Wykorzystanie włosów do analizy substancji psychoaktywnych

prace poglądowe Joanna Margasińska-Olejak Danuta Wiechuła Agnieszka Fischer Wykorzystanie włosów do analizy substancji psychoaktywnych The human hair use for psychoactive substances analysis Katedra i Zakład Toksykologii i Bioanalizy, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Kierownik: Dr hab. n. med. Jerzy Stojko Dodatkowe słowa kluczowe: włosy narkotyki metody instrumentalne Additional key words: drugs hair instrumental methods W pracy scharakteryzowano możliwość wykorzystania włosów jako materiału do badań toksykologicznych, ze szczególnym uwzględnieniem substancji psychoaktywnych. Na przestrzeni lat nastąpił znaczący rozwój rynku narkotykowego i problemów związanych z narkomanią. Proces ten wymusza poszukiwanie coraz to dokładniejszych i bardziej wiarygodnych technik analitycznych, zakłada także wykorzystanie różnorodnych, także alternatywnych tkanek do badań. Zaprezentowane opracowanie materiałów literaturowych przedstawia możliwości wykorzystania włosów w celu identyfikacji substancji psychoaktywnych. Praca charakteryzuje proces inkorporacji ksenobiotyków do tkanek włosa, a także prezentuje zalety oraz ograniczenia związane z ich użyciem oraz przeprowadzeniem analizy. W pracy scharakteryzowane zostały także główne metody analityczne i kierunki zastosowania analizy włosów do wykrywania narkotyków w organizmie. The work is about the possibility of using hair as a material for toxicological tests, with particular emphasis on drugs. Over the years, there has been a significant development of the drug market and problems related to drug addiction. This process forces the search for more and more accurate and reliable analytical techniques, also assumes the use of a wide variety, including alternative tissue for research. The presented study based on literature reports presents the possibilities of using the hair to identify the body s exposure to the drugs. It describes the process of drug incorporation into the hair tissues, also the advantages and limitations associated using the hair to the analysis. The analytical methods and main directions of hair analysis for drug detection in the body were also characterized. Autorzy nie deklarują konfliktu interesów Otrzymano: 27.07.2018 Zaakceptowano: 10.12. 2018 Adres do korespondencji: Joanna Margasińska-Olejak ul. Kossutha 6, 40-844 Katowice tel: 509 913 565, 32 203 21 66 fax: 32 203 21 66 e-mail: joanna.margasinska@gmail.com Wstęp Sukcesywne rozpowszechnienie zjawiska narkomanii, powoduje konieczność poszukiwania nowych metod analitycznych, które umożliwią pełną diagnostykę. U osób uzależnionych, oprócz standardowych analiz krwi czy moczu, coraz częściej wykorzystuje się w badaniach materiały alternatywne, do których należą m.in. włosy [1-3]. Dokładne poznanie budowy i cyklu wzrostu włosa wskazuje, że ksenobiotyki dostarczane do organizmu, niezależnie od drogi narażenia, mają zdolność wbudowywania się w jego strukturę. Jest to niezwykle istotna cecha umożliwiająca wykorzystanie analizy włosów w różnych badaniach, w tym także tych z zakresu medycyny sądowej. Segmentowa analiza włosów pozwala na retrospektywną ocenę zażywania leków w celach medycznych. Wartość tych badań została doceniona także w przypadku konieczności potwierdzania zażywania substancji psychoaktywnych w celach niemedycznych. Współcześnie analiza włosów nie należy do rutynowej diagnostyki, ale specyficzne właściwości przemawiają za wprowadzeniem tego badania jako standardu w praktyce laboratoryjnej. W ostatnich latach nastąpił znaczny rozwój wysokoczułych metod chromatograficznych wykorzystywanych w analizie ksenobiotyków w organizmie [3,4]. Jednymi z najczęściej stosowanymi spośród nich są: wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) oraz chromatografia gazowa (GC). Bardziej precyzyjne wyniki uzyskuje się w przypadku sprzężenia chromatografii z metodami spektralnymi, takimi jak np. spektrometria mas (MS). Także udoskonalenie wydajności procesów ekstrakcji ksenobiotyków, znacznie zwiększa przydatność włosów jako materiału do badań. Celem pracy było zaprezentowanie włosów jako alternatywnego materiału do badań laboratoryjnych prowadzonych pod kątem narażenia organizmu na substancje o działaniu psychoaktywnym. Dzięki stałemu udoskonalaniu metod diagnostycznych przewiduje się, iż włosy staną się materiałem coraz powszechniej stosowanym w przypadku kontroli osób uzależnionych czy poddanych leczeniu odwykowemu związanym z zażywania substancji psychoaktywnych. Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 549

