Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Vol. 8/2009 Nr 4(29) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Ocena krążących komórek dendrytycznych i limfocytów T regulatorowych u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1 Evaluation of Circulating Dendritic Cells and T Regulatory Cells in Children with Newly Diagnosed Type 1 Diabetes Mellitus 1* Jacek Tabarkiewicz, 2* Robert Piekarski, 1 Magdalena Wasiak, 1 Paulina Wdowiak, 1 Jacek Roliński, 2 Leszek Szewczyk 1 Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Klinika Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej UM, Uniwersytet Medyczny w Lublinie *Autorzy mają jednakowy wkład w pracę Adres do korespondencji: Robert Piekarski, Klinika Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul. Chodźki 2, 20-093 Lublin, e-mail: r.piekarski@wp.pl Słowa kluczowe: cukrzyca typu 1, komórki dendrytyczne, limfocyty T regulatorowe Key words: type 1 diabetes mellitus, dendritic cells, T regulatory cells Praca finansowana z grantu MNiSW nr N N407 3100 33 STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. Cukrzyca typu 1 jest chorobą o podłożu autoimmunizacyjnym, w której w odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko antygenom komórek β wysp trzustkowych ważną rolę odgrywają komórki dendrytyczne i limfocyty Treg. Celem naszego badania była ocena krążących komórek dendrytycznych mieloidalnych (mdc) i plazmacytoidalnych (pdc) oraz limfocytów Treg. Materiał i metody. Badaniami objęto 30 dzieci z cukrzycą typu 1 i 10 zdrowych rówieśników. Komórki dendrytyczne i limfocyty oceniano przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i cytometrii. Rezultaty. Stwierdziliśmy istotnie wyższy odsetek krążących mieloidalnych komórek dendrytycznych oraz istotnie mniejszy odsetek limfocytów Treg u chorych na cukrzycę typu 1. Poziom limfocytów Treg dodatnio korelował ze stężeniem C-peptydu we krwi. Wnioski. Nasze wyniki potwierdzają istotny udział obu badanych populacji w odpowiedzi immunologicznej towarzyszącej cukrzycy typu 1. Endokrynol. Ped. 8/2009;4(29):27-34. Introduction. Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease characterized by an inflammatory response against the insulin-producing β cells of the pancreas, in which dendritic cells and Treg cells play pivotal role. The aim of our study was to evaluate circulating myeloid and plasmacytoid dendritic cells and Treg lymphocytes. Material and methods. The group of 30 children with T1DM and 10 healthy children in control group were examined. Dendritic 27

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):27-34 cells and Treg cell were evaluated with use of monoclonal antibodies and flow cytometry. Results. We found significantly higher percentage of circulating myeloid dendritic cells and significantly lower percentage of Treg in the blood of patients with T1DM. We also found that percentage of Treg positively correlated with C-peptide level. Conclusions. Our results confirmed that both examined leukocytes population play important role in immunological response associated with diabetes mellitus type 1. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;4(29):27-34. Wstęp Wiedza dotycząca patogenezy cukrzycy typu 1 o podłożu autoimmunologicznym wydaje się stale niewystarczająca, wciąż nie poznaliśmy wielu istotnych elementów. W klasycznym tzw. kopenhaskim modelu [1] patogenezy cukrzycy typu 1 zakłada się u osób predysponowanych genetycznie udział w indukowaniu procesu insulitis czynników zarówno endogennych, jak cytokiny, wolne rodniki, jak i egzogennych, jak wirusy, toksyny, niektóre składniki zawarte w pożywieniu. Proces niszczenia komórek beta ma swój początek dużo wcześniej przed klinicznym ujawnieniem się cukrzycy u chorego. W proces niszczenia komórek beta wysp trzustki zaangażowane