Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk Sopot Polimorfizm transpozonów z rodziny Tc1-podobnych w genomach ryb Rozprawa doktorska Anita Poćwierz-Kotus Promotor: Recenzenci: prof. dr hab. Roman Wenne prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn dr hab. Dariusz Grzebelus
Wprowadzenie Elementy transpozonowe Transpozony są odcinkami DNA zdolnymi do zmiany miejsca położenia w genomie. Transpozony mają znaczący udział w składzie prokariotycznych i eukariotycznych genomów, a zakres ich występowania obejmuje prawie wszystkie zbadane organizmy. Dzięki zdolności do transpozycji elementy te mogą rozprzestrzeniać się zarówno w obrębie pojedynczej komórki poprzez kopiowanie się w nowych miejscach genomu, jak i między osobnikami wewnątrz populacji, a także pomiędzy gatunkami w procesie horyzontalnego transferu (HT).
Wprowadzenie Elementy transpozonowe Eukariotyczne elementy transpozonowe I klasa: retrotranspozony mechanizm transpozycji copyand-paste w transpozycji uczestniczy RNA gen kodujący odwrotną transkryptazę II klasa: transpozony DNA mechanizm transpozycji cutand-paste gen kodujący transpozazę odwrócone terminalne powtórzenia - ITR (ang. inverted terminal repeat) LTR gag RH IN RT LTR ITR ITR gen transpozazy
Wprowadzenie Transpozony Tc1 Jedną z rodzin TE klasy II jest rodzina transpozonów Tc1-podobnych, homologiczna do sekwencji Tc1 u nicienia Caenorhabditis elegans. Występuje ona w genomach wielu gatunków zwierząt, szczególnie zaś rozpowszechniona jest w genomach ryb i płazów. Większość kopii transpozonów Tc1 z powodu wielokrotnych mutacji jest nieaktywna i występuje w postaci stałych składników genomu (tzw. genetyczna skamieniałość).
Wprowadzenie Horyzontalny transfer HT - zjawisko umożliwiające transmisję TE od jednego gatunku gospodarza do innego, za pośrednictwem wektora. T HT aktywnego transpozonu Kolonizacja genomowego DNA Wzrost liczby kopii Rozprzestrzenienie w populacji Stochastyczna utrata Gatunek A Kolejny HT Wertykalna inaktywacja Kolejny HT Mutacje punktowe Gatunek B Gatunek C
Wprowadzenie Horyzontalny transfer T Doniesienia w pracy Leavera (2001) o HT u ryb i płazów: Kompletna kopia transpozonu Tc1-podobnego zidentyfikowana w genomie Pleuronectes platessa może świadczyć o zachowaniu zdolności do transpozycji tego transpozonu. Obecność spokrewnionych transpozonów z rodziny Tc1- podobnych w genomach Pleuronectes platessa, Salmo salar, Rana temporaria, czyli gatunków, których dywergencja nastąpiła ponad 400 mln lat temu może świadczyć o horyzontalnej transmisji tego transpozonu.
Cele pracy Zbadanie zakresu występowania transpozonów z rodziny Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb. Określenie polimorfizmu i uzyskanie charakterystyki sekwencji transpozonów Tc1-podobnych w badanych gatunkach ryb. Przeprowadzenie analizy filogenetycznej transpozonów Tc1-podobnych zidentyfikowanych w genomach ryb. Wykazanie możliwości zajścia horyzontalnego transferu u wybranych gatunków ryb. Opracowanie metodyki określania miejsc integracji transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb.
Metody Pobór prób Badaniami objętych było 495 osobników należących do 36 gatunków ryb zasiedlających wody słone i słodkie. Najliczniejszą grupę stanowili przedstawiciele rodzin: Pleuronectidae 179 osobników: Platichthys flesus Pleuronectes platessa Scophthalmidae 82 osobniki: Scophthalmus maximus Percidae 54 osobniki: Perca fluviatilis Liczebnościowo mniejsze grupy stanowili przedstawiciele rodzin: Esocidae, Salmonidae, Gobidae, Merlucciidae, Cyprinidae, Clupeidae, Belonidae, Gadidae, Poeciliidae, Dasyatidae, Ophidiidae, Channichthyidae, Anguillidae, Scombridae, Gempylidae, Carangidae, Scorpaenidae.