Początki zastosowania włosów w analizie toksykologicznej Geneza wykorzystania włosów do badań sięga XIX wieku i wywodzi się od działalności hiszpańskiego toksykologa Mateo Orfili, który jako pierwszy oznaczył zawartość arsenu we włosach [4,5]. Wszechstronne wykorzystanie włosów w kierunku określenia zawartości metali przypadło na lata sześćdziesiąte a w szczególności na lata siedemdziesiąte i osiemdziesiąte XX wieku. Włosy wykorzystywane były do oceny narażenia na substancje toksyczne, początkowo głównie do wykrywania pierwiastków takich, jak arsen czy rtęć. Z czasem analiza włosów została rozszerzona o oznaczanie wielu substancji organicznych, w tym także narkotyków [1-6]. Pierwsze próby wykrywania substancji narkotycznych - morfiny i heroiny we włosach prowadzono od roku 1978 za pomocą metod radioimmunologicznych i mikrochemicznych [7]. Opracowanie metody enzymatycznego trawienia komórek znacznie zwiększyło efektywność i spektrum tych badań. Możliwość wykrycia we włosach ludzkich fencyklidyny przy pomocy metod radioimmunologicznych wskazały badania Baumgartnera [7]. Z kolei w latach 1986-1989 zostały opracowane metody umożliwiające identyfikację oraz analizę we włosach metabolitów kokainy oraz innych związków o działaniu psychoaktywnym, takich jak metamfetamina, metadon czy barbiturany. Współcześnie odnotowuje się rozwój metod przesiewowych, takich jak: metody radioimmunologiczne (RIA), immunochemiczne (EMIT) i fluoroimmunochemiczne (FPIA). Analiza włosów z wykorzystaniem powyższych metod jest obecnie powszechnie stosowana w medycynie sądowej, toksykologii klinicznej czy medycynie komunikacyjnej [1]. Właściwości inkorporacyjne ksenobiotyków do struktury włosa Włosy mają zdolność włączania ksenobiotyków w swoją strukturę. Przyjmuje się, że zawartość substancji w 1 cm odcinku włosa odpowiada dawce około miesięcznej ekspozycji na daną substancję [3,6]. Pomimo szeroko prowadzonych badań mechanizm inkorporacji ksenobiotyków we włosy nie jest w pełni wyjaśniony. Obecnie przyjmuje się trzy modele próbujące wyjaśnić ten proces. Podstawowym sposobem inkorporacji ksenobiotyków we włosach jest model, który zakłada wnikanie substancji chemicznych poprzez bierną lub aktywną dyfuzję z krwi do cebulki włosa, a następnie wiązanie ich z trzonem włosa podczas procesu keratogenezy [8]. Zgodnie z tym modelem zawartość ksenobiotyku we włosach powinna być proporcjonalna do stężenia związku we krwi podczas syntezy komórek [9]. Kolejny model sugeruje wnikanie ksenobiotyków na drodze dyfuzji z potu, łoju czy innych płynów obmywających włosy już po ich wzroście [10]. Przyjmuje się również, możliwość przenikania substancji bezpośrednio ze środowiska, głównie podczas przechodzenia do wnętrza korzenia przez łuskę włosa [11]. Najbardziej prawdopodobna wydaje się być kombinacja współdziałania ze sobą tych trzech mechanizmów [3,8,12]. Niezależnie od mechanizmu, inkorporacja ksenobiotyków do włosów podlega farmakokinetycznym zasadom dystrybucji. Lipofilowe cząsteczki organiczne łatwo przenikają przez błony biologiczne i ulegają rozproszeniu w zależności od gradientu ich stężeń. Natomiast cząsteczki lub jony hydrofilowe o średniej masie cząsteczkowej nie przechodzą przez membrany [3]. Generalnie przyjmuje się, że związki o charakterze zasadowym znacznie łatwiej i w większym stopniu wbudowują się w strukturę włosa niż związki o charakterze obojętnym czy kwasowym [12]. Na przykład heroina oraz jej metabolit 6- monoacetylomorfina (6-MAM) są trudne do wykrycia w moczu czy krwi, ale mogą być diagnozowane we włosach. Trudność wykrywania heroiny i 6-MAM wynika także w dużym stopniu z bardzo krótkiego biologicznego okresu półtrwania w płynach biologicznych (poniżej 5 minut). Również metamfetamina, która w roztworze wodnym ma charakter zasadowy, wnika we włosy znacznie łatwiej niż inna pochodna amfetaminy o charakterze kwasowym - acetyloamfetamina. Podobnie fencyklidyna (PCP) czy 3,4- metylenodioksymetamfetamina (MDMA) łatwiej inkorporują we włosy niż związek o charakterze kwasowym - tetrahydrokannabinol [9]. Po etapie inkorporacji, podczas procesu okluzji i keratynizacji ksenobiotyki są stopniowo zatrzymywane w łodydze i przemieszczają się w trakcie wzrostu włosa. Proces ten powoduje, że skład łodygi włosa, nawet po jego wydostaniu się ponad powierzchnię skóry, nie ulega zmianie [13]. Dodatkowym czynnikiem wpływającym na inkorporację narkotyków jest zawartość melaniny we włosach. Analiza włosów siwych, niezawierających pigmentu, wskazuje na około dziesięciokrotnie niższe stężenie narkotyku niż w przypadku włosów zawierających melaninę, mimo jednakowego narażenia i takiego samego stężenia substancji we krwi osób badanych [13,14]. Wykazano również różnice w stężeniu danej substancji we włosach w zależności od ich struktury czy porowatości, a także w zależności od stosowanych zabiegów kosmetycznych [9]. Zakres zastosowania badań włosów Ze względu na dużą trwałość i łatwość przechowywania włosy stanowią cenne źródło informacji w badaniach kryminalistycznych, toksykologicznych, a także archeologicznych. Wprowadzenie czułych metod badawczych umożliwiło zastosowanie włosów do analizy nie tylko jakościowej, ale także ilościowej różnych substancji chemicznych, w tym metali toksycznych, pestycydów, pierwiastków promieniotwórczych [6]. Ich analiza pozwala na ocenę w aspekcie stanu zdrowia organizmu człowieka. Może służyć do wykrywania środków psychoaktywnych, leków czy środków dopingujących [6,7]. Badania z użyciem włosów mają szerokie zastosowanie w wykrywaniu narkotyków. Pozwalają bowiem na identyfikację substancji nawet u osób korzystających ze środków odurzających okazjonalnie. Dzięki wynikom analizy można nie tylko potwierdzić zażywanie narkotyków czy zróżnicować pacjentów na osoby uzależnione oraz przyjmujące te środki okazjonalnie. Można także