jonów, a krzemionka przechodzi w formę łatwo rozpuszczalnego kwasu ortokrzemowego H 4 SiO 4.

Na granicy szkła i płynu fizjologicznego następuje hydroliza H 4 SiO 4 i wytrącanie się uwodnionych krzemianów wapniowych w układzie: CaO-SiO 2 -H 2 O lub Na 2 O-CaO-SiO 2 -H 2 O Te uwodnione krzemiany formują żelową warstwę na powierzchni rozpuszczanego materiału, a na niej krystalizuje warstwa hydroksyapatytu. Grupy silanowe Si-OH sprzyjają tworzeniu się HA.

Rys. 3: Połączenie szkło-kość: G-szkło L.Hencha 87-6; Si-warstwa H 4 SiO 4 ; C-P-warstwa wzbogacona w Ca i P; B-kość

Rys. 4: Analiza połączenia szkła Bioglass z kością

Prawidłowo dobrany skład chemiczny zapewnia wiązanie po 30 dniach od implantacji (obszar A). Źle dobrany skład chemiczny może spowodować brak wiązania wywołany: zbyt małą reaktywnością (obszar B), zbyt dużą reaktywnością (obszar C) lub bioszkło w ogóle się nie tworzy (obszar D) Rys.5: Układ Na 2 O-SiO 2 -CaO z zaznaczonymi obszarami odpowiadającymi różnej aktywności w organizmie

Bioszkła z układu CaO-SiO 2 -P 2 O 5 opracowane w Zakładzie Bioceramiki P-3 P-4 Rys. 6: Bioszkła P - 3 i P 4 w formie żelu, po suszeniu przez 48h w 60 o C

Rys. 7: Obraz SEM bioszkła P-3 przed zanurzeniem w roztworze SBF Rys. 8: Obraz SEM bioszkła P-3 po 7 dniach inkubacji w SBF

Rys. 9: Obraz SEM bioszkła P-4 przed zanurzeniem w roztworze SBF Rys. 10: Obraz SEM bioszkła P-4 po 7 dniach inkubacji w SBF

Badanie cytotoksyczności bioszkieł Z-8 i B-I w testach in vitro Z-8 i B-I to bioszkła dotowane srebrem opracowane w Zakładzie Bioceramiki w układzie SiO 2 - Al 2 O 3 -CaO-P 2 O 5 Tabela 3: Zawartość Ag 2 O w badanych bioszkłach Symbol bioszkła Zawartość Ag 2 O, %wag. Z-8 3,5 B-1 1,0 Badania wykonano w Zakładzie Immunologii Chorób Zakaźnych Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Badanie przeprowadzono np. wg testu zawartego w normie PN-EN ISO 10993-5 Biologiczna ocena wyrobów medycznych. Część 5: Badania cytotoksyczności: metody in vitro. Test wykonanywany jest metodą bezpośredniego kontaktu z jednowarstwową hodowlą komórek linii L929 (linia komórek fibroblastopodobnych otrzymanych z podskórnej tkanki tłuszczowej myszy C3H).

Kontrola L929 Z-8 B-I Rys. 11: Obrazy hodowli komórek L929 w kontakcie z badanymi bioszkłami w koncentracji proszku 0,5mg/ml Obrazy mikroskopowe hodowli w kontakcie z badanymi bioszkłami Z-8 i B-I wskazują na brak działania cytotoksycznego. Komórki są rozpłaszczone, co świadczy o korzystnym oddziaływaniu badanych materiałów.

Ocena aktywności przeciwbakteryjnej Z-8 i B-I Badania wykonano w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, metodą rozcieńczeń wykorzystując prehodowle testowych szczepów bakteryjnych. Szczepy P.aeruginosa, E.coli, S.aureus i B.subtilis inkubowano w bulionie odżywczym w temperaturze 37 o C, natomiast szczep C.albicans hodowano w bulionie Sabouraud, w temperaturze (28 ± 1) o C. Do studzienek na 24-dołkowej płytce wprowadzono po 1 ml odpowiednich roztworów badanych biomateriałów w bulionie i wysterylizowano promieniowaniem UV, następnie dodawano po 100μl hodowli bakteryjnej. Roztwory inkubowano 24 godziny, a po tym czasie hodowle rozcieńczano NaCl i po 100 μl wysiewano na płytki z odżywczym agarem lub stałym podłożem Sabouraud. Płytki ze szczepami bakteryjnymi inkubowano w temperaturze (37 ± 1) o C, natomiast ze szczepami drożdżaków C. albicans w temperaturze (28 ± 1) o C. Kontrolę stanowiła próbka bez badanego materiału oznaczona jako stężenie 0 mg/ml.

Log liczby żywych bakterii/ ml 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Kontrola Z-8 B-I B.subtilis C.albicans E.coli St.aureus P.aeruginosa C.albicans B.subtilis P.aeruginosa St.aureus E.coli Rys. 12: Bakteriobójczość bioszkieł Z-8 i B-I przy stężeniu 80mg/ml po 30h inkubacji

Wnioski 1. Otrzymane bioszkła P-3 i P-4 są bioaktywne w kontakcie z roztworem SBF. Na ich powierzchni tworzą się sferyczne agregaty o rozmiarach około 3 m, struktur typowych dla morfologii apatytu uzyskiwanego w sposób biomimetyczny, 2. Wytworzone w formie nanoproszków biozgodne bioszkła Z-8 i B-I dotowane srebrem, wykazujące działanie bakteriobójcze stwarzają perspektywę ich stosowania w chirurgicznym leczeniu zaawansowanych chorób przyzębia, 3. Aktywność przeciwbakteryjną in vitro w odniesieniu do badanych szczepów baktrii oraz drożdżaków uzyskano dzięki uwalnianym z bioszkieł Z-8 i B-I jonom Ag +.