POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA TOM 37 2010 NR 1 (167 186) PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA: OBIECUJ CA PERSPEKTYWA CZY Z UDNA NADZIEJA? PROANGIOGENIC CELL THERAPY: HYPE OR HOPE? Anna GROCHOT-PRZÊCZEK, Krzysztof SZADE, Jerzy KOTLINOWSKI, Alicja JÓZKOWICZ, Józef DULAK Zak³ad Biotechnologii Medycznej, Wydzia³ Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersyt Jagielloñski, Kraków Streszczenie: Udowodnienie istnienia komórek progenitorowych œródb³onka EPC (ang. endothelial progenitor cells) i ich udzia³u w postnatalnym powstawaniu naczyñ krwionoœnych znacz¹co wp³ynê³o na perspektywê mo liwoœci zastosowania terapeutycznej angiogenezy w leczeniu chorób uk³adu kr¹ enia oraz innych schorzeñ zale nych od unaczynienia tkanki. Pocz¹tkowe badania dotycz¹ce komórek EPC wyraÿnie sugerowa³y, e zastosowanie ich w klinice mo e przynieœæ poprawê jakoœci ycia wielu chorym niekwalifikuj¹cym siê do rewaskularyzacyjnych zabiegów operacyjnych. Jednak podjête póÿniej pierwsze próby kliniczne terapii komórkowej z wykorzystaniem komórek EPC mocno zweryfikowa³y tê hipotezê, nie zachwycaj¹c wynikami terapeutycznymi. Dodatkowo, brak œciœle ustalonych markerów pozwalaj¹cych jednoznacznie zidentyfikowaæ tê populacjê komórkow¹ oraz brak wystarczaj¹cych danych o molekularnych mechanizmach funkcjonowania EPC utrudnia badania dotycz¹ce proangiogennej terapii komórkowej. Jednak mimo tych trudnoœci, prace nad zastosowaniem tej strategii w chorobach uk³adu kr¹ enia postêpuj¹ w ogromnym tempie, a nowe odkrycia w tej dziedzinie budz¹ du e nadzieje. S³owa kluczowe: proangiogenna terapia komórkowa, komórki progenitorowe œródb³onka, angiogeneza, waskulogeneza. Summary: The discovery of endothelial progenitor cells (EPCs) and demonstration of their participation in postnatal new blood vessel formation accelerated their application for therapeutic angiogenesis in cardiovascular diseases and vascularity-dependent disorders treatment. First experiments done on EPCs *Praca wspó³finansowana z grantu MNiSW nr N301 08032/3156. Alicja Józkowicz jest beneficjentem The Wellcome Trust International Senior Research Fellowship in Biomedical Science. Wydzia³ Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii jest beneficjentem projektów Biotechnologia Molekularna dla Zdrowia (POIG.02.01.00-12-064/08) i Jagielloñskie Centrum Rozwoju Leków (POIG 02.02.00-00-014/08) wspó³finansowanych przez Uniê Europejsk¹ ze œrodków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka.

168 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK suggested that usage of these cells in clinic may improve the quality of life of the patients not curable with standard revascularizing surgery. However, the clinical trials of cell therapy with EPCs were not as fruitful as expected. In addition, lack of specified antigens helpful in EPCs population identification and lack of data concerning molecular mechanisms of EPCs function hamper the research on proangiogenic cell therapy. But despite these difficulties, researchers keep hardworking on the strategy of therapeutic angiogenesis and the new discoveries seem to be promising. Key words: proangogenic cell therapy, endothelial progenitor cells, angiogenesis, vasculogenesis. WASKULOGENEZA I ANGIOGENEZA Powstawanie naczyñ krwionoœnych jest kluczowe dla rozwoju organizmu i dla prawid³owego przebiegu procesów naprawczych, na przyk³ad gojenia ran skóry. Odgrywa równie rolê w niektórych procesach fizjologicznych w dojrza³ym organizmie, takich jak: oogeneza, przerost b³ony œluzowej macicy w cyklu miesiêcznym czy wzrost w³osów. Proces tworzenia kapilar mo e odbywaæ siê w drodze waskulogenezy lub angiogenezy. Wyró nia siê równie arteriogenezê, ale zjawisko to jest w istocie dojrzewaniem drobnych naczyñ krwionoœnych. Waskulogeneza polega na tworzeniu kapilar z prymitywnych komórek macierzystych, np. angioblastów lub komórek progenitorowych œródb³onka (EPC) (ryc. 1) [65]. Angiogeneza natomiast jest procesem powstawania naczyñ krwionoœnych z naczyñ ju istniej¹cych. Polega na migracji i proliferacji dojrza³ych, w pe³ni zró nicowanych komórek œródb³onka, które zostaj¹ pobudzone ze stanu spoczynkowego na skutek dzia³ania rozmaitych czynników [22]. Spoœród wielu mediatorów, czynnik wzrostu œródb³onka naczyñ VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) oraz czynnik pochodzenia stromalnego-1 SDF-1 (ang. stromal cell-derived factor-1) s¹ EPC SDF-1, VEGF, angiopoyna-1, G-CSF RYCINA 1. Mobilizacja i homing komórek EPC. Komórki progenitorowe œródb³onka mobilizowane s¹ do krwi pod wp³ywem gradientu czynników SDF-1, VEGF, angiopoyny-1, G-CSF. Z pr¹dem krwi docieraj¹ do miejsc uszkodzenia tkanki (ang. homing), gdzie uczestnicz¹ w tworzeniu naczyñ krwionoœnych FIGURE 1. EPCs mobilization and homing. EPCs are mobilized into peripheral blood by a gradient of SDF-1, VEGF, angiopoiin-1 and G-CSF factors niew¹tpliwie jednymi z najwa - niejszych [17, 21]. Do niedawna uwa ano, e unaczynienie postnatalne jest wy³¹cznie wynikiem angiogenezy. Badania ostatnich lat wskazuj¹ jednak, e za powstawanie naczyñ w procesach naprawczych odpowiedzialne s¹ równie komórki EPC, które mobilizowane s¹ do krwi na przyk³ad ze szpiku kostnego, po czym docieraj¹ do uszkodzonej lub niedotlenionej tkanki, gdzie stymuluj¹ powstawanie kapilar [4, 5, 79].