potwierdzić jednorazowe przyjęcie substancji psychoaktywnych, jak to ma np. miejsce w przypadku podania substancji o działaniu obezwładniającym, określanych potocznie pigułką gwałtu [15,16]. Przykładem takiej substancji jest kwas γ- hydroksymasłowy (GHB), który szybko wchłania się do krwioobiegu i ma zdolność do przenikania przez barierę krew-mózg. GHB można wykryć we krwi i w moczu odpowiednio w ciągu 8 i 12 godzin od przyjęcia. W zawiązku z wykorzystywaniem tej substancji w celu przestępczym zabezpieczenie materiału biologicznego i wykonanie badania w tak krótkim czasie po podaniu zazwyczaj nie jest możliwe. W takim przypadku włosy są dogodnym materiałem do badań. Określa się, że maksymalna długość włosów, która kwalifikuje je do badań wynosi 24 cm, co odpowiada okresowi retrospekcji do około 2 lat. Po upływie tego czasu istnieje ryzyko otwarcia się łusek włosów i wypłukania substancji wbudowanych w ich strukturę [16,17]. Włosy mogą być także wykorzystywane jako materiał do badań pośmiertnych. Sekcja zwłok może dostarczyć informacji na temat przyczyny zgonu. Badanie krwi na obecność leków czy narkotyków dostarcza informacji o potencjalnym nadużyciu w niewielkim odstępie czasu przed zgonem, natomiast analiza włosa obrazuje używanie substancji przez dłuższy okres czasu. Analiza włosów może także dostarczyć dowodów w celu ochrony osób nieletnich weryfikując ich narażenie. Uzyskanie pozytywnego wyniku badania włosów lub smółki pobranych od noworodków potwierdza nadużywanie środków psychoaktywnych przez matkę w czasie ciąży. Ponadto, z uwagi na fakt, że leki czy narkotyki ulegają transferowi do mleka, dzieci karmione piersią mogą być narażone na działanie substancji psychoaktywnych obecnych w organizmie matki [18]. W tkankach włosa można oznaczyć endogenne steroidy anaboliczne, takie jak testosteron czy dehydroepiandrosteron, jak i steroidy pochodzenia egzogennego stanozolol, mesterolon [19,20]. Są to substancje, które często są używane jako środki dopingujące. Ponadto możliwe jest oznaczanie metali. Analiza pierwiastków o znaczeniu fizjologicznym uściśla niedobory dietetyczne organizmu. Natomiast stężenie metali ciężkich we włosach, stosuje się w celu oceny jakości środowiska życia [6,10,21]. Pobieranie i przygotowanie próbek włosów do badań Analiza włosów jest procesem wieloetapowym obejmującym: pobieranie próbek, następnie dekontaminację (oczyszczanie), homogenizację (uzyskanie jednorodnej próbki), ekstrakcję (wyizolowanie substancji oznaczanej z matrycy włosa), oczyszcze- 550 J. Margasińska-Olejak i wsp.

nie izolatu oraz analizę jakościową i ilościową. Proces kończy się interpretacją uzyskanych wyników [22]. 1. Pobieranie próbek włosów: Pobieranie włosów jest procesem prawie nieinwazyjnym. Nie wymaga zastosowania szczególnych warunków. Może być przeprowadzony w obecności świadków, nie wprowadza stanu skrępowania, co może mieć miejsce w przypadku pobierania próbek moczu, a także krwi. Podczas pobierania próbek włosów ograniczone jest ryzyko zafałszowania czy zamiany materiału. Pobieranie próbek włosów nie musi być wykonywane przez lekarza, natomiast ważne jest, aby dokonywała tego osoba odpowiednio przeszkolona [23]. Włosy nie wymagają przechowywania w szczególnych warunkach, np. w obniżonej temperaturze i mogą być przechowywane przez czas nieokreślony [22]. Naczelną organizacją, która zajmuje się analizą włosów, jest The Society of Hair Testing (SoHT) założone w 1995 r. Stowarzyszenie to publikuje szereg dokumentów zawierających wskazówki dotyczące pobierania, przechowywania, obróbki wstępnej i analizy włosów [18]. Zgodnie z rekomendacjami SoHT zestaw do pobierania materiału biologicznego musi zawierać instrukcję pobierania materiału, kopertę do zabezpieczania materiału, opakowanie zbiorcze oraz wymagane formularze. Próbki włosów powinny być odcięte z tylnego wierzchołka głowy, jak najbliżej skóry, gdyż jest to region o najmniejszej zmienności tempa wzrostu włosów. Preferowane jest pobieranie próbek z głowy, jednak w przypadku gdy nie jest możliwe pobranie ich z tej okolicy, możliwe jest skorzystanie z miejsc alternatywnych, takich jak włosy łonowe czy z okolicy pach. Zaleca się, aby próbka włosów wynosiła od 50 do 150 mg (ilość tą określa się jako kosmyk odpowiadający grubości ołówka). Należy dokładnie zanotować kolor, długość włosów i miejsce, z którego zostały pobrane oraz zaznaczyć część dystalną (końcówka włosów) próbki. W przypadkach pobierania włosów od denatów czynność tą wykonuje się na początku sekcji zwłok. Próbki włosów, które są mokre, przed przechowywaniem i analizą muszą zostać wysuszone. Suche włosy przechowuje się w ciemności, w temperaturze pokojowej. Przechowywanie oraz transport próbek bądź ekstraktów powinien odbywać w sposób, który zminimalizuje możliwość zanieczyszczenia czy utratę analitu [18,24]. 