są komórki dendrytyczne, które w lokalnych węzłach chłonnych aktywują autoreaktywne limfocyty T pomocnicze [2, 3], te natomiast uruchamiają całą kaskadę zdarzeń w postaci aktywacji odpowiedzi humoralnej aktywacja limfocytów B, makrofagów, komórek beta prowadząca do zwiększonej produkcji i sekrecji wielu cytokin prozapalnych oraz odpowiedzi komórkowej efekt cytotoksyczny indukowany limfocytami T CD8+, komórkami NK, na co nakłada się również zaburzona funkcja komórek biorących udział w regulacji tolerancji w stosunku do własnych tkanek limfocyty T regulatorowe (Treg) [4]. Ostatecznie odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko antygenom komórek β wysp trzustkowych doprowadza do ich całkowitego zniszczenia i bezwzględnego niedoboru insuliny. Celem naszego badania była ocena krążących komórek dendrytycznych mieloidalnych (mdc) i plazmacytoidalnych (pdc) oraz limfocytów Treg u dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1. Materiał i metody Do badań włączono grupę 30 dzieci (12 dziewcząt i 18 chłopców) w wieku średnio 10,13 lat ± 3,13 ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1, leczonych w Klinice Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej UM w Lublinie. Między 14 a 21 dniem od rozpoznania cukrzycy po wcześniejszym wyprowadzeniu z ketozy i uzyskaniu względnego wyrównania glikemii oznaczono u wszystkich pacjentów C-peptydu metodą elektrochemiluminescencji, miano przeciwciał przeciwko dekarboksylazie kwasu glutaminowego (a-gad) oraz przeciwko fosfatazie tyrozyny (a-ia2) metodą ELISA firmy Immunotech. Wyniki badań laboratoryjnych przedstawiono w tabeli I. Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych dzieci w wieku średnio 12,4 ± 2,63. Od wszystkich badanych dzieci zabezpieczono próbki krwi do dalszej oceny immunologicznej. Protokół badania został zaakceptowany przez Komisję Bioetyczną przy Uniwersytecie Medycznym w Lublinie. Po uzyskaniu świadomej zgody od opiekunów oraz pacjentów po ukończeniu 16. roku życia w czasie standardowych badań diagnostycznych pobierano 5 ml krwi obwodowej do heperanizowanych probówek (Sarstedt, Niemcy). Wszystkie osoby w czasie badań oraz w okresie miesiąca poprzedzającego badania nie wykazywały cech infekcji, nie przyjmowały leków mających wpływ na układ immunologiczny, nie miały też wykonywanej transfuzji krwi. Z badań zostały wykluczone osoby podające w wywiadzie choroby alergiczne lub autoimmunologiczne. Izolacja komórek mononuklearnych z krwi obwodowej Krew obwodową rozcieńczono zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS bez soli wapnia i magnezu (Biochrome AG, Niemcy) w proporcji 1:1. Rozcieńczoną krew nawarstwiono na preparat Gradisol L (Aqua Medica, Polska) o ciężarze właściwym 1,077 g/ml. Komórki wirowano w gradiencie gęstości przez 20 minut przy przyspieszeniu 700 x g. Uzyskane komórki płukano dwukrotnie w roztworze PBS bez Ca 2+ i Mg 2+. Następnie oceniono ich ilość w komorze Neubauera i żywotność za pomocą błękitu trypanu (0,4% Trypan Blue Solution, Sigma, Niemcy). Żywotność poniżej 90% dyskwalifikowała komórki z dalszych badań. Ocena krążących komórek dendrytycznych Wyizolowane komórki mononuklearne wypłukano dwukrotnie w buforze PBS bez Ca 2+ i Mg 2+ z dodatkiem 28

Tabela I. Parametry charakteryzujące grupę dzieci z cukrzycą typu 1 Table I. The parameters characterized in children with type 1 DM Badany parametr Średnia SD C-peptyd 0 min. (ng/ml) 0,66 0,29 C-peptyd 6 min. po stymulacji glukagonem 1,23 0,53 a-gad (IU/ml) 571,13 1156,71 a-ia2 (IU/ml) 429,67 680,96 zapotrzebowanie dobowe na insulinę (jedn./dobę) 11,80 11,00 0,5% albuminy bydlęcej (BSA) (Sigma-Aldrich, Niemcy) oraz 2mM EDTA (Sigma-Aldrich, Niemcy). Komórki zawieszano w wyżej opisanym buforze w ilości 80 μl na 10 7 komórek oraz dodawano 20 μl FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec, Niemcy), w