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 169 NIEEMBRIONALNE KOMÓRKI PROGENITOROWE ŒRÓDB ONKA W 1997 roku Asahara i jego wspó³pracownicy opublikowali w czasopiœmie Science pracê, w której po raz pierwszy pokazali, ze ludzka krew zawiera komórki frakcji leukocytarnej zdolne in vitro ró nicowaæ do komórek œródb³onka [5]. Do izolacji tych komórek wykorzystano dwa antygeny: CD34 oraz VEGFR-2, które ulegaj¹ ekspresji w hematopoycznych komórkach macierzystych, jak równie w komórkach œródb³onka. Wyodrêbniona w ten sposób populacja, po kilku dniach hodowli w warunkach ró nicuj¹cych do œródb³onka, wykazywa³a ekspresjê CD31, E-selektyny, œródb³onkowej syntazy tlenku azotu (enos), Tie-2 oraz zdolnoœæ internalizacji acylowanych cz¹stek LDL, czyli cechy charakterystyczne dla œródb³onka. W kolejnym eksperymencie wyizolowano tego typu komórki z krwi myszy z nadekspresj¹ b-galaktozydazy i nastêpnie podano je do ylnie do myszy z podwi¹zan¹ têtnic¹ udow¹ i niedotlenion¹ koñczyn¹ tyln¹. Stwierdzono inkorporacjê komórek b-gal + CD31 + w powsta³ych naczyniach krwionoœnych, udowadniaj¹c tym samych ich udzia³ w postnatalnej waskulogenezie [5]. Kolejne prace tego samego zespo³u wskazywa³y na znacz¹cy udzia³ komórek EPC uwalnianych ze szpiku kostnego w tworzeniu naczyñ krwionoœnych w modelach zarówno fizjologicznej, jak i patologicznej neowaskularyzacji: gojeniu ran, przeroœcie endomrium i unaczynieniu cia³ka ó³tego po indukowanej owulacji, niedokrwieniu koñczyny tylnej, zawale serca i wzroœcie nowotworu [4]. W tych doœwiadczeniach wykorzystane zosta³y myszy transgeniczne wykazuj¹ce konstytutywn¹ ekspresjê b-galaktozydazy pod kontrol¹ promotorów specyficznych dla œródb³onka: Tie-2 lub VEGFR-2. Zwierzêta typu dzikiego z defektywnym uk³adem odpornoœci poddano radiacyjnej mieloablacji i przeszczepiono szpik od myszy transgenicznych. Zaobserwowano, e niedotlenienie tkanki wywo³uje wzrost liczby EPC we krwi obwodowej. Dodatkowo wykazano obecnoœæ komórek b-gal + w powsta³ych strukturach naczyniowych [4]. Eksperymenty te by³y kamieniem milowym w potencjalnym zastosowaniu terapeutycznej angiogenezy w leczeniu chorób uk³adu kr¹ enia u ludzi. EPC CZYM S I SK D POCHODZ Najczêœciej EPC definiuje siê jako komórki krwi obwodowej lub pochodz¹ce ze szpiku kostnego komórki jednoj¹drzaste, przylegaj¹ce do bia³ek macierzy pozakomórkowej (np. fibronektyny) oraz poch³aniaj¹ce acylowane cz¹stki LDL i wi¹ ¹ce izolektynê. Dodatkowo komórki te powinny wykazywaæ ekspresjê markerów œródb³onkowych [5]. Niesty jak dot¹d nie zidentyfikowano antygenu, który ulega³by ekspresji wy³¹cznie na komórkach EPC, co zdecydowanie u³atwi³oby identyfikacjê tej populacji komórkowej. Ludzkie EPC charakteryzuje ekspresja CD133 i c-kit, która zanika w czasie ró nicowania. Ponadto, podobnie jak dojrza³e ludzkie œródb³onki, ludzkie EPC wykazuj¹ ekspresjê CD34, VE-kadheryny, VEGFR-2, CD146, CXCR4,

170A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK vwf, CD31, wychwytuj¹ modyfikowane cz¹steczki LDL i wi¹ ¹ izolektynê Ulex europaeus. Markery mysich EPC w du ej mierze pokrywaj¹ siê z ludzkimi, z pewnymi wyj¹tkami: mysie EPC wi¹ ¹ izolektynê BS1 Griffonia simplicifolia (wi¹zanie lektyny Ulex europaeus jest specyficzne dla komórek ludzkich), maj¹ ekspresjê Sca-1 i nie maj¹ antygenów hematopoycznych. Obecnoœæ antygenu CD133 (prominina) nie jest jednoznacznie potwierdzona, a CD34 rzadko wykorzystuje siê do identyfikacji tej populacji. Dojrza³e mysie komórki œródb³onka trac¹ ekspresjê Sca-1 i c-kit [63] (tab. 1). Jin Hur i wspó³pracownicy w pracy z 2004 roku po raz pierwszy zwrócili uwagê na herogennoœæ EPC, wskazuj¹c, e zespo³y badawcze badaj¹ce komórki EPC pracuj¹ na okreœlanych w ten sam sposób, ale de facto ró nych subpopulacjach komórkowych [33]. Ró norodnoœæ ta wynika z wielu przyczyn: ró nych Ÿróde³ izolacji komórek i markerów wykorzystywanych do identyfikacji populacji oraz