UNIWERSYTET MEDYCZNY w Lublinie WYDZIAŁ FARMACEUTYCZNY Z ODDZIAŁEM ANALITYKI MEDYCZNEJ Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej ul. dr W. Chodźki 1, 20-093 Lublin; tel. (fax) 81-448-71-00 Lublin, 18.02.2019 r. RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Marii Miklasińskiej-Majdanik pt. Ocena przeciwbakteryjnego potencjału związków polifenolowych i ich oddziaływań z wybranymi antybiotykami wobec klinicznych szczepów Staphylococcus aureus wykonanej w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii i Wirusologii, Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach pod kierunkiem Pana prof. dr hab. n. med. Tomasza J. Wąsika oraz promotora pomocniczego Pani dr n. biol. Małgorzaty Kępy. W skład recenzowanej pracy doktorskiej wchodzą trzy publikacje z listy A czasopism punktowanych MNiSW, w tym dwie prace oryginalne i jedna przeglądowa, o łącznym współczynniku IF równym 7,589. Są to prace: 1. Miklasińska M, Kępa M, Wojtyczka RD, Idzik D, Dziedzic A, Wąsik TJ. Catechin hydrate augments antibacterial action of selected antibiotics against Staphylococcus aureus clinical strains. Molecules 2016, 21, 244 (Punkty MNISW: 30; IF = 2,861). 2. Kępa M, Miklasińska-Majdanik M, Wojtyczka RD, Idzik D, Korzeniowki K, Smoleń- Dzirba J, Wąsik TJ. Antimicrobial potential of caffeic acid against Staphylococcus aureus clinical strains. Biomed Res Int 2018, Article ID 7413504, 9 pages (Punkty MNISW: 25; IF = 2,583). 3. Miklasińska-Majdanik M, Kępa M, Wojtyczka RD, Idzik D, Wąsik TJ. Phenolic compounds diminish antibiotic resistance of Staphylococcus aureus clinical strains. Int J Environ Res Public Health 2018, 15, 2321 (Punkty MNISW: 25; IF = 2,145). Głównym kierunkiem zawartych w pracy doktorskiej zainteresowań badawczych Pani mgr Marii Miklasińskiej-Majdanik jest poszukiwanie wśród związków naturalnych takich, które wykazałyby aktywność przeciwbakteryjną wobec gronkowców z gatunku S. aureus lub działały synergistycznie ze stosowanymi już w lecznictwie antybiotykami 1
przeciwgronkowcowymi. W tym celu Doktorantka przebadała dwa związki polifenolowe: hydrat katechiny i kwas kawowy. Związki pochodzenia naturalnego były przez długi czas jedynymi lekami dostępnymi dla człowieka i nadal odgrywają dużą rolę zwłaszcza w domowej aptece. Z uwagi na wyczerpywanie się aktualnych możliwości leczenia wielu poważnych zakażeń bakteryjnych, w tym gronkowcowych, spowodowane wielolekoopornością szczepów klinicznych, obecnie trwają poszukiwania leków o nieznanych do tej pory mechanizmach działania i interesującej budowie chemicznej. Związki pochodzenia naturalnego stanowią źródło różnorodnych struktur chemicznych i często wykazujących aktywność biologiczną. Tworzą grupę strukturalnie uprzywilejowaną w procesie łączenia się z określonymi enzymami, receptorami, lub innymi miejscami wiążącymi, wykazując wysokie powinowactwo do struktur znajdujących się w różnych organizmach żywych, włączając tu mikroorganizmy. W ciągu ostatnich 10 lat polifenole roślinne zwróciły uwagę naukowców z powodu swoich licznych, korzystnych właściwości prozdrowotnych. Powszechnie znane jest ich działanie antyoksydacyjne, przeciwzapalne, przeciwmiażdżycowe, przeciwalergiczne, przeciwobrzękowe i przeciwmutagenne. Pewne prace wskazują również na zdolność substancji pochodzenia roślinnego do modulacji funkcjonowania układu odpornościowego człowieka, przez wpływ na proliferację komórek układu immunologicznego oraz wytwarzanie cytokin czy innych czynników biorących udział w reakcjach obronnych. Mimo, że najlepiej poznane wydają się własności antyoksydacyjne polifenoli roślinnych, wiadomo również, że związki te, często wytwarzane przez rośliny w odpowiedzi na zakażenie, wykazują także aktywność przeciwdrobnoustrojową. Potwierdzoną aktywność przeciwbakteryjną przypisuje się zwłaszcza flawanolom, flawonolom oraz kwasom fenolowym, których najsilniejsze działanie biologiczne wynika ze zdolności hamowania