celu wykluczenia niespecyficznego wiązania przeciwciał poprzez fragment Fc. Następnie dodawano 10 μl przeciwciał na 10 7 badanych komórek według następujących kombinacji: anty-bdca-1 (CD1c) FITC (Miltenyi-Biotec, Niemcy) / anty-cd19 Cy- Chrome (BD Pharmingen, USA) (Izotyp IgG 1 /IgG 1 ), anty-bdca-2 (CD303) FITC (Miltenyi-Biotec, Niemcy) / anty CD123 PE (Becton Dickinson, USA) (Izotyp IgG 1 /IgG 1 ) i inkubowano przez 10 min. w temp. 4 C w ciemności. Po upływie tego czasu dodawano 2 ml buforu i wirowano komórki przez 10 min., przy przyśpieszeniu 300 x g w temp. 4 C. Po odwirowaniu komórki poddawano natychmiastowej analizie w cytometrze przepływowym. Przy pomocy programu CellQuest analizowano odsetek niedojrzałych komórek dendrytycznych mieloidalnych BDCA-1+/CD19- i plazmacytoidalnych BDCA-2+/CD123+ wśród mononuklearnych leukocytów. Bankowanie komórek Proces zamrażania przeprowadzony był w łaźni lodowej. Medium do zamrażania składało się z RPMI 1640 (Biochrome AG, Niemcy) z dodatkiem 10% ludzkiej albuminy (Baxter, USA) i 10% DMSO (ICN Polfa Rzeszów, Polska). Do 1 ml tego medium dodawano po 20 x 10 6 komórek. PBMC przechowywano w parach ciekłego azotu. Zamrożone komórki przenoszone były do łaźni wodnej o temp. 37ºC, gdzie stopniowo dodawana była pożywka RPMI 1640 z dodatkiem 10% ludzkiej albuminy. Następnie komórki odwirowano przy obrotach 700 x g przez 10 minut, określono żywotność przy użyciu błękitu trypanu, zawieszono w odpowiednim buforze i przygotowano do oznaczanie odsetka limfocytów Treg. Oznaczanie limfocytów T regulatorowych. Do oceny odsetka limfocytów T regulatorowych wykorzystano zestaw Human Treg Flow TM Kit (FOXP3 Alexa Fluor 488/CD4 PE-Cy5/CD25 PE) firmy BioLegend, USA. Rozmrożone komórki jednojądrzaste wypłukano dwukrotnie w roztworze PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+. Następnie zawiesinę komórek rozdzielano do poszczególnych probówek w ilości 2 x 10 6 komórek w 100 μl PBS na każdą próbkę. Do zawiesiny komórek mononuklearnych dodawano 20 μl przeciwciał monoklonalnych anty CD4 PE-Cy5/CD25 PE. Po dokładnym wymieszaniu przeprowadzano 20 min. inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie komórki dodawano do 1 ml roztworu PBS bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ i wirowano przez 5 minut przy przyspieszeniu 250 x g. Po odwirowaniu i zlaniu nadsączu komórki poddawane były procedurze utrwalenia i permabilizacji przy wykorzystaniu buforów zawartych w zestawie. Następnie przeprowadzono znakowanie wewnątrzkomórkowego antygenu FOXP3 w czasie 35 min. w temperaturze pokojowej za pomocą przeciwciała anty-foxp3 Alexa Fluor 488. Do każdej próbki badanej przeprowadzano równolegle próbę kontrolną z wykorzystaniem kontroli izotypowej dla przeciwciała anty-foxp3. Po zakończeniu inkubacji komórki płukano dwukrotnie w 2 ml roztworu płuczącego w czasie 5 min. przy przyspieszeniu 250 x g. Komórki zawieszano w 0,5 ml buforu i poddawano analizie cytometrycznej. Wyniki podano jako odsetek limfocytów CD4+/CD25high/ FOXP3+ wśród limfocytów CD4+. Analiza statystyczna. Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 7.0 PL. Zgodność rozkładu poszczególnych zmiennych w obrębie grup z rozkładem normalnym sprawdzono przy pomocy testu W Shapiro-Wilka. Ponieważ badane zmienne nie miały rozkładu normalnego, do analizy użyto testów 29