niejednako-wych warunków hodowli. Analizuj¹c poszczególne prace dotycz¹ce EPC oraz wyniki w³asnych eksperymentów trzeba mieæ na uwadze wieloœæ populacji EPC, na których pracuj¹ naukowcy. Jednym z przyk³adów subpopulacji EPC izolowanych z komórek jednoj¹drzastych s¹ tzw. wczesne i póÿne komórki EPC o zupe³nie odmiennych w³aœciwoœciach [33]. Wczesne EPC, o wrzecionowatym kszta³cie, najintensywniej proliferuj¹ pomiêdzy 2. i 3. tygodniem od izolacji i s¹ w stanie prze yæ do 4 tygodni. Natomiast póÿne EPC, o kszta³cie charakterystycznej dla œródb³onka kostki brukowej, pojawiaj¹ siê dopiero oko³o 2 3 tygodnia, wykazuj¹ eksponencjalny wzrost pomiêdzy 4. a 8. tygodniem od izolacji i prze ywaj¹ w hodowli in vitro do 12 tygodni. Te dwie subpopulacje EPC wykazuj¹ ró n¹ ekspresjê markerów VE-kadheryny, receptorów 1 i 2 dla VEGF oraz CD45. PóŸne EPC produkuj¹ wiêcej NO, lepiej inkorporuj¹ w struktury tworzone przez dojrza³e komórki œródb³onka oraz efektywniej tworz¹ tuby na matri elu. Wczesne EPC wydzielaj¹ wiêksze iloœci proangiogennych TABELA 1. Zestawienie antygenów i w³aœciwoœci komórek progenitorowych œródb³onka, dojrza³ych œródb³onków i komórek hematopoycznych TABLE 1. Antigens and features of EPCs, mature endothelial cells and hematopoiic cells Komórki progenitorowe Dojrza³e komórki œródb³onka Komórki hematopoyczne œródb³onkowe Mysz + + Sca-1, c-kit, VEGFR-2, - - Sca-1, c-kit, VEGFR-2, CD31 +, VEGFR-1, VE-kadheryna +, Tie 2, VE-kadheryna + +, Tie 2, CD146, CD34 + +, c-kit, vwf, CXCR4 + +, CD146, vwf, vwf + +, CD31, wychwyt wychwyt acylowanych D 31, wychwyt acylowanych LDL, LDL, wi¹zanie lektyn BS1 acylowanych LDL, wi¹zanie lektyny BS1 lub Ulex europeaus wi¹zanie lektyny BS1, D133 + +, CD34 Cz³owiek CD133 + +, CD34, c-kit, CD133 -, c-kit, CD34, + VE-kadheryna, VEGFR-2 +, VE-kadheryna, VEGFR-2, CD146 + +, CXCR4, vwf, D 31, wychwyt a cylowanych LDL, wi¹zanie izolektyny Ulex europeaus CD146 + +, CXCR4, vwf, + CD31, wychwyt a cylowanych LDL, wi¹zanie izolektyny Ulex europeaus

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 171 czynników: VEGF i IL-8, natomiast in vivo obie subpopulacje wykazuj¹ podobny potencja³ waskulogenny [33]. Yoder i wsp. zwrócili uwagê na inne dwa typy komórek, oba nazywane komórkami progenitorowymi œródb³onka, ale izolowane w ró ny sposób [94]. Wychodz¹c z tego samego Ÿród³a komórek jednoj¹drzastych krwi obwodowej otrzymali dwie absolutnie ró ne populacje. W wiêkszoœci badañ, do identyfikacji ludzkich EPC z krwi obwodowej stosuje siê markery CD34, CD133 i VEGFR-2 oraz test tworzenia kolonii. Kryteria te nie s¹ wystarczaj¹ce. Populacjê tzw. CFU-EC (ang. colony forming unit-endothelial cell), uzyskiwan¹ przez negatywn¹ selekcjê komórek jednoj¹drzastych na fibronektynie, charakteryzuje wysoka ekspresja markerów œródb³onkowych oraz hematopoycznych. Drug¹ subpopulacj¹ EPC s¹ komórki ECFC (ang. endothelial colony-forming cells), które izoluje siê prowadz¹c pozytywn¹ selekcjê na kolagenie I. ECFC nie wykazuj¹ ekspresji antygenów hematopoycznych CD45, CD14 i CD115, natomiast prawie 100% komórek eksprymuje markery œródb³onkowe. Okazuje siê, e te dwie populacje komórek, niesty w nomenklaturze okreœlane tym samym terminem EPC, maj¹ zupe³nie inne w³aœciwoœci. Jak dowodz¹ autorzy, CFU-EC wywodz¹ siê z komórek hematopoycznych, maj¹ aktywnoœæ progenitorów mieloidalnych, ró nicuj¹ w fagocytuj¹ce makrofagi i nie tworz¹ funkcjonalnych naczyñ krwionoœnych in vivo. W przeciwieñstwie do CFU-EC, ECFC wykazuj¹ du y potencja³ proliferacyjny i co najwa niejsze tworz¹ in vivo w pe³ni perfundowane naczynia krwionoœne [94]. Pochodzenie komórek EPC nie jest jednoznacznie okreœlone. Do tej pory zidentyfikowano kilka populacji, z których mo na je otrzymaæ. Jedn¹ z nich s¹ komórki szpikowe, gdzie pierwotnymi prekursorami EPC s¹ prawdopodobnie hemangioblasty. Istnienie wspólnych prekursorów EPC i komórek hematopoycznych utrudnia rozró nienie i