2. Przygotowanie próbek do analizy: Po pobraniu włosy poddaje się czynnościom obejmującym oczyszczenie, segmentację (opcjonalnie) oraz utworzenie z pobranego materiału właściwej próbki do badań [18]. W przypadku wykorzystania włosów w celu identyfikacji substancji psychoaktywnych głównym ograniczeniem analizy są zanieczyszczenia zewnętrzne. Istnieje możliwość, że substancja została biernie zaadsorbowana z otoczenia zewnętrznego, co skutkuje uzyskaniem fałszywie dodatniego wyniku. Dodatkowo obecność pozostałości produktów kosmetycznych, pyłu, a także wydzielin (np. pot, łój) może utrudnić analizę. W związku z powyższym możliwość zanieczyszczenia musi być uwzględniana w czasie analizy, a także podczas interpretacji wyników. Dekontaminacja próbki polega na użyciu rozpuszczalnika organicznego w celu usunięcia zanieczyszczeń lipofilnych, takich jak woski, a następnie płukanie roztworem wodnym [23]. W miarę możliwości rozpuszczalniki stosowane podczas tego procesu powinny usuwać zanieczyszczenia zgromadzone na powierzchni włosa, nie wpływając przy tym na substancje zawarte wewnątrz [22]. Przyjmuje się, że rozpuszczalniki organiczne (np. chlorek metylenu, aceton) skuteczniej usuwają zanieczyszczenia z powierzchni włosa, natomiast roztwory wodne czy metanol umożliwiają wyodrębnienie substancji z macierzy włosa. Laboratorium wykonujące badania musi posiadać opracowaną procedurę mycia włosów przed analizą, powinno się także określić, w jakim stopniu stosowana metoda usuwa zanieczyszczenia z powierzchni. Próbki mocno zabrudzone płynami ustrojowymi często wymagają dodatkowych procesów oczyszczania [18]. W celu oczyszczania próbki można stosować rozpuszczalniki protonowe, takie jak np. bufor fosforanowy i alkohole (etanol, metanol), które sprzyjają ekstrakcji ksenobiotyków z wnętrza włosa na skutek jego pęcznienia. Aprotonowe rozpuszczalniki (dichlorometan, aceton) nie powodują pęcznienia, a więc nadają się do oczyszczenia powierzchni włosów z niechcianych substancji, które mogą fałszować wynik analizy [19,20]. Całkowity proces oczyszczania obejmuje serię płukań przy użyciu różnych rozpuszczalników. Najczęściej stosuje się procedury polegające na jedno- lub dwukrotnym przemyciu rozpuszczalnikiem aprotonowym. Jednorazowe i krótkie przemycia stosuje się w przypadku rozpuszczalników protonowych. Do dekontaminacji stosować można również szampon do mycia włosów, którego użycie wskazane jest do oznaczania m.in. amfetaminy, kannabinoidów czy benzodiazepin [20,21]. W praktyce w procedurze oczyszczania najczęściej stosuje się aceton, dichlorometan i wodę, które nie powodują wypłukiwania analitu z wnętrza włosa [18,22]. W następnym etapie próbkę włosów tnie się na małe fragmenty o długości 1-3 mm lub rozdrabnia na jednorodny proszek. Sproszkowanie ułatwia procedurę ekstrakcji polepszając penetrację rozpuszczalnika. Etap ekstrakcji polega na długotrwałej (5-18 godzinnej) inkubacji próbki w metanolu w łaźni ultradźwiękowej. Metanol wnikając do wnętrza włosa powoduje jego obrzęk i uwolnienie substancji poprzez dyfuzję. Zastosowanie ultradźwięków ma na celu zmniejszenie wielkości cząstek, jak również zmiany w strukturze włosów, co podnosi efektywność procesu ekstrakcji [22]. Metody oznaczania substancji psychoaktywnych we włosach Oznaczanie ksenobiotyków we włosach jest możliwe przy zastosowaniu odpowiedniej procedury przygotowania próbki oraz użyciu właściwych metod analitycznych. Najczęściej wykorzystywaną metodą są techniki chromatograficzne, szczególnie wskazane w przypadku analizy opiatów, kokainy, amfetaminy, marihuany i benzodiazepin. Metody chromatograficzne często stosuje się w połączeniu ze spektrometrią mas (MS). Przykładem może być chromatografia gazowa sprzężona z spektrometrią mas (GC-MS), wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (HPLC-MS). W ostatnich latach stosuje się również sprzężenie chromatografii z tandemową spektrometrią mas (MS/MS) [9,10]. Wady i zalety zastosowania włosów jako materiału do badań Włosy są coraz powszechniej stosowane jako materiał biologiczny w przypadku wykrywania narkotyków w organizmie. Stwierdza się bowiem, że substancje psychoaktywne wbudowane w strukturę włosa charakteryzują się znacznie szerszym oknem detekcji w porównaniu z krwią i moczem [25]. Włosy, jako materiał alternatywny lub materiał do badań uzupełniających pozwoliły na znaczne poszerzenie spektrum badań toksykologicznych. Oznaczanie środków psychoaktywnych we włosach pozwala także na monitorowanie narkomanii w programach rehabilitacyjnych osób uzależnionych [18]. Próbki włosów są gromadzone w trakcie dochodzeń karnych, m.in. w opiniowaniu zgonów związanych z narkotykami, przestępczością narkotykową czy ochroną osób nieletnich [7]. W sprawach sądowego orzekania o byciu pod wpływem narkotyków Zarząd Towarzystwa Society of Hair Testing wydał specjalne zalecenia dotyczące granicy oznaczalności substancji we włosach (Tab. I). Rutynowo jako materiał do analizy toksykologicznej wykorzystywany jest mocz, krew pełna, surowica lub osocze krwi. Badanie pełnej krwi, osocza czy surowicy dostarcza informacji o aktualnym stężeniu danej substancji w organizmie. Natomiast w przypadku analizy materiału, takiego jak mocz oznacza się stężenie składników, które uległy zagęszczeniu po opróżnieniu pęcherza. Stężenie danej substancji w moczu w dużej mierze zależy od ilości przyjętych płynów przez osobę badaną. Prawie nieinwazyjny sposób poboru oraz łatwa dostępność materiału sprawiają, iż mocz stanowi najczęściej stosowany materiał biologiczny. W przypadku analizy środków psychoaktywnych pobieranie moczu powinno być kontrolowane z uwagi na możliwość zafałszowania próbki. Procedura ta może stanowić naruszenie prywatności osoby badanej. Pozyskanie włosów pozawala na ograniczenie problemów etycznych. Zwraca się także uwagę na fakt, że osoby przyjmujące długotrwale substancje psychoaktywne, które przed samym badaniem zachowały abstynencję mogą mieć ujemny wynik zawartości narkotyków w moczu. Podczas analizy włosów natomiast może się zdarzyć w niektórych przypadkach, że pozostaną dodatnie. Analiza włosów jest także przydatna, gdy środki Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 551