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):27-34 nieparametrycznych U Manna Whitneya do oceny różnic pomiędzy grupami i współczynnika korelacji rang Spearmana dla oceny zależności pomiędzy zmiennymi. Otrzymane wyniki przedstawiono jako medianę oraz wartość najmniejszą szeregu statystycznego (Min.) oraz wartość największą szeregu statystycznego (Maks.). Wyniki jako istotne statystycznie przyjmowano przy poziomie istotności p 0,05. Wyniki W naszych badaniach przeanalizowaliśmy odsetek krążących we krwi komórek dendrytycznych mieloidalnych BDCA-1+/CD19- i plazmacytoidalnych BDCA-2+/CD123+ wśród jednojądrzastych. We krwi dzieci chorych na cukrzycę typu 1 stwierdziliśmy, że średni odsetek mieloidalnych DCs wynosił 0,55% (0,16 1,78%) i był istotnie wyższy (p < 0,05) niż w grupie dzieci zdrowych (0,22%; 0,04 0,53%). Odsetek komórek plazmocytoidalnych wynosił 0,39% (0,09 1,07%) i nie różnił się istotnie od analogicznego odsetka w grupie odniesienia. Dodatkowo dla opisania równowagi pomiędzy tymi populacjami obliczono stosunek odsetków mieloidalnych i plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych. W badanej grupie stosunek ten wynosił 1,32 (0,50 4,83) i nie różnił się istotnie od analogicznego odsetka w grupie odniesienia. Kolejnym etapem badań było oznaczenie odsetka limfocytów Treg (CD4+/CD25high/FOXP3+) wśród limfocytów CD4+ krwi obwodowej, jego mediana wynosiła 4,33% (1,41 9,37%). U pacjentów odsetek ten był istotnie niższy niż u dzieci z grupy odniesienia 6,2% (3,23 7,46%). Wyniki zebrano w tabeli II. Analizie zostały poddane także zależności pomiędzy parametrami immunologicznymi a laboratoryjnymi. Wykazaliśmy istotną korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów Treg a stężeniem C-peptydu we krwi pacjentów (ryc. 1). Pozostałe zależności nie były istotne. Dyskusja W grupie pacjentów z cukrzycą typu 1 odnotowaliśmy istotnie wyższy odsetek krążących mieloidalnych komórek dendrytycznych. Steptoe i wsp. wykazali na modelu mysim cukrzycy wzrost generacji komórek dendrytycznych linii mieloidalnej [5], a Peng i wsp. [6] stwierdzili blokadę dojrzewania komórek dendrytycznych w myszach NOD, co prowadziło do rozwoju zapalania wysp trzuskowych. Wyniki te pozostają w zgodności z naszymi, gdyż krążące mieloidalne komórki dendrytyczne BDCA-1+ wykazują cechy niedojrzałych komórek dendrytycznych [7]. Ciekawe, chociaż sprzeczne doniesienia opisują rolę plazmocytoidalnych DC w patogenezie cukrzycy typu 1. Chen i wsp. [8] stwierdzili istotnie obniżone odsetki pdc we krwi pacjentów w porównaniu ze zdrowymi dawcami. Jednak w grupie Chen zdrowi dawcy byli istotnie starsi od pacjentów, podczas gdy nasze badania dotyczyły grup rówieśniczych. Z kolei Allen i wsp. [9] opisali istotnie wyższy odsetek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych we krwi osób z cukrzycą w porównaniu ze zgodną wiekowo grupą kontrolną. Vuckovic i wsp. [10] stwierdził jeszcze inne zależności w jego badaniu pacjenci mieli istotnie Tabela II. Statystyki opisowe badanych parametrów immunologicznych Table II. Statistics of investigated immunological parameters cukrzyca Mediana grupa kontrolna cukrzyca Min. Maks. grupa kontrolna Odsetek komórek BDCA-1+/CD19-0,55% 0,22% 0,16-1,78% 0,04-0,53% < 0,01 Odsetek komórek BDCA-2+/CD123+ 0,39% 0,17% 0,09-1,07% 0,07-0,87% NS Stosunek pomiędzy populacjami komórek dendrytycznych 1,32 0,88 0,50-4,83 0,33-3,78 NS p Odsetek limfocytów CD4+/CD25+/FOXP3+ wśród limfocytów CD4+ 4,33% 6,2% 1,41-9,37% 3,23-7,46% < 0,05 Przeciwciała anty-gad 571,13 IU/ml - 9,95-4000 IU/ml - - Przeciwciała anty-ia2 429,67 IU/ml - 1,7-3319 IU/ml - - 30

Ryc. 1. Korelacja odsetka limfocytów Treg z stężeniem C-peptydu we krwi dzieci chorych na cukrzycę typu 1 Fig 1. Correlation between percentages of Treg lymphocytes and C-peptide levels in children with type 1 diabetes mellitus obniżone odsetki obu populacji komórek dendrytycznych w stosunku do zgodnej wiekowo grupy kontrolnej. W naszym badaniu wykazaliśmy istotnie niższy odsetek limfocytów Treg CD4+/CD25high/ FOXP3+ u dzieci chorych na cukrzycę typu 1 w porównaniu z grupą dzieci zdrowych. Łuczyński i wsp. [11] opisali istotnie niższy odsetek limfocytów CD4+/CD25high u dzieci z cukrzycą, jednak odsetek limfocytów Treg w ich badaniu nie różnił się pomiędzy