rozdzielenie tych dwóch populacji, które maj¹ ekspresjê antygenów CD31, VEGFR1, CD34, c-kit, vwf, CD146, zdolnoœæ wychwytu acylowanych LDL i wi¹zania izolektyny [63] (tab. 1). Dlatego populacja komórek, okreœlana terminem EPC nie jest jednoznacznie zdefiniowana; jest to z pewnoœci¹ populacja herogenna, która zawiera komórki o fenotypie œródb³onkowym, ale równie hematopoycznym. Ró norodnoœæ antygenów ulegaj¹cych ekspresji w EPC mo e byæ naw wiêksza, gdy te komórki mog¹ wywodziæ siê równie z monocytów CD14 + [87], mieloidalnych lub mezenchymalnych komórek macierzystych i osiad³ych w tkance komórek macierzystych [74, 88]. EPC W NEOWASKULARYZACJI Komórki progenitorowe œródb³onka s¹ mobilizowane ze swoich nisz, na przyk³ad ze szpiku kostnego, w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki. Kr¹ ¹c we krwi docieraj¹ do miejsc ischemicznych i mog¹ stymulowaæ powstawanie naczyñ de novo, czyli w drodze waskulogenezy (ryc. 2) [11]. Prawdopodobne jest jednak, e dochodzi tak e do w³¹czania siê progenitorów w istniej¹ce struktury naczyniowe (ryc. 2). Znaczenie tego zjawiska nie jest dobrze poznane ocenia siê, na podstawie

172 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK RYCINA 2. EPC w neowaskularyzacji: Komórki progenitorowe œródb³onka mog¹ stymulowaæ neowaskularyzacjê w trzech ró nych procesach. Tworzenie przez EPC naczyñ krwionoœnych de novo to waskulogeneza, w której komórki progenitorowe ró nicuj¹ w dojrza³e œródb³onki w miejscu uszkodzenia tkanki. Drugim sposobem jest inkorporacja EPC w istniej¹ce struktury naczyniowe, na zasadzie uzupe³niania miejsc z uszkodzonym œródb³onkiem. Okreœla siê, e trzecia mo liwoœæ zjawisko parakrynnej stymulacji dojrza³ych komórek œródb³onka przez EPC jest najistotniejsza i wystêpuje najczêœciej FIGURE 2. EPCs in neovascularization. EPCs can participate in neovascularization in three different ways. Vasculogenesis is a process of blood vessel formation de novo. In this process EPCs differentiate into mature endothelial cells at site of injury. The second way is an incorporation into existing vasculature, where EPCs fill the gaps with damaged endothelium. Finally, EPCs can paracrinely stimulate mature, fully differentiated endothelial cells - this process is believed to be the most common and important wbudowywania znakowanych progenitorów w œcianê naczyñ, e udzia³ EPC w nowopowsta³ych kapilarach wynosi od 0 do 80% [5, 25, 87]. O ywion¹ dyskusjê wzbudzi³a niedawno praca zespo³u P. Salvena, w której pokazano, e powstawanie struktur naczyniowych w nowotworach nie anga uje, ani nie wymaga komórek pochodzenia szpikowego, zró nicowanych do œródb³onka [61]. Wyniki te zosta³y potwierdzone równie przez inny zespó³ [90]. Wyniki tych prac s¹ sprzeczne z wczeœniejszymi doniesieniami dotycz¹cymi udzia³u EPC w postnatalnej neowaskularyzacji [44]. W³aœciwie w¹tpliwoœci te pozostaj¹ wci¹ niewyjaœnione ostatecznie. Rola EPC w neowaskularyzacji mo e polegaæ równie na parakrynnej stymulacji komórek œródb³onka ju istniej¹cych kapilar, gdy EPC produkuj¹ du e iloœci czynników wzrostowych, takich jak: VEGF oraz zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bfgf), czynnik wzrostowy hepatocytów (HGF), interleukina-8 (IL-8), p³ytkopochodny czynnik wzrostu-bb (PDGF-BB) czy czynnik chemotaktyczny monocytów (MCP-1) [29, 86] (ryc. 2). Wydaje siê, e ten sposób stymulacji powstawania naczyñ krwionoœnych jest dominuj¹cy. Niedawno ukaza³y siê prace demonstruj¹ce skutecznoœæ pobudzenia neowaskularyzacji in vivo przy zastosowaniu po ywek kondycjonowanych znad komórek progenitorowych œródb³onka [7, 18]. W obliczu trudnoœci z uzyskaniem du ej liczby komórek do przeszczepienia, ewentualnych zagro eñ zwi¹zanych z wprowadzeniem komórek EPC do organizmu oraz technicznych aspektów terapii komórkowej, strategia podania pacjentom mieszaniny czynników wzrostowych produkowanych przez EPC mo e okazaæ siê lepszym rozwi¹zaniem.