Tabela I Zalecane granice oznaczalności dotyczące badania włosów dla najczęściej oznaczanych narkotyków zgodnie z zaleceniami Society of Hair Testing [25]. Recommendations of limit of quantification for the most frequently detected drugs as recomended with Society of Hair Testing [25]. Substancja Metoda immunologiczna Granica oznaczalności Metoda chromatograficzna Opiaty 0,2 ng/mg (dla morfiny i 6-acetylmorfiny) 0,2 ng/mg Kokaina 0,5 ng/mg 0,5 ng/mg dla kokainy 0,05 ng/mg dla pozostałych związków Amfetamina 0,2 ng / mg (dla każdej substancji musi oddzielnie dawać wynik pozytywny: 0,2 ng/mg MDMA, metamfetamina, MDEA lub MDA) Kannabinoidy 0,1 ng/mg (THC) THC: 0,1 ng/mg THC-COOH: 0,2 pg/mg THC Tetrahydrokannabinol; MDMA 3,4-Metylenodioksymetamfetamina; MDEA 3,4-Metylenodioksy-N-etyloamfetamina; MDA 3,4-Metylenodioksyamfetamina. psychoaktywne stosowane są okazjonalnie bądź w niewielkich dawkach. Do innych zalet zastosowania włosów do badań zalicza się prosty i mało inwazyjny sposób ich pobierania, oraz brak ryzyka zakażenia organizmu, jak w przypadku kontaktu z krwią. Włosy, które są materiałem mechanicznie odpornym oraz obojętnym chemicznie nie wymagają specjalnego sposobu przechowywania czy transportu, co znacznie ułatwia te procedury [26]. Oprócz szeregu zalet istnieją również wady analizy włosów. Ze względu na różnice w szybkości wzrostu włosów w zależności od regionu anatomicznego, płci, wieku, pochodzenia etnicznego, a także zmienności międzyosobniczej, interpretacja stężenia różnych substancji we włosach nie jest łatwa. Ponieważ mechanizmy wprowadzania substancji do macierzy włosowej nie są jeszcze w pełni poznane ogranicza to możliwości interpretacji wyników (szczególnie ilościowych, w mniejszym stopniu jakościowych). Ponadto, jeśli brane są pod uwagę także inne źródła pochodzenia ksenobiotyków niż te z krwioobiegu (jak wydzieliny skórne czy zanieczyszczenia zewnętrzne oraz środowiskowe), interpretacja staje się wówczas jeszcze bardziej skomplikowana [27]. Kolejne utrudnienie w analizie włosów stanowi powszechne skażenie środowiska niektórymi substancjami, jak np. nikotyną z uwagi na obecność dymu tytoniowego w powietrzu. Do zafałszowania wyników badań mogą przyczynić się zabiegi kosmetyczne stosowane bezpośrednio na włosach, szczególnie farbowanie i rozjaśnianie [11]. Ponadto brak standaryzacji metod wykorzystywanych do oznaczania tych samych analitów, trudności w akredytacji zgodnej z normą ISO 17025 czy ISO 15189. Wyróżniając wady analizy włosów wskazuje się także na koszty badań, które znacznie przewyższają badanie moczu czy krwi. Ponadto analiza włosów jest procesem pracochłonnymi i skomplikowanym. Nie ma również możliwości wykrycia substancji spożytej bezpośrednio czy krótko przed badaniem. Ograniczone jest ponadto wykrycie danej substancji u osoby, która przyjęła środek jednokrotnie [12]. Dodatkowo zmienne stężenie melaniny, może mieć wpływ na inkorporację środków odurzających w strukturę włosów, a substancje o odczynie obojętnym lub kwaśnym są słabiej adsorbowalne, co może wiązać się z wykryciem ich w znacznie niższym stężeniu [27]. Największym jednak problemem analizy włosów jest brak miarodajnej interpretacji ilościowej. W praktyce na interpretację wyników analizy próbek włosów wpływają zanieczyszczenia zewnętrzne, a zatem interpretacja może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Konieczne jest również opracowanie bardziej czułych i selektywnych metod analitycznych. Przykłady zastosowania analizy włosów w oznaczaniu narkotyków Nieustannie rosnący problem narkomanii na świecie, także i w Polsce, powoduje zaostrzenie zapobiegawczych przepisów prawnych. Badania laboratoryjne umożliwiają wykrywanie środków psychoaktywnych i są wykorzystywane w celu potwierdzenia uzależnienia, a także są podstawą do orzekania sądowego. W tym celu ważne jest opracowanie właściwych procedur, które umożliwią oznaczanie zarówno narkotyków oraz ich metabolitów z użyciem alternatywnych materiałów biologicznych w stosunku do tych powszechnie używanych (krew czy mocz). Wartościowym materiałem w tym wypadku mogą być włosy. Khajuria i Nayak [29] metodą GC-MS analizowali zawartość morfiny we włosach w celu ustalenia okresu czasu, w którym będzie istniała możliwość jej wykrycia we włosach. Próbki do badania pochodziły od 40 osób uzależnionych od opium. Kosmyki włosów zostały pobrane od pacjentów 3-krotnie w okresie badań, tj. w dniu analizy, po 45 dniach oraz po 90 dniach. Granica wykrywalności wynosiła 0,26 ng/ mg. Dla wszystkich próbek uzyskano dodatni wynik, a zakres stężenia morfiny we włosach wynosił od 0,26 ng/mg do 2,3 ng/ mg. Wyniki