Metody Polimorfizm transpozonów Tc1-podobnych Izolacja DNA Amplifikacja PCR Trawienie enzymami restrykcyjnymi Startery komplementarne do genu transpozazy Pojedynczy starter komplementarny do ITR Transfer DNA na membranę nylonową RFLP Klonowanie do wektora pgem3zf(+) Sekwencjonowanie Analiza bioinformatyczna sekwencji Hybrydyzacja z sondą specyficzną do fragmentu genu transpozazy
Metody Identyfikacja miejsc insercji transpozonów Tc1-podobnych Izolacja DNA Trawienie enzymami restrykcyjnymi Ligacja fragmentów restrykcyjnych Odwrotna reakcja PCR (ang. inverse PCR) Ponowna reakcja PCR (repcr) Sekwencjonowanie Obróbka bioinformatyczna sekwencji
Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Analiza przesiewowa przy pomocy techniki PCR Liczba przebadanych gatunków 36 Liczba przebadanych osobników 495 starter I (1) starter I (1630) produkt PCR (1630 pz) pz) starter APK1 (407) starter APK2 (1220) produkt PCR (814 pz) ITR gen transpozazy ITR
Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach wybranych gatunków ryb oszacowana dzięki amplifikacji PCR z pojedynczym starterem I. A B C D E F B G F E F H F H I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 3530 1904 1584 1375 947 564 A - P. platessa B - P. flesus C - S. salar D - H. platessoides E - R. hippoglossoides F - E. lucius G - S. maximus H - S. lucioperca I - C. harrengus (I)
Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb oszacowana z zastosowaniem amplifikacji PCR z parą starterów komplementarnych do genu Tnp. M P. platessa P. flesus S. trutta fario M 947 564
Platichthys flesus Pleuronectes platessa Salmo trutta fario Salmo trutta trutta Anguilla anguilla Salmo salar Esox lucius Scophthalmus maximus Stizostedion lucioperca Limanda aspera Neogobius melanostomus Blicca bjoerkna Danio rerio Clupea harengus Sprattus sprattus Belone belone Theragra chalcogramma Poecilia sphenops Thunnus albacares Megalaspis cordyla Perca fluviatilis Abramis brama Urogymnus asperrimus Hippoglossoides platessoides Merluccius merluccius Oncorhynchus nerka Rutilus rutilus Gadus morhua Reinhardtius hippoglossoides Cyprinus carpio Tinca tinca Genypterus capensis Champsocephalus gunnari Scomber scombrus Ruvettus pretiosus Sebastes marinus % 142 25 19 1 3 7 16 82 21 4 5 1 2 10 10 8 3 2 4 4 33 13 3 3 2 6 5 21 5 2 3 8 14 3 2 3 Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Liczebność 100 90 80 70 60 PCR 1 PCR 2 150 135 120 105 90 50 40 30 20 10 0 75 60 45 30 15 0
Wyniki Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych Gatunek Liczba osobników Miejsce pochodzenia Platichthys flesus 15 Morze Bałtyckie Pleuronectes platessa 10 Morze Bałtyckie Scophthalmus maximus 5 Morze Bałtyckie Salmo trutta fario 2 hodowla rybna, Gościcino Salmo salar 2 Morze Norweskie Esox lucius 13 Jezioro Żarnowieckie fragment restrykcyjny 711 pz PvuII (663) BamHI (763) PvuII(1374) gen transpozazy
Wyniki Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych Użyto enzymów restrykcyjnych: PvuII, BamHI, HindIII. Enzym restrykcyjny PvuII Platichthys flesus Pleuronectes platessa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ok. 710 pz
Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych określony przy użyciu RFLP Użyto enzymów restrykcyjnych: AluI, MboI, DdeI, HinfI. Gatunek Liczba osobników Miejsce pochodzenia Platichthys flesus 44 Morze Bałtyckie Morze Północne Pleuronectes platessa 20 Morze Bałtyckie Scophthalmus maximus 5 Morze Bałtyckie Salmo trutta fario 5 hodowla rybna, Gościcino Salmo salar 10 Morze Norweskie A - Platichthys flesus B - Pleuronectes platessa A B A B A B 417 311 249 200 140
Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych Klonowanie sekwencji transpozonów Tc1-podobnych z 10 osobników ryb reprezentujących 8 gatunków: Lp. Gatunek 1 Platichthys flesus 31S 200S 8ST Symbol osobnika Pochodzenie Morze Bałtyckie Morze Bałtyckie Morze Północne Liczba uzyskanych klonów 2 Pleuronectes platessa 50G Morze Bałtyckie 20 3 Scophthalmus maximus 11SKB Morze Bałtyckie 20 4 Esox lucius 10E Jezioro Żarnowieckie 30 5 Belone belone BB5 Morze Bałtyckie 16 6 Neogobius melanostomus 4B Morze Bałtyckie 19 94 20 20 7 Perca fluviatilis O35 Morze Bałtyckie 16 8 Oncorhynchus nerka ON6 Ocean Spokojny 20 Ogółem 275 klonów
Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych Przeprowadzono zestawienie 275 sekwencji, na bazie którego skonstruowano globalne drzewo filogenetyczne. Na podstawie jego topologii wydzielono 7 kladów: A, B, C, D, E, F, G, których odrębność potwierdzono za pomocą obliczeń średniego zróżnicowania genetycznego. KLAD GATUNKI Śr. zróżnicowanie genetyczne A P. flesus (131), P. platessa (20), S. maximus (18), O. nerka (1) 0,043 B N. melanostomus (19), P. fluviatilis (13) 0,01 C B. belone (10) 0,06 D O. nerka (19) 0,19 E E. lucius (11), B. belone (6), P. fluviatilis (3) 0,1 F P. flesus (3), S. maximus (2) 0,04 G E. lucius (19) 0,0005
Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych z uwzględnieniem sekwencji uzyskanych z baz danych A P. flesus, P. platessa S. maximus, O. nerka B C D E N. melanostomus, P. fluviatilis B. belone O. nerka E. lucius, B. belone P. fluviatilis F G P. flesus, S. maximus E. lucius a - (Leaver, 2001) b - (Ivics i in., 1996) c - (Sinzelle i in., 2005) d transozaza BX294110of Danio rerio, e transpozaza CR931802 of Danio rerio, f - (Jaillon i in., 2004)
Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na sekwencjach aminokwasowych W obrębie zidentyfikowanych 7 kladów wydzielono 13 sekwencji konsensusowych dla każdego gatunku: Tc1-1Pla, Platichthys flesus Tc1-1Ple, Pleuronectes platessa Tc1-1Sco, Scophthalmus maximus Tc1-1Onc, Oncorhynchus nerka Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka Tc1-1Bel, Belone belone Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus Tc1-2Per, Perca fluviatilis Tc1-1Eso, Esox lucius Tc1-1Per, Perca fluviatilis Tc1-2Pla, Platichthys flesus Tc1-2Sco, Scophthalmus maximus Tc1-2Eso, Esox lucius
Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na sekwencjach aminokwasowych 1 0 0 68 TC 1 8 5 74 8 9 9 9 98 9 2 9 9 7 7 1 0 0 9 7 8 9 1 0 0 0.1 9 8 98 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 00 61 1 00 6 3 8 9 PPTN, Pleuronectes platessa Tc1-1P le, Pleuronectes platessa Tc1-1Sco, Sco phthalmus maximus Tc1-1Pla, Platichthys flesus Tc1-1Onc, Oncorhynchus nerka Tc1-2P la, Platichthys flesus Tc1-2Sco, S co phthalmus maximus Tc1-10Xt (Eagle), Xenopus tropicalis Tc1-2Ory, Oryzias latipes Glan, Oncorhynchus mykiss Tc1-1Ory, Oryzias latipes Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka Barb, Oncorhynchus mykiss SSTN, Salmo salar Tc1-12Xt, Xenopus tropicalis Tc1-1Bel, Belone