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 173 Komórki prekursorowe EPC mobilizowane s¹ do krwi przez uwolnione w niedotlenionej tkance cytokiny, takie jak: VEGF, SDF-1, angiopoyna 1 czy czynnik stymuluj¹cy tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) [3]. Proces mobilizacji EPC mo e byæ jednak zaburzony w stanach chorobowych, bowiem u pacjentów z chorobami uk³adu kr¹ enia liczba EPC we krwi jest obni ona [30, 89]. Uzasadnione jest wiêc przypuszczenie, e po ¹dany efekt terapeutyczny mo na osi¹gn¹æ przez stosowanie terapii komórkowej wykorzystuj¹cej komórki lub po ywki kondycjonowane. ROLA WASKULOGENEZY W STANACH PATOLOGICZNYCH Wiele procesów patologicznych zwi¹zanych jest ze z³¹ kondycj¹ naczyñ krwionoœnych lub niedostatecznym ukrwieniem tkanki. Upoœledzone gojenie ran w cukrzycy, choroba wieñcowa i niedokrwienna nóg to przyk³ady niekorzystnych zjawisk, w których g³ównym czynnikiem warunkuj¹cym chorobê jest os³abienie funkcji œródb³onka i zahamowana waskularyzacja, a bezpoœredni¹ przyczyn¹ dysfunkcji œródb³onka ischemia [9]. Dlatego najlepsz¹ strategi¹ leczenia tego typu chorób wydaje siê byæ pobudzenie angiogenezy i waskulogenezy. Wiele badañ wskazuje na korzystne dzia³anie EPC w regeneracji niedotlenionej tkanki [39, 42]. Ponadto okazuje siê, e podanie EPC do uszkodzonej tkanki silniej stymuluje rewaskularyzacjê ni podanie dojrza³ych komórek œródb³onka [47, 88]. Cukrzyca jest jednym ze schorzeñ silnie wp³ywaj¹cych na stan naczyñ krwionoœnych. NajgroŸniejsze powik³ania cukrzycy wynikaj¹ z dysfunkcji œródb³onka, prowadz¹cej do nefropatii, rinopatii, chronicznych, niegoj¹cych siê owrzodzeñ, rozwoju mia d ycy i zawa³u serca [51]. Przyczyn¹ upoœledzenia funkcji tych komórek w cukrzycy jest przewlek³a hiperglikemia, a w konsekwencji chroniczny stres oksydacyjny, który powoduje apoptozê dojrza³ych komórek œródb³onka [15]. W zdrowym organizmie w przypadku uszkodzenia naczyñ krwionoœnych jednym z mechanizmów naprawczych jest uwolnienie ze szpiku komórek EPC, które uczestnicz¹ w neowaskularyzacji. Ostatnie badania wskazuj¹ jednak, e przewlek³y stres oksydacyjny powoduje dysfunkcjê równie i tych komórek. Schatteman i wsp. oraz Tamarat i wsp. wykazali zmniejszenie liczby i upoœledzenie ró nicowania in vitro komórek EPC izolowanych od myszy z cukrzyc¹ wyindukowan¹ streptozotocyn¹ [73, 80]. Podobne doœwiadczenia na komórkach izolowanych od pacjentów z cukrzyc¹ typu I wykaza³y zmniejszenie liczby EPC oraz iloœci proangiogennych czynników przez nie produkowanych [51]. Równie komórki EPC pochodz¹ce od pacjentów z cukrzyc¹ typu II wykazywa³y upoœledzon¹ proliferacjê, adhezjê i inkorporacjê w teœcie formowania tubul na matri elu [84]. W ostatnio opublikowanej pracy Kang i wsp. wykazali u myszy z wywo³an¹ streptozotocyn¹ cukrzyc¹ os³abion¹ mobilizacjê komórek progenitorowych œródb³onka w odpowiedzi na niedotlenienie koñczyny tylnej. Efekt ten powodowa³ opóÿnion¹ rewaskularyzacjê ischemicznych miêœni [41].

174 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK Upoœledzenie funkcji EPC wynikaæ mo e z utraty przez te komórki potencja³u antyoksydacyjnego. Okazuje siê bowiem, e EPC wykazuj¹ wysok¹ ekspresjê enzymów antyoksydacyjnych, takich jak: katalaza [16], peroksydaza glutationowa (GPx-1) [24] oraz manganowa dysmutaza anionu ponadtlenkowego (MnSOD) [28], dziêki czemu s¹ oporne na stres oksydacyjny. Tymczasem eksperymentalne wy³¹czenie genu Sod2 czy Gpx-1 w znacz¹cym stopniu upoœledza ywotnoœæ komórek, czyni¹c je bardziej wra liwymi na dzia³anie stresu oksydacyjnego [24, 28]. Ponadto okazuje siê, e zmiany takie mog¹ powodowaæ spadek potencja³u waskulogennego EPC, co obserwuje siê u myszy z wy³¹czonym genem Gpx-1 [24]. Mo liwe, e poci¹gaj¹ za sob¹ równie upoœledzenie wytwarzania przez EPC czynników wzrostowych. Nale y jednak pamiêtaæ, e istnieje wiele innych genów, które w istotny sposób reguluj¹ funkcjê komórek progenitorowych œródb³onka (tab. 2). W przysz³oœci byæ mo e dobrym rozwi¹zaniem oka e siê po³¹czona terapia komórkowa i genowa autologiczne komórki izolowane od pacjentów z chorobami uk³adu kr¹ enia mog¹ byæ transdukowane ex vivo genami o funkcjach antyoksydacyjnych, a nastêpnie podawane choremu. Mo liwoœæ taka jest obecnie testowana przez nasz zespó³. MONOCYTY O W ASNOŒCIACH ANGIOGENNYCH Kilka lat po odkryciu EPC przez zespó³ Jeffreya Isnera [5], badacze zaczêli zwracaæ uwagê na podobieñstwo fenotypowe tych komórek do monocytów. Zaczê³a wtedy ewoluowaæ koncepcja istnienia komórek uk³adu odpornoœciowego zdolnych do uczestniczenia w powstawaniu naczyñ krwionoœnych. Dwie prace z 2003 roku jako pierwsze pokaza³y, e EPC wywodz¹ siê z komórek monocytarnych oraz e maj¹ ich cechy [64, 88]. PóŸniejsze doœwiadczenia zmieni³y nieznacznie tê koncepcjê; coraz czêœciej mówi³o siê po