badań pozwoliły stwierdzić, że morfinę można wykryć co najmniej 90 dni po ostatnim jej przyjęciu [28]. Włosy są odpowiednim materiałem do oznaczania kanabinoidów. Khajuria i Nayak [2] opublikowali wyniki badań z użyciem metody GC MS, które miały na celu określenie długości okresu utrzymywania się Δ9-tetrahydrokanabilolu (THC) w ludzkich włosach. Kosmyki włosów wykorzystywane w badaniach pobrano od 20 osób uzależnionych od konopi. Próbki zostały pobrane w dniu analizy, a także po upływie 45 i 90 dni. Próbki włosów zostały pobrane z różnych części głowy ze względu na zmienną szybkość wzrostu włosów w tych obszarach. Wartość LOD dla THC wynosiła 0,1 ng/mg. Zakres stężeń THC w próbkach włosów mieścił się w zakresie od 0,16-2,3 ng/mg, a obecność THC we włosach stwierdzano we włosach przez co najmniej 90 dni od zażycia [2]. Han i wsp. [29] oznaczyli 11-nor-9- karboksy-δ9-tetrahydrokannabinolu (THC- -COOH) we włosach metodą chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas działającą w ujemnym trybie jonizacji chemicznej (GC MS/MS NCI). Badaniu zostały poddane próbki włosów pobrane od 22 osób i podzielone na segmenty o długości: 0-3 cm, 3-6 cm, 6-9 cm oraz 9-12 cm. W badaniach stwierdzono, że stężenie THC-COOH zmniejszało się od segmentów bliższych do dystalnych w niemal wszystkich fragmentach, co obrazuje spadek stężenia narkotyku wraz z odległością od cebulki włosa. Na podstawie tego stwierdzono, że badane osoby regularnie i w sposób umiarkowany używały preparaty Cannabis [29]. Także Mercolinia i wsp. [30] zajmowali się oznaczaniem THC we włosach. Zastosowali technikę LC-MS/MS, która pozwala nie tylko na oznaczenie THC, ale także THC-COOH. Dzięki oznaczaniu obu substancji jednocześnie możliwe było wykluczenie biernej ekspozycji na kanabinoidy, gdyż THC-COOH wytwarzane jest wyłącznie w organizmie. Włosy zostały pobrane według zaleceń SoHT [16,22] z odcinka tylnego wierzchołka głowy, od osób przewlekle używających kanabinoidy. Wartość granicy oznaczalności LOQ wynosiły 3 pg/ mg dla THC i 1 pg/mg dla THC-COOH, natomiast uzyskane stężenia analitów mieściły się w zakresie od 55 do 100 pg/mg dla THC i od 5 do 10 pg/mg dla THC-CO- OC, co potwierdziło przewlekłe stosowanie THC przez badane osoby [30]. oznaczali stymulanty typu amfetaminowego (ATS) za pomocą metody HPLC z detekcją chemiluminescencyjną. Próbki do badań zostały pobrane od 32 kobiet pochodzących z różnych grup etnicznych. Z informacji uzyskanych 552 J. Margasińska-Olejak i wsp.

od osób badanych wynikało, że zażywały one substancje psychoaktywne dłużej niż tydzień przed pobraniem próbki. Podczas hospitalizacji wykonano badania moczu na obecność stymulantów, jednak większość związków nie została wykryta w moczu. Natomiast zakresy stężeń ATS we włosach osób wynosiły: 0,07-6,73 ng/mg dla metamfetaminy - MA (n=24), 0,18-2,47 ng/mg dla amfetaminy - AP (n=13), 0,05-0,86 ng/ mg dla 3,4- metylenodioksymetamfetaminy - MDMA (n=12), 0,52-1,38 ng/mg 3,4- metylenodioksyamfetaminy - MDA (n=3) i 0,09-1,88 ng/mg dla p-metoksymetamfetaminy - PMMA (n=6). Wartości LOD wynosiły odpowiednio 0,008; 0,027; 0,017; 0,068 i 0,007 ng/mg. Wyniki badań ukazały ponadto wpływ typu włosa na stężenie narkotyków w ich komórkach. Ciemne i grube włosy zawierały wyższe stężenie substancji badanych niż włosy cienkie o jaśniejszej barwie (brązowe lub blond), co potwierdza teorię o wpływie zawartości melaniny na stężenie narkotyku we włosach. Ponadto wskazano, że stosowanie zabiegów kosmetycznych (np. farbowanie lub ondulacja) może mieć wpływ na stężenie ATS we włosach [5]. Dokładny profil zażywania metamfetaminy z wykorzystaniem analizy włosów przedstawili w swojej pracy Han i wsp. [31]. Badania miały wskazać, czy wyniki analizy segmentowej włosów mogą obrazować zażywanie tej substancji psychoaktywnej. Próbki zostały pobrane od 15 osób i poddane analizie przy użyciu metody GC-MS. Badano stężenie amfetaminy (AP) i metamfetaminy (MA) oraz wskaźnik AP/MA w korzeniu włosa, w segmentach o długości 1 cm, w całości włosa oraz w odcinkach o długości 1-4 cm u osób zażywających MA. Dodatnie wyniki badań uzyskano dla wszystkich próbek dla analizy całości włosa, jak i w segmentach. Wyznaczono LOQ dla MA wynoszące 0,5 ng/mg (przy użyciu metody GC-MS). Uzyskane zakresy stężeń dla MA i AP wynosiły odpowiednio 3,00-05,10 ng/mg (średnio 34,53 ng/mg) i 0,05-4,76 ng/mg (średnio 2,42 ng/mg). Wyniki dla próbek utworzonych z całości włosa pozwalały wnioskować o używaniu danej substancji, natomiast wyniki uzyskane dla fragmentów pozwalały na określenie historii zażywania, np. w okresie miesiąca. Dzięki analizie segmentowej zróżnicowano ciągłe stosowanie narkotyku (w przypadku osób badanych, n=10), użycie jednorazowe w ostatnim czasie bez wcześniejszego stosowania (n=3) oraz wcześniejsze zażywanie bez użycia w krótkim okresie czasu przed badaniem (n=2) [31]. W pracy wykorzystano metodę LC-MS/MS do jednoczesnego oznaczenia amfetaminy i opiatów. We włosach osób uzależnionych oznaczono: amfetaminę (AP), metamfetaminę (MA), morfinę (MOR), kodeinę (COD) oraz 6-acetylokodeinę (6-AC). Wszystkie pobrane próbki włosów były w kolorze czarnym, co wykluczyło wpływ stężenia melaniny na wyniki badań. Uzyskane wartości