pacjentami a dziećmi zdrowymi. Różnicę tę można wyjaśnić różnicami metodologicznymi, gdyż grupa ta używała do oceny Treg innych antygenów CD4+/CD25high/CD127dim/ a wyniki podano jako odsetek Treg wśród komórek monuklearnych krwi obwodowej. Dodatkowo stwierdzili oni u dzieci z cukrzycą typu 1 zmniejszoną ekspresję mrna dla białek biorących udział w immunoregulacji: CTLA-4, ICOS1, IL-23, IL-27, SMAD3 i GITR [11]. Brusko i wsp. [12] także nie wykazali różnic w poziomie limfocytów Treg pomiędzy dziećmi z cukrzycą typu 1 a zdrowymi dawcami, jednak w odróżnieniu od naszego badania ich grupę odniesienia stanowili dawcy dorośli w wieku powyżej 20 lat. Średni wiek w naszej grupie odniesienia był zbliżony do grupy badanej. Sprzeczne są także doniesienia dotyczące kwestii, czy limfocyty Treg u pacjentów z cukrzycą typu 1 w pełni spełniają swą funkcję wykazując efekt immunosupresyjny [11 13]. Wyjaśnienie tych różnic wymaga ujednolicenia metodologii badań analizy cytometrycznej, jak i klinicznej, jeśli chodzi o czas trwania choroby, sposób i intensywność leczenia, wiek pacjentów i grup odniesienia. Wykazaliśmy także istotną pozytywną korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów Treg a stężeniem C-peptydu we krwi dzieci chorych. Wynik ten z jednej strony mógłby sugerować ochronną rolę limfocytów Treg i wydzielanych przez nie cytokin w stosunku do komórek produkujących insulinę. Z drugiej strony Kiviling i wsp. [14] wykazali, że stymulacja insuliną limfocytów uzyskanych od chorych na cukrzycę typu 1 indukuje ekspresję mrna dla FOXP3, zwiększając ilość limfocytów FOXP3+. Turner i wsp. [15] sugerują, w badaniu na modelu mysim, że efekt ten jest zależny od dawki antygenu, a odpowiedzialne za niego są dojrzale i niedojrzale komórki dendrytyczne. W naszym badaniu nie wykazaliśmy jednak korelacji pomiędzy odsetkiem limfocytów FOXP3+ a dobową dawką insuliny czy odsetkami poszczególnych populacji komórek dendrytycznych. W naszej pracy skoncentrowaliśmy się na dwóch subpopulacjach leukocytów: komórkach dendrytycznych i limfocytach T regulatorowych. Interakcje 31

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):27-34 pomiędzy tymi komórkami są ważne nie tylko dla zrozumienia patogenezy cukrzycy typu 1 i reakcji autoimmunizacyjnych, toczących się przeciwko antygenom komórek wysp trzustkowych, ale także ze względu na przyszłe metody immunoterapii. Wyniki Gagliani i wsp. [16] sugerują, że efektywność transplantacji wysp trzustkowych jest zależna od odsetka limfocytów Treg u pacjenta, a także może być zwiększona poprzez podawanie limfocytów Treg. Badania Long i wsp. [17] przedstawiają zachęcające rezultaty badań przedklinicznych, prowadzących do opracowania metody generacji z leukocytów krwi obwodowej swoistych dla antygenów wysp trzustkowych limfocytów Treg. Wykazano także, iż komórki dendrytyczne, które początkowo są odpowiedzialne za indukcję zjawisk autoimmunizacyjnych w patogenezie cukrzycy typu 1, mogą być użyteczne w immunomodulacji i indukcji autotolerancji [18]. W badaniach na myszach NOD wykazano, że modyfikowane komórki dendrytyczne mogą zapobiegać wystąpieniu cukrzycy [19], a także mieć wpływ na zahamowanie procesu chorobowego [20]. W obu przypadkach za korzystny efekt odpowiadała indukcja limfocytów Treg. Z drugiej strony Radhakrishnan i wsp. [21] wykazali, że DC aktywowane substancją immunomodulującą DC Xab mogą prowadzić do zupełnie odwrotnego i zaskakującego efektu indukcji przemiany limfocytów Treg w limfocyty efektorowe. W pracy przedstawiliśmy wstępne wyniki badań zakrojonych na szerszą skalę i obejmujących szczegółowo problem roli i interakcji komórek dendrytycznych i limfocytów T regulatorowych w cukrzycy typu 1. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Freiesleben De Blasio B., Bak P., Pociot F., Karlsen A.E. & Nerup J.: Onset of type 1 diabetes: a dynamical instability. Diabetes, 1999: 48, 1677-1685. [2] Morel P.A., Vasquez A.C., Feili-Hariri M.: Immunobiology of DC in NOD mice, J. Leukoc. Biol., 1999:66, 276-280. [3] Calderon B., Suri A., Miller M.J., Unanue E.R.: Dendritic cells in islets of Langerhans constitutively present beta cell-derived peptides bound to their class II MHC molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008:105, 6121-6126. [4] Brusko T.M., Putnam A.L., Bluestone J.A.: Human regulatory T cells: role in autoimmune disease and therapeutic opportunities. Immunol Rev., 2008:223, 371-390. [5] Steptoe R.J., Ritchie J.M., Harrison L.C.: Increased generation of dendritic cells from myeloid progenitors in autoimmune-prone nonobese diabetic mice. J. Immunol., 2002:168, 5032-5041. [6] Peng R., Bathjat K., Li Y. et al.: Defective maturation of myeloid dendritic cell (DC) in NOD mice is controlled by IDD10/17/18. Ann. N Y Acad. Sci., 2003:1005, 184-186. [7] Dzionek A., Fuchs A., Schmidt P. et al.: BDCA-2, BDCA-3, and BDCA-4: three markers for distinct subsets of dendritic cells in human peripheral blood. J. Immunol., 2000:165, 6037-6046. [8] Chen X., Makala L.H., Jin Y. et al.: Type 1 diabetes patients have significantly lower frequency of plasmacytoid dendritic cells in the peripheral blood. Clin. Immunol., 2008:129, 413-418. [9] Allen J.S., Pang K., Skowera A. et al.: Plasmacytoid dendritic cells are proportionally expanded at diagnosis of type 1 diabetes and enhance islet autoantigen presentation to T-cells through immune complex capture. Diabetes., 2009:58, 138-145. [10] Vuckovic S., Withers G., Harris M. et al.: Decreased blood dendritic cell counts in type 1 diabetic children. Clin. Immunol., 2007:123, 281-288. [11] Łuczyński W., Wawrusiewicz-Kurylonek N., Stasiak-Barmuta A. et al.: Diminished expression of ICOS, GITR and CTLA-4 at the mrna level in T regulatory cells of children with newly diagnosed type 1 diabetes. Acta Biochim. Pol., 2009:56, 361-370. [12] Brusko T., Wasserfall C., McGrail K. et al.: No alterations in the frequency of FOXP3+ regulatory T-cells in type 1 diabetes. Diabetes., 2007:56, 604-612. [13] Putnam A.L., Vendrame F., Dotta F. et al.: CD4+CD25high regulatory T cells in human autoimmune diabetes. J. Autoimmun., 2005: 24, 55-62. [14] Kivling A., Nilsson L., Fälth-Magnusson K. et al.: Diverse foxp3 expression in children with type 1 diabetes and celiac disease. Ann. N Y Acad. Sci., 2008:1150, 273-277. [15] Turner M.S., Kane L.P., Morel P.A.: Dominant role of antigen dose in CD4+Foxp3+ regulatory T cell induction and expansion. J. Immunol., 2009:183, 4895-4903. [16] Gagliani N., Ferraro A., Roncarolo M.G. et al.: Autoimmune diabetic patients undergoing allogeneic islet transplantation: are we ready for a regulatory T-cell therapy? Immunol. Lett., 2009:127, 1-7. [17] Long S.A., Walker M.R., Rieck M. et al.: Functional islet-specific Treg can be generated from CD4+CD25- T cells of healthy and type 1 diabetic subjects. Eur. J. Immunol., 2009:39, 612-620. [18] Pasquali L., Giannoukakis N., Trucco M.: Induction of immune tolerance to facilitate beta cell regeneration in type 1 diabetes. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2008:60, 106-113. 32

[19] Cheatem D., Ganesh B.B., Gangi E. et al.: Modulation of dendritic cells using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) delays type 1 diabetes by enhancing CD4+CD25+ regulatory T cell function. Clin. Immunol., 2009:131, 260-270. [20] Tarbell K.V., Petit L., Zuo X. et al.: Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. J. Exp. Med., 2007:204, 191-201. [21] Radhakrishnan S., Cabrera R., Schenk E.L. et al.: Reprogrammed FoxP3+ T regulatory cells become IL-17+ antigen-specific autoimmune effectors in vitro and in vivo. J. Immunol., 2008:181, 3137-3147. 33