prostu o komórkach monocytarnych, które udaj¹ komórki progenitorowe œródb³onka. Hipoteza ta wywodzi³a siê w³aœciwie od obserwacji, e EPC in vitro nie proliferowa³y, a jest to cecha charakterystyczna dla monocytów [64]. Gdy porównywano ekspresjê markerów œródb³onkowych, hematopoycznych oraz progenitorowych w monocytach przed i po hodowli w medium ró nicuj¹cym do œródb³onka, zaobserwowano, e indukcja ró nicowania monocytów do œródb³onka powoduje utratê CD14 i CD45. Ponadto, niezró nicowane pierwotne monocyty wykazuj¹ ekspresjê wiêkszoœci genów œródb³onkowych naw na poziomie wy szym, ni domniemane EPC. Wprawdzie ani œwie e, ani hodowane monocyty nie wykazywa³y zdolnoœci tworzenia tubul na matri elu, to ich obecnoœæ by³a w hodowli CFU-EC niezbêdna dla pozytywnego wyniku tego testu [66]. Autorzy pracy podsumowuj¹, e powszechnie akceptowane cechy identyfikuj¹ce EPC (takie jak wychwytywanie acylowanych cz¹stek LDL, wi¹zanie izolektyny, ekspresja CD31, CD105, CD144) s¹ równie charakterystyczne dla monocytów. To prowadziæ mo e czêsto do uznania komórek uk³adu odpornoœciowego za progenitory œródb³onkowe [66]. Nale y jednak pamiêtaæ, e ze wzglêdu na wieloœæ hodowanych populacji i ró norodnoœæ warunków izolacji i hodowli EPC, stopieñ pochodzenia tych komórek od monocytów oraz mimikry

175 PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA progenitorowych komórek funkcjê genów reguluj¹cych wybranych Zestawienie TABELA 2. œródb³onka function EPCs regulating 2.Genes TABLE en G C EP funkcjê p³yw na W o Piœmiennictw aspaza-8 K g homin migracja; i adhezja kolonii, tworzenie krwionoœnych naczyñ tworzenie i o viv in [72] Scharner alikreina K a aktywacj i igracja m ] [78 Stone gamma I3K P, migracja prze ywalnoœæ, proliferacja, naczyniowe w struktury inkorporacja [54] Madeddu NOS e a obilizacj m ] [2 Aicher Flk-1-PI3K-Akt- Szlak HDAC3-p53-p21 ró nicowanie i roliferacja p ] [95 Zeng GF H y angiogenn potencja³ migracja, roliferacja, p ] [76 Song MP-9 M, matri elu na tubul i kolonii tworzenie mobilizacja migracja, adhezja, [32] Huang MP-2 M a mobilizacj roliferacja, p ] [13 Cheng nsod M y oksydacyjn stres na dpornoœæ o ] [28 He Px-1 G, oksydacyjny stres na odpornoœæ migracja, krwionoœnych naczyñ worzenie t o viv in [24] Galasso atalaza K a migracj rze ywalnoœæ, p ] [16 Dernbach O-1 H a reendotelializacj obilizacja, m ] [50 Lin 66ShcA p æ rze ywalnoœ p ] [19 Stefano Di sfingozynowa inaza K e ó nicowani r ] [10 Bonder PPAR zlak S d - -PI3K Akt migracja, prze ywalnoœæ, proliferacja, matri elu na tubul formowanie [27] Han agged-1 J e ó nicowani r ] [48 Kwon -selektyna E, homing migracja, adhezja, naczyniowe w struktury inkorporacja [59]; Oh [58] Nishiwaki II ngiotensyna A O N produkcja prze ywalnoœæ, dhezja, a ] [93 Yin IF-1a H, homing migracja, proliferacja, ró nicowanie, NO VEGF, produkcja [36] Jiang kt-foxo3a A e dojrzewani ó nicowanie, r ] [56 Mogi d1 I e ó nicowani r ] [14 Ciarrocchi phb4 E y angiogenn potencja³ dhezja, a ] [23 Foubert rec2 chemokine XC C g homin dhezja, a ] [31 Hristov CAM/CD18 I g homin angiogenny, potencja³ dhezja, a ] [92 Wu GFb1 T k bia³e produkcja prze ywalnoœæ, proliferacja, zewn¹trzkomórkowej macierzy [69] Sales aweolina K g homin obilizacja, m ] [70 Sbaa DAC-HoxA9 H e ó nicowani r ] [68 Rössig

176 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK monocytarno-œródb³onkowej jest zmienny. Wiele prac, w tym równie nasze niepublikowane wyniki badañ, wykazuj¹ istnienie stosunkowo wysokiej bazalnej proliferacji komórek EPC, co mo e œwiadczyæ o braku charakteru monocytarnego tej populacji. Z drugiej strony, niedawno ukaza³a siê praca, w której wykazano, e monocyty eksprymuj¹ce CD31 i F4/80 mog¹ byæ rekrutowane do miejsc uszkodzenia tkanki, gdzie bezpoœrednio bior¹ udzia³ w neowaskularyzacji [45]. Dotychczasowe dywagacje na temat mimikry monocytarno-œródb³onkowej dotyczy³y cech œródb³onkowych posiadanych przez monocyty. Raemer i wspó³pracownicy spojrzeli na to zagadnienie z innej perspektywy [62]. Zadali pytanie, czy komórki EPC maj¹ funkcje immunologiczne. Okazuje siê, e EPC, tak jak komórki uk³adu odpornoœciowego, wykazuj¹ zdolnoœæ prezentacji antygenów na poziomie podobnym do monocytów i du o silniejsz¹ ni dojrza³e komórki œródb³onka. Potrafi¹ równie kostymulowaæ naiwne komórki T [62]. To implikuje, e mo na je uwa aæ za profesjonalne komórki prezentuj¹ce antygeny. Jak zaznaczaj¹ autorzy pracy, fakt ten ma ogromne znaczenie w œwile potencjalnego zastosowania terapeutycznego EPC. W przypadku transplantacji organów, mo e mieæ to pozytywny wp³yw, poniewa zast¹pienie obcych komórek œródb³onka obecnych w przeszczepionym narz¹dzie przez autologiczne komórki EPC mo e zahamowaæ lub spowolniæ immunologiczn¹ reakcjê przeszczepu. Mo na natomiast spodziewaæ siê odpowiedzi immunologicznej ze strony