LOD dla posegmentowanych próbek włosów wynosiły: 2 pg/mg dla AP i MA, 8 pg/ mg dla MOR, COD i 6-AC; LOQ 10 pg/ mg dla wszystkich pięciu analitów. Spośród 86 próbek badanych, zaledwie dwie (2,33%), uzyskały wynik ujemny dla wszystkich sześciu substancji. Dodatni wynik uzyskano w n=82 (95,4%), 62 (72,1%) i 61 (70,9%) próbkach odpowiednio dla AP, opiatów i obu kategorii narkotyków [32]. Publikowane wyniki badań wskazują, że analiza włosów jest szczególnie przydatna do kontroli abstynencji [34,35]. Jako jedną z najskuteczniejszych metod leczenia uzależnienia od opioidów stosuje się terapię substytucyjną metadonem. Stanaszek i wsp. [33] w swojej pracy przedstawili znaczenie analizy włosów w monitorowaniu abstynencji u osób objętych programem metadonowym. W próbkach włosów pobranych od 57 pacjentów oznaczono zawartość morfiny, 6-monoacetylomorfiny, kodeiny oraz amfetamin, takich jak efedryna (EP), metkatynon (MKT), parametoksyamfetamin (PMMA), amfetamina (AP), metylenodioksyamfetamina (MDA), metylenodioksymetamfetamina (MDMA), metyleno-dioksyetylo- -amfetamina (MDEA). Oznaczano także środek zastosowany w terapii - metadon (MTD). Analizę alkaloidów opium oraz metadonu przeprowadzono metodą GC- -MS, natomiast analizę amfetamin wyko- Tabela II Narkotyki i poziom ich oznaczalności we włosach. Drugs and the level of their determination in the hair. Substancja Rodzaj zastosowanej analizy instrumentalnej Zakres oznaczanych stężeń LOD /LOQ Piśmiennictwo Morfina GC-MS 0,26-2,3 ng/mg 0,26 ng/mg Khajuria i Nayak [28] 8 pg/mg 0,1 ng/mg GC MS 0,16-2,3 ng/mg THC Khajuria i Nayak [2] LC-MS/MS 55-100 pg/mg 3 pg/mg Mercolinia i wsp. [30] THC-COOH LC-MS/MS 5-10 pg/mg 1 pg/mg Mercolinia i wsp. [30] (GC MS/MS NCI) - - Han i wsp. [29] HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,07-6,73 ng/mg 0,008 ng/mg Metamfetamina GC MS 3,00-5,10 ng/mg 0,5 ng/mg Han i wsp. [31]. 2 pg/mg HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,05-0,86 ng/mg 0,027 ng/mg Amfetamina GC MS 0,05-4,76 ng/mg - Han i wsp. [32] 2 pg/mg MDMA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,05-0,86 ng/mg 0,017 ng/mg MDA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,52-1,38 ng/mg 0,068 ng/mg PMMA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,09-1,88 ng/mg 0,007 ng/mg Kodeina 8 pg/mg 6-Acetylokodeina THC Tetrahydrokannabinol; THC-COOH karboksy-tetrahydrokannabinol; MDMA 3,4-Metylenodioksymetamfetamina; MDA 3,4-Metylenodioksyamfetamina; PMMA 4-metoksymetamfetamina. Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 553

nano przy użyciu LC-MS z wykorzystaniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI). Próbki włosów zostały podzielone na dwucentymetrowe segmenty. Obecność metadonu w próbkach potwierdzała stosowane leczenie. Analizy wykazały, że 4% pacjentów będących w trakcie terapii nie dotrzymywało warunków abstynencji (wynik oznaczeń substancji psychoaktywnych w ich włosach był dodatni). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że segmentowa analiza włosów może być z powodzeniem stosowana w przypadku kontroli abstynencji i przebiegu leczenia u osób objętych np. terapią metadonową [34]. W tabeli II zestawiono omówione techniki wykorzystywane do analizy włosów, a także zakresy oznaczanych stężeń narkotyków i wartości LOD, LOQ. Wnioski Przedstawione opracowanie wskazuje, że włosy są materiałem biologicznym, który może być wykorzystywany w oznaczeniach substancji psychoaktywnych, zwłaszcza jako badanie uzupełniające dla analizy tradycyjnych materiałów biologicznych takich, jak krew czy mocz. Wykorzystanie włosów jako materiału do badań zapewnia ich unikalna budowa umożliwiająca inkorporację środków psychoaktywnych w głąb struktury. Dużą zaletą stosowania włosów jest również łatwy sposób ich pobierania oraz przechowywania. Analiza włosów pozwala na określenie historii zażywania substancji psychoaktywnych, a także w przypadku podziału włosów na określone segmenty, istnieje możliwość ustalenia przybliżonego czasu przyjęcia narkotyku. Można określić regularność zażywania, a także wykazać skuteczność stosowanej terapii uzależnienia. Dzięki analizie włosów możliwe jest wykrycie przyjęcia substancji psychoaktywnej w okresie od tygodnia do nawet 2 lat, co stanowi o długofalowej i retrospektywnej diagnostyce. Niestety analiza włosów niesie za sobą również wiele ograniczeń. Główną wadą stosowania włosów, jako materiału do oznaczeń substancji psychoaktywnych jest możliwość zafałszowania wyniku. Przyczynić się może do tego zanieczyszczenie środowiska, stosowanie kosmetyków czy zabiegi chemiczne stosowane na włosach. Analiza włosów wymaga zastosowania wystandaryzowanych metod i przeprowadzeniu wielu badań. Nie w pełni poznane mechanizmy wprowadzania substancji do macierzy włosowej sprawiają również, że pojawia się także wiele ograniczeń co do możliwości interpretacji wyników. Piśmiennictwo 1. Włodarczyk R: Historia, teraźniejszość i perspektywy kryminalistycznych badań włosów ludzkich. Wydawnictwo Wyższej Szkoły Policji w Szczytnie. 2007; 9-10: 32-33. 2. Khajuria H, Nayak BP: Detection of D9-tetrahydrocannabinol (THC) in hair using GC MS. EJFS 2014; 4: 17-20. 