enzymów i toksyn bakteryjnych, oddziaływania z błoną komórkową czy hamowania tworzenia biofilmu bakteryjnego. Wyniki przedstawionej do recenzji rozprawy doktorskej Pani mgr Marii Miklasińskiej- Majdanik z powodzeniem wpisują się w działania naukowe o globalnym znaczeniu związane z ogromnym wyzwaniem, jakim jest dla współczesnych nauk farmaceutycznych, stawienie czoła problemowi narastającej lekooporności wśród drobnoustrojów. Przestawione prace poprzedzone są krótkim, 32 stronicowym syntetycznym opisem badań. Autorka przedstawiła cel pracy oraz otrzymane wyniki dyskutując je w oparciu o dostępną literaturę. W pracy nie umieszczono rozdziału Materiały i Metody, ale uważam, że bez szkody dla całości, gdyż najważniejsze informacje o zastosowanych metodach zostały wplecione w paragraf z Wynikami, a szczegóły można znaleźć w przedstawionych publikacjach. Całość poprzedzona jest spisem treści i wykazem skrótów, a kończy się streszczeniem w języku polskim i angielskim. Na siedmiu stronach Wprowadzenia Autorka krótko opisuje rozwój lekooporności wśród szczepów z rodzaju Staphylococcus spp. ze szczególnym uwzględnieniem gatunku S. 2
aureus oraz jego chorobotwórczości dla człowieka. W następnych podrozdziałach rozwinięte zostały tematy poszukiwań przez badaczy alternatywnych substancji o działaniu przeciwdrobnoustrojowym oraz opis odkryć związanych aktywnością przeciwbakteryjną różnych klas związków polifenolowych, szczególnie wobec szczepów S. aureus, które zostały szczegółowo przedstawione w publikacji nr 3 wchodzącej w cykl rozprawy doktorskiej. Dlatego myślę, że logicznym byłoby tę publikację umieścić jako pierwszą w cyklu, nie patrząc na kolejność czasową publikacji wszystkich artykułów. Pośrednim celem pracy była izolacja i charakterystyka klinicznych szczepów S. aureus, które zostały użyte do badań obok trzech szczepów referencyjnych. Doktorantka izolowała szczepy z wymazów z ran od pacjentów przebywających w szpitalach oraz przeprowadziła ich identyfikację metodami tradycyjnymi, opartymi o cechy fenotypowe, potwierdzając ją genetycznie, przy zastosowaniu trawienia dwoma enzymami restrykcyjnymi genu dnaj, kodującego białko szoku termicznego. Dzięki określeniu wzoru oporności wiadomo było, że większość klinicznych szczepów włączonych do badań charakteryzowała metycylinooporność, a prawie połowa miała oporność typu MLS B. Wyniki identyfikacji szczepów S. aureus na podstawie cech fenotypowych i wzorów restrykcyjnych produktu fragmentu genu dnaj zostały przedstawione w dodatkowej tabeli i na dwóch rycinach. Należy podkreślić, że włączenie klinicznych, lekoopornych szczepów S. aureus do badań znacząco podnosi wartość otrzymanych wyników i nadaje im znaczenie praktyczne. Lekowrażliwość oraz mechanizmy oporności u badanych szczepów były oznaczane metodami rekomendowanymi przez The European Committee on Animicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), zarówno fenotypowo i genetycznie, jak w przypadku metycylinooporności bakterii. Aktywności przeciwbakteryjne dwóch związków polifenolowych wobec szczepów S. aureus również badano referencyjną, ilościową metodą rozcieńczeń w podłożu płynnym pozwalającą na oznaczenie minimalnej wartości hamującej wzrost bakterii dla nowo poznanych i badanych związków. Wyniki badania wpływu hydratu katechiny i kwasu kawowego na wrażliwość badanych gronkowców na antybiotyki uzyskane przez Doktorantkę wskazują zdecydowanie na zróżnicowanie szczepowe wśród gronkowców, ale co ważne najczęściej zróżnicowanie niezależne od profilu lekooporności. Do oceny istotności różnic w wartościach MIC antybiotyków uzyskanych dla szczepów hodowanych na podłożach suplementowanych związkami polifenolowymi i bez dodatku polifenoli Doktorantka zastosowała odpowiednie testy statystyczne. We Wnioskach kończących pracę Autorka zwraca uwagę na najważniejsze wyniki uzyskane w pracy. Podkreśla silniejsze działanie przeciwgronkowcowe kwasu kawowego w porównaniu z hydratem katechiny, jak również jego silniejsze działanie skojarzone z erytromycyną, klindamycyną i cefoksytyną niezależne od oporności na metycylinę i antybiotyki MLS B u badanych szczepów S. aureus. 3
Badania własne Doktorantka zaplanowała dobrze i systematycznie zrealizowała, a uzyskane wyniki omówione są w sposób prawidłowy. Piśmiennictwo jest dobrane odpowiednio i liczy 92 pozycje, w przeważającej części pochodzące z ostatnich lat. Jest to głównie literatura fachowa, anglojęzyczna, publikowana w znanych, liczących się czasopismach. Jej wykorzystanie w pracy, zarówno we wstępie, jak i w dyskusji, świadczy o umiejętności korzystania z zasobów piśmiennictwa naukowego oraz o dobrym tematycznym rozeznaniu. Literatura numerowana jest zgodnie z kolejnością pojawiania się w tekście. Do pracy dołączone są oświadczenia współautorów, z których jednoznacznie wynika, iż udział Doktorantki w powstawaniu prac jest wiodący. Autorka podkreśla, iż prace powstały w oparciu o opracowane przez Nią koncepcje badań, wykonanie części doświadczalnej i analizę i interpretację uzyskanych danych. Czytając przedłożoną do oceny pracę doktorską nasunęły mi się następujące pytania i uwagi, które mogą stanowić przedmiot dyskusji: 1. Jakie przesłanki zdecydowały o zastosowaniu przez Doktorantkę tej konkretnej wartości stężenia polifenoli w badaniach ich oddziaływań z wybranymi antybiotykami, tzn. 1/4 wartości MIC danego szczepu, dlaczego nie 1/2 czy 1/8? Czy wartość ta została wyznaczona doświadczalnie? 2. Na jakiej podstawie oceniano synergizm działania związków polifenolowych i antybiotyków? Czy jedynym kryterium była istotność statystyczna różnic wartości MIC w grupach? 3. Czy w związku z dużym zróżnicowaniem szczepowym występującym w wynikach określających wpływ jednego stężenia polifenoli na aktywność badanych antybiotyków nie byłoby zasadne oznaczanie współczynnika FIC (fractional inhibitory concentration), który pozwoliłby na jednoznaczne określenie synergistycznego, addytywnego, obojętnego czy antagonistycznego działania dwu badanych związków? Pragnę podkreślić, iż wartość merytoryczna niniejszej rozprawy doktorskiej jest wysoka. Pani mgr Maria Miklasińska-Majdanik skutecznie opanowała umiejętność planowania, a następnie sukcesywnej realizacji badań naukowych. Wykazała dobre zrozumienie zagadnień teoretycznych z zakresu tematu, znajomość zastosowanych metod badawczych oraz potrafi podsumować i krytycznie omówić wyniki własne w odniesieniu do publikacji innych autorów. Doktorantka wykorzystała doświadczenia własne, oraz bardzo dobrego zespołu badawczego, co stanowi gwarancję rzetelności i poprawności uzyskanych wyników badań. Podjęcie przez Doktorantkę niniejszego tematu badawczego uważam za uzasadnione i niezwykle ważne zarówno pod względem poznawczym jak i praktycznym, wpisujące się w 4
ogólnoświatowy trend poszukiwań nowych alternatywnych związków przeciwbakteryjnych, co jest szczególnie ważne w dobie narastającej oporności bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki, zwłaszcza wśród patogenów szpitalnych należących do grupy tzw. patogenów alarmowych. Podsumowując stwierdzam, że cele pracy zostały zrealizowane, a osiągnięte wyniki stanowią istotny wkład w rozwój dziedziny. O dużej wartości wykonanych badań świadczy opublikowanie wyników w postaci dobrej jakości artykułów w renomowanych czasopismach o wysokim współczynniku oddziaływania, o czym wspomniałam na wstępie recenzji. Wnioski końcowe Przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska spełnia wymogi formalne i merytoryczne stawiane w ustawie o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (z dn. 14 marca 2003 r. z późniejszymi zmianami). Na tej podstawie wnioskuję do Wysokiej Rady Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o przyjęcie niniejszej rozprawy i dopuszczenie mgr Marii Miklasińskiej-Majdanik do dalszych etapów przewodu doktorskiego. dr hab. n. farm. Izabela Korona-Głowniak 5