tych komórek z chwil¹ powstania stanu zapalnego w narz¹dzie. Z drugiej strony, komórki EPC maj¹ce w³asnoœci stymuluj¹ce uk³ad odpornoœciowy osiadaj¹ce w miejscach uszkodzenia naczyñ krwionoœnych mog¹ nasilaæ na przyk³ad procesy mia d ycowe [62]. Bez wzglêdu na faktyczne pochodzenie komórek progenitorowych œródb³onka oraz ekspresjê markerów, odpowiednie warunki izolacji i hodowli mog¹ zaowocowaæ odnalezieniem populacji o bardzo dobrych w³asnoœciach terapeutycznych. Najwa niejsz¹ w medycynie regeneracyjnej jest odpowiednia funkcja in vivo tych komórek, a nie ekspresja wybranych markerów. To, w jaki sposób komórki progenitorowe uczestnicz¹ w powstawaniu naczyñ krwionoœnych, jest równie kwesti¹ o mniejszym znaczeniu. Bez wzglêdu na to, czy bêdzie to waskulogeneza de novo, inkorporacja w istniej¹ce struktury naczyniowe czy parakrynna stymulacja neowaskularyzacji, jeœli efekt leczniczy jest osi¹gniêty w bezpieczny sposób, mo emy mówiæ o sukcesie zastosowania EPC w terapeutycznej angiogenezie. EPC W KLINICE Odkrycie komórek progenitorowych œródb³onka otworzy³o ogromne pole badañ dotycz¹cych potencjalnych mo liwoœci ich terapeutycznego wykorzystania. Próby kliniczne z wykorzystaniem komórek szpikowych spowodowane by³y w pierwszej kolejnoœci wynikami pracy opublikowanej w roku 2001, w której wykazano korzystny efekt podania izolowanych ze szpiku angioblastów w zawale serca u szczura [47]. Druga praca sugerowa³a, e progenitory szpikowe stymuluj¹ regeneracjê miêœnia

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 177 sercowego po zawale na skutek ró nicowania siê komórek szpikowych do kardiomiocytów [60]. Wyniki tej pracy poddane zosta³y surowej krytyce, w szczególnoœci przez Charlesa Murry'a, który sugerowa³, e obserwowane po podaniu komórek szpikowych nowe kardiomiocyty to artefakt, a przyczyn¹ poprawy funkcji serca de facto by³o nasilenie angiogenezy [57]. Nale y zaznaczyæ, e w dotychczas przeprowadzonych próbach klinicznych wykorzystywano ró ne populacje komórek. Jak wiadomo, komórki progenitorowe œródb³onka s¹ pewn¹ subpopulacj¹ komórek jednoj¹drzastych tmnc (ang. total mononuclear cells) izolowanych z krwi lub szpiku [34]. W ró nych przeprowadzonych próbach klinicznych wykorzystywano zarówno nieselekcjonowane komórki jednoj¹drzaste, jak równie tylko czêœæ spoœród tej populacji charakteryzuj¹c¹ siê ekspresj¹ danego markera [75]. W przypadku stosowania tylko pewnej subpopulacji spoœród wszystkich komórek jednoj¹drzastych, selekcjonowanymi komórkami, by³y te, które wykazywa³y ekspresjê markerów CD34 [52] lub CD133 [1, 8, 77]. Ekspresja CD34 lub CD133 nie jest oczywiœcie wystarczaj¹c¹ cech¹ odró niaj¹c¹ EPC od innych komórek, np. komórek hematopoycznych CD34 +, jednak e stosowanie selekcji na podstawie jednoczesnej ekspresji kilku markerów proponowanej przez niektóre grupy CD31, CD34, KDR [55] jest niemo liwe ze wzglêdu na znikom¹ iloœæ takich komórek we krwi czy szpiku. Jak podaje Zhang i wspó³pracownicy komórki CD34 + stanowi¹ wy³¹cznie 2,58±0,36%, natomiast komórki CD133 + 1,48±0,33% wszystkich komórek jednoj¹drzastych z krwi obwodowej [96]. Zwa ywszy, e w próbach klinicznych pacjentowi podaje siê od jednego do naw kilkus milionów komórek (w zale noœci od danej próby klinicznej i leczonej choroby), widaæ, e dostêpnoœæ komórek o bardziej okreœlonej charakterystyce jest jednym z czynników limituj¹cych terapiê komórkow¹ [38]. Rozwi¹zaniem tego problemu mo e byæ ekspansja komórek w warunkach in vitro przed podaniem pacjentowi. Takie próby przeprowadzono [12, 20], nale y jednak pamiêtaæ, e w czasie hodowli in vitro komórki mog¹ zmieniaæ swoj¹ charakterystykê [26]. Terapiê komórkow¹ z zastosowaniem komórek progenitorowych œródb³onka próbuje siê stosowaæ w chorobach, które wymagaj¹ zwiêkszenia ukrwienia tkanki przez nasilenie procesów angiogennych. Dotychczasowe próby kliniczne dotyczy³y zastosowania tych komórek g³ównie w ró nych postaciach zawa³u miêœnia sercowego (ostry zawa³ serca [12, 40, 53, 71, 91], przewlek³y zawa³ serca [77], zawa³ serca z uniesieniem odcinka ST [35, 83]), a tak e w chorobie wieñcowej [20] oraz chorobach niedokrwiennych koñczyn [82]. Przegl¹d wybranych prób klinicznych przedstawiono w tabeli 3. Warto zaznaczyæ, i jedna z tych prób realizowana by³a w latach 2005 2008 w Polsce przez zespó³ prof. Micha³a Tendery. Analizuj¹c wyniki i efektywnoœæ dotychczas przeprowadzonych prób klinicznych nale y wzi¹æ pod uwagê sposób podania komórek i ich liczbê. Szczególne znaczenie w przypadku prób dotycz¹cych przywracania funkcji miêœnia sercowego po zawale ma tak e czas, jaki up³ywa od zawa³u do podania komórek. W jednej z najwiêkszych prób klinicznych randomizowanym, wielooœrodkowym badaniu REPAIR-AMI skutecznym zabiegiem by³o podanie ponad 200 milionów komórek jednoj¹drzastych.