3. Pragst F, Balikowa M: State of the art in hair analysis for detection of drug and alcohol abuse. Clin Chim Acta. 2006; 370: 17-49. 4. Huestis M: Advantages & disadvantages of drug testing in alternative matrices. NIDA Washington - August 5, 2010. 5. Wada M, Sugimoto Y, Crabtree B: Simultaneous determination of amphetamine-type stimulants in abusers hair: clinical usefulness of hair analysis in prehospitalization for abusers. Forensic Toxicol. 2013; 31: 2-8. 6. Wiechuła D, Fischer A, Loska K, Widziewicz K, Górka A: Zinc and lead concentrations in the pubic hair of women living in areas with different contamination degrees. Pol J Environ Stud. 2012; 21: 1875-1880. 7. Baumgartner WA, Jones PT, Black C: Detection of phencyclidine in hair. J Forensic Sci. 1981; 3: 576-581. 8. Kintz P: Value of the concept of minimal detectable dosage in human hair. Forensic Sci Int. 2012; 218: 28-30. 9. Rouen D, Dolan K, Kimber J: A review of drug detection testing and an examination of urine, hair, saliva and sweat. NDARC. 2001; 14-17. http://ndarc.med.unsw.edu.au/sites/default/ files/ndarc/resources/tr.120.pdf [dostęp: 05.01.2018] 10. Kowalczyk P, Manda A, Kościelniak B, Tomasik P, Sztefko K: Nietypowe materiały biologiczne pobierane w sposób nieinwazyjny w diagnostyce laboratoryjnej. Diagn Lab. 2014; 50: 255-262. 11. Łuczak-Zielkiewicz I, Szutowski M: Wartość diagnostyczna włosów. Biul Wydz Farm WUM. 2013; 8: 56-64. 12. Karen S, Robert K, Drug incroporation in hair, in: P. Kintz (ed.), Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair. CRC Press, Boca Raton, USA. 2007; 1 23. 13. Hubbard DL, Wilkins DG, Rollins DE: The incorporation of cocaine and metabolites into hair: effects of dose and hair pigmentation. DMD. 2000; 28: 1464-1469. 14. Rollins DE, Wilkins DG, Krueger GG, Augsburger MP, Mizunol A. et al: The Effect of hair color on the incorporation of codeine into human hair. J Anal Toxicol. 2003; 27: 545-551. 15. Kintz P, Cirimele V, Jamey C, Ludes B: Testing for GHB in hair by GC/MS/MS after a single exposure. Application to document sexual assault. J Forensic Sci. 2003; 48: 1-6. 16. Rossi R, Lancia M, Gambelunghe C, Oliva A Fucci N: Identification of GHB and morphine in hair in a case of drug-facilitated sexual assault. Forensic Sci Int. 2009; 186: 9-11. 17. Bertol E, Argo A, Procaccianti P, Vaianoa F, Di Milia MG. et al: Detection of gamma-hydroxybutyrate in hair: Validation of GC MS and LC MS/MS methods and application to a real case. J Pharm Biomed Anal. 2012; 70: 518-522. 18. Cooper G, Kronstrand R, Kintz P: Society of hair testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci Int. 2012; 218: 20-24. 19. Kintz P, Cirimele V, Dumestre-Toulet V, Ludes B: Doping control for nandrolone using hair analysis. J Pharm Biomed Anal. 2001; 24: 1125-1130. 20. Deshmukh N, Hussain I, Barker J, Petroczi A, Naughton DP: Analysis of anabolic steroids in human hair using LC MS/MS. Steroids. 2010; 75: 710-714. 21. Chojnacka K, Saeid A, Michalak I, Mikulewicz M: Effects of local industry on heavy metals content in human hair. Pol J Environ Stud. 2012; 21: 1563-1570. 22. Vogliardi S, Tucci M, Stocchero G: Sample preparation methods for determination of drugs of abuse in hair samples: A review. Anal Chim Acta. 2015; 857: 1-27. 23. Agius R, Kintz P: Guidelines for European workplace drug and alcohol testing in hair. Drug Test. Analysis. 2010; 2: 367-376. 24. Society of Hair Testing. Recommendations for hair testing in forensic cases. Forensic Sci Int. 2004; 83 84 http://www.soht.org/images/pdf/consensus _on_hair_analysis.pdf [dostęp: 29.11.2017]. 25. Kłys M, Rojek S, Kulikowska J, Bożek E, Ścisłowski M: Usefulness of multi-parameter opiates amphetamines cocainics analysis in hair of drug users for the evaluation of an abuse profile by means of LC APCI-MS-MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007; 854: 299-307. 26. Witkiewicz Z: Podstawy chromatografii. Warszawa: Wydawnictwo Naukowo Techniczne. 2000; 11-16, 19-21, 153-160, 220-225. 27. Wennig R: Potential problems with the interpretation of hair analysis results. Forensic Sci Int. 2000; 107: 5-12. 28. Khajuria H, Nayak BP: Detection of drug of abuse (morphine) in hair. Res J Forensic Sci. 2013; 1: 18-20. 29. Han E, Chung H, Song J: Segmental hair analysis for 11-Nor-D9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid and the patterns of cannabis use. J Anal Toxicol. 2012; 36: 195-200. 30. Mercolinia L, Mandrioli R, Protti M, Contic M, Serpellonid G. et al: Monitoring of chronic cannabis abuse: An LC MS/MS method for hair analysis. J Pharm Biomed Anal. 2013; 76: 119-125. 31. Han E, Yang H, Ilung S: Segmental hair analysis and estimation of methamphetamine use pattern. Int J Legal Med. 2013; 127: 405-411. 32. Liu H, Liu R, Lin D.L: Simultaneous quantitation of amphetamines and opiates in human hair by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J Anal Toxicol. 2015; 39: 183-191. 33. Fucci N, De Giovanni N: Methadone in hair and sweat from patients in long-term maintenance therapy. Ther Drug Monit. 2007; 29: 452-454. 34. Stanaszek R, Piekoszewski W, Karakiewicz B, Kozielec T: Analiza włosów w kontroli abstynencji pacjentów programu metadonowego. Probl Forensic Sci. 2002; 50: 17-34. 554 J. Margasińska-Olejak i wsp.