belone Tc1-1Eso, Eso x lucius RTTN, Rana temporaria Tc1-1Per, Perca fluviatilis Tzf, Danio rerio Tc1-3Ory, O ryzias latipes Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus Tc1-2Per, Perca flu viatilis Niezidentyfikowany Tc1, Danio rerio Tc1-11Xt (Froggy), Xenopus tropicalis Tc1-1D r, Danio rerio Tc1-1Xt (XtTXr), Xenopus tropicalis Tc1-FR4, Fugu rubripes Tc1-8Xt, Xenopus tropicalis Tc1-4Xt, Xenopus tropicalis Tc1-1Tet, Tetraodon nigroviridis 1 0 0 Tc1-FR6, Fugu rubripes Tss, Salmo salar Tdr1, Danio rerio Tc1-2Xt (M aya), Xenopus tropicalis 8 9 Tc1-2Eso, Eso x lucius 1 00 Tc1-FR1, Fugu rubripes Titof2, Tetraodon nigroviridis 1 00 5 9 Tc1DR3, Danio rerio 6 3 Tc1-4Ory, Oryzias latipes 1 00 1 2 3 4 5
Wyniki Szacowanie prawdopodobieństwa zajścia HT na podstawie dystrybucji zidentyfikowanych transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb Xenopus tropicalis Rana temporaria Danio rerio 485MYA Porównanie struktury transpozonów 400MYA 288MYA Oncorhynchus mykiss Oncorhynchus nerka 75MYA Salmo salar 261 MYA Esox lucius Tetraodon nigroviridis 84MYA Takifugu rubripes Neogobius melanostomus 190MYA 180MYA Belone belone Oryzias latipes Perca fluviatilis Pleuronectes platessa 1.6MYA Platichthys flesus 5MYA Scophthalmus maximus 99% 98%
Wyniki Opracowanie metodyki umożliwiającej identyfikację miejsca integracji transpozonów Tc1-podobnych w genomie storni P. flesus genomowy DNA Tc1 Tc1 Tc1 trawienie HindIII odwrotna reakcja PCR Tc1 Tc1 ligacja Tc1 Tc1 Tc1 Tc1 starter I (1381) inv6 (1251) APK1 (1) inv1 (1614) inv4 (1493) 1630 pz inv3 (124) Tc1 Tc1 Tc1 SFT inv5 (989) HindIII (748)
Wyniki Identyfikacja i analiza sekwencji miejsca integracji kopii transpozonu Tc1-podobnego w genomie storni P. flesus Wykres zależności filogenetycznych: sekwencje aa 156 sekwencji RVT z bazy Pfam (tzw. SEED) 10 reprezentantów ze 100 sekwencji z bazy est (GenBank) SFT LINE: ryby, owady niescharakt. RVT retrowirusy retroelementy: owady, rosliny 0.1
Wnioski Transpozony z rodziny Tc1-podobnych są szeroko rozpowszechnione w genomach ryb. Lokalizacja sekwencji transpozonowych w obrębie gatunku jest konserwatywna, natomiast zaobserwowano polimorfizm na poziomie międzygatunkowym. Identyczność transpozonów zidentyfikowanych u okonia i babki może wskazywać na horyzontalny transfer.
Wnioski Zademonstrowano integrację transpozonu Tc1 do zdegenerowanego retrotranspozonu LINE. Zależności filogenetyczne między analizowanymi transpozonami nie potwierdzają hipotezy Leavera.
Dziękuję za. uwagę Poćwierz-Kotus A, Wenne R. Properties of mobile elements of genomes and their application in biotechnology. Environmental Biotechnology, in press. Wenne R, Handschuh L, Poćwierz-Kotus A, Urbaniak R, Formanowicz P, Całkiewicz J, Brzozowska K, Figlerowicz M, Węgrzyn G, Wróbel B. The application of microarray technology to the identification of Tc1-like element sequences in fish genomes. Marine Biology Research, in press Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2010. Identification of a Tc1- like transposon integration site in the genome of the flounder (Platichthys flesus): a novel use of an inverse PCR method. Marine Genomics, 3: 45-50 Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2007. Family of Tc1-like elements from fish genomes and horizontal transfer. Gene, 390: 243-251
Dziękuję za. uwagę