178 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK T ABELA 3. P róby kliniczne z wykorzystaniem komórek progenitorowych œródb³onek zestawieni e T ABLE 3. Clinical trials with endothelial progenitor cell s Choroba Podawane komórki, Ÿród³ o a grupa Choroba niedokrwienna serca ca³kowita obwodowej ca³kowita kostnego populacja populacja z ze krwi szpiku Œredni dawka (kom. 1 0 6 ) x Badana (leczeni: kontrola) Droga podania Czas obserwacji (mies.) Próba Ref. kliniczna 22 34:2 3 dowieñcow o 3 n i e Assmus [6 ] 205 35:2 3 ta k Ostry zawa³ serca jednoj¹drzaste, szpik kostn y 68 50:5 0 12 n i e ASTAMI [53 ] Przewlek³y serca zawa³ ca³kowita kostnego populacja ze szpiku jednoj¹drzaste, szpik kostny, e kspansja komórek in vitr o jednoj¹drzaste, krew obwodowa, równoczeœnie podawano GCSF jednoj¹drzaste, szpik kostny 6 jednoj¹drzaste jednoj¹drzaste, CD34 CXCR4 2460 30:3 0 18 ni e BOOST [9 1 8000 34:3 4 6 i e 1000 10:10:7 * 6 ak* * 23 100:10 1 12 a k 1,9 80:80:40** * 6 i e n Chen [1 2 t MAGIC [40 ] t REPAIR-AMI [7 1 n REGENT [83 ] CD133, szpik kostny 5, 6 46: 9 domiêœniow o 6 t a k Stamm [77 ] Efektywnoœæ Ostry zawa³ serca CD133, szpik kostn y 12, 6 19:1 6 dowieñcow o 4 t a k Bartunek [8 ] Zawa³ serca CD133, szpik kostn y 1,8 9 18: 9 domiêœniow o 6 t a k Ahmadi [1 ] Dusznica bolesna CD34 z krwi obwodowej mobilizo - 0,3 18: 6 domiêœniow o 6 ta k Losodro [5 2 wane przez podawanie GCSF Przewlek³a okluzja jednoj¹drzaste, krew obwodowa, 69 13:1 3 dowieñcow o 3 t a k Erbs [20 ] naczyñ wieñcowych e kspansja komórek i n vitr o prze d podaniem Choroba niedo- jednoj¹drzaste, szpik kostny 1, 5 22*** * domiêœniow o 36 t a k TACT [82 ] krwienna koñczyn * grupa z podanymi komórkami i GCSF: wy³¹cznie GCSF: kontrola; ** odnotowano równie zwiêkszone ryzyko wyst¹pienia restenozy; *** grupa z podanymi komórkami jednoj¹drzastymi:komórkami CD34 CXCR4:kontrola; **** pacjenci z chorob¹ niedokrwienn¹ obu koñczyn dolnych, do jednej koñczyny podawano komórki, drug¹ traktowano jako kontrolê

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 179 Pacjentom 3 do 7 dni po zawale serca podawano w obrêb têtnicy objêtej zawa³em komórki lub samo medium jako placebo [71]. Wœród pacjentów, którym podawano komórki, w ci¹gu nastêpnych 12 miesiêcy obserwowano mniej powtórnych zawa³ów i ograniczenie koniecznych kolejnych hospitalizacji z powodu dolegliwoœci naczyniowosercowych [71]. Natomiast w badaniu BOOST, w którym podawano oko³o 10 razy wiêcej komórek, przy czym by³y to komórki pe³nego szpiku kostnego, korzystne efekty mo na by³o obserwowaæ po up³ywie 6 miesiêcy zwiêkszy³a siê frakcja wyrzutowa i kurczliwoœæ lewej komory w rejonie przyleg³ym do zawa³owego, aczkolwiek po up³ywie 18 miesiêcy paramry te pomiêdzy grup¹ poddan¹ terapii komórkowej a kontroln¹ zrówna³y siê [91]. Terapiê komórkow¹ próbowano tak e zastosowaæ u chorych z ustabilizowan¹ chorob¹ niedokrwienn¹ serca, którzy przeszli zawa³ przynajmniej 3 miesi¹ce przed rozpoczêciem terapii. Porównano efektywnoœæ komórek izolowanych z krwi obwodowej oraz szpiku kostnego. Po 3 miesi¹cach w grupie, której podano komórki ze szpiku kostnego, zaobserwowano efektywnoœæ nieznaczn¹, ale statystycznie istotn¹ w porównaniu z grup¹, w której stosowano terapiê komórkami z krwi, oraz z grup¹ kontroln¹ [6]. Próby, w których podawano komórki selekcjonowane na podstawie ekspresji CD133 czy CD34, pomimo mniejszej liczby podanych komórek okaza³y siê byæ korzystne dla pacjentów po zawale serca (zwiêkszona frