MUTACJE spontaniczne indukowane germinalne somatyczne genomowe chromosomowe genowe euploidie aneuploidie - delecje substytucje - nullisomie - duplikacje -monosomie - trisomie - tetrasomie - inwersje -translokacje -chr. Koliste insercje delecje -izochromosomy MUTACJE GENOMOWE- EUPLOIDIE Euploidia- zmiana ilości genomu Genom haploidalny (n) diploidalny (2n) triploidalny (3n) Przyczyny polispermia zaburzony proces mejozy endomitoza MUTACJE GENOMOWE- ANEUPLOIDIE Aneuploidia- zmiana liczby chromosomów w pojedynczych parach nullisomie- brak danej pary chromosomów monosomie- brak jednego chromosomu z pary trisomie- dodatkowy chromosom z danej pary tetrasomie powielona para chromosomów Przyczyny zaburzony proces mejozy- nondysjunkcje 1
2n=46 (XX) Diagnozowana u 20% samoistnych poronień 3n=69 (XXX) 2n=45 (X0) z. Turnera 1 na 2500 żywo urodzonych dzieci płci żeńskiej 1 na 800 żywo urodzonych dzieci płci męskiej 2n=47 (XXY) z. Klinefeltera 2
2n=47 (XX)+21 z. Downa 1 na 680 żywo urodzonych dzieci; niski poziom α-fetoproteiny w surowicy matki oznacza zwiększone ryzyko wystąpienia trisomii 21 wiek matki=20 wystąpienie trisomii 21=1na 1420 wiek matki=45 wystąpienie trisomii 21=1na 30 wiek matki=20 wystąpienie aberracji chromosomowych o znaczeniu klinicznym to 1 na 500 wiek matki=45 wystąpienie aberracji chromosomowych o znaczeniu klinicznym to 1 na 20 3
2n=46 (XX) z. Cri du Chat MUTACJE CHROMOSOMOWE- DUPLIKACJE Duplikacja- zwielokrotnienie fragmentu chromosomu Przyczyny niezrównoważony crossing over 2n=46 (XY) Duplikacje często odpowiadają za cechy przystosowawcze!!! MUTACJE CHROMOSOMOWE- INWERSJE Inwersje- pęknięcie i odwrócenie fragmentu chromosomu wraz ze zmianą biegunowości nici Przyczyny pęknięcie chromosomu i nieprawidłowe połączenie 4
MUTACJE CHROMOSOMOWE- INWERSJE Inwersje paracentryczne- w obrębie ramion chromosomu Inwersje pericentryczne w obrębie centromeru W obu przypadkach wystąpienie inwersji umożliwia zajście crossing over między chromosomami homologicznymi skutkującego duplikacją jednego końca i delecji dwóch przeciwległych końców każdej z chromatyd niesiostrzanych ( w obu koniugujących chromosomach) MUTACJE CHROMOSOMOWE- TRANSLOKACJE Translokacja- przemieszczenie się fragmentu chromosomu w obrębie danej pary chromosomów homologicznych lub przeniesienie odcinków pomiędzy chromosomami niehomologicznymi 5
2n=45 (XX) (15;22); (13;14) translokacje Robertsonowskie normalny t. Rob 1,29 chromosom1 Chromosom 29 Translokacja 1,29 normalny translokacja trisomia 1 monosomia 1 trisomia 29 monosomia 29 cielęta żywe martwe płody 6
MUTACJE CHROMOSOMOWE- CHROMOSOMY KOLISTE I IZOCHROMOSOMY Podstawowe techniki barwienia chromosomów Barwienie konwencjonalne barwnik Giemsy (łączy się z ujemnymi resztami fosforanowymi) w miarę równomiernie na całej powierzchni chromosomu) Barwienia różnicowe Prążki G (GTG),HRBT (wskutek trawienia enzymami proteolitycznymi miejscowa utrata powinowactwa do barwika Giemsy ) białka dodatnie blokują ujemne grupy fosforanowe DNA prążek negatywny (C-G), pozytywny A-T Prążki R- negatyw G. Dodany BrdU (analog tymidyny) powoduje utratę powinowactwa par A-T do oranżu akrydyny; euchromatyna prążek pozytywny, heterochromatyna negatywny Prążki C (CBG)- obróbka w HCl, Ba(OH) 2 i SSC niszczy euchromatynę. Heterochromatyna łączy się z barwnikiem Giemsy dając prążki pozytywne. 7
Etap badania Konstytucyjny Hematoonkologiczny Materiał badany tylko żywa tkanka! krew,skóra płyn owodniowy szpik kostny, krew, tkanka stała, płyn mózgowo-rdzeniowy, skóra (wykluczenie aberracji konstytutywnej) Hodowla in vitro 72h, stymulacja limfocytów T w celu uzyskania chromosomów prometafazalnych różny czas hodowli (bp, 24h, 72h) niestymulowana, ze stymulacją czynnikiem wzrostu określonych linii komórkowych (granulocyty, limfocyty T i/lub B) Przygotowanie preparatów Analiza prążków G (barwienie GTG) chromosomów metafazalnych utrwalonych na szkiełkach cytologicznych Aberracje chromosomowe 10-15 metafaz 30 w przypadku mozaicyzmu odziedziczone / de novo 20-30 metafaz klonalne somatyczne / de novo (nowotwory wrodzone) Chromosomy w późnej metafazie NIE barwią się różnicująco! Są zbyt silnie skondensowane Kariotyp krowy 2n = 60. PŁYTKA METAFAZOWA WCZESNA PROFAZA 8
zając; prążki C Sus scrofa 2n=38 Ovis aries 2n=54 Bos taurus 2n=60 Kariotyp- uporządkowany zestaw chromosomów danego osobnika 2,5-3,5 x10 12 Chromosomy człowieka: schemat (idiogram/ideogram; obraz rzeczywisty 9
HYBRYDY http://francisthemulenews.wordpress.com Fluorescent in situ Hybridization (FISH) Hybrydyzacja specyficznych sond z DNA Interfaza lub metafaza Na płytce(in situ) sonda Fluorescent in situ Hybridization (FISH) Identyfikacja i charakterystyka mutacji liczbowych i strukturalnych Wykrywanie mikrodelecji Wykrywanie aberracji subtelomerowych Diagnostyka prenatalna aneuploidii (interfaza) 10
Sondy centromerowe specyficzne dla chromosomu Hybrydyzują do regionu centromeru Wykrywają aneuploidie w interfazie i metafazie Sondy malujące (chromosomy) Hybrydyzują do całych chromosomów lub ich regionów Pokazują zmiany strukturalne w komórkach metafazowych Sondy do unikalnych sekwencji DNA Hybrydyzują do unikalnych sekwencji DNA Wykrywają przegrupowania genów, delecje i duplikacje SKY Badanie techniką FISH BCR-ABL1 t(4;9;22) t(9;22),+der(22)t(9;22) BCR ABL1 fuzja der(9) Ph Ph der(9) der(4) 11
acgh- array Comparative Genomic Hybridization Porównawcza hybrydyzacja genomowa metoda pozwala na detekcję różnic w ilości kopii DNA pomiędzy kontrolnym (referencyjnym) i badanym 180 tys.- 1mln punktów pomiarowych możliwa jest analiza genomu z jednej komórki pobranej z pięciodniowego blastocytu amplifikacja materiału genetycznego z jednej komórki następuje przy użyciu metody MDA (Multiple Displacement Amplification) Badania prenatalne- PGS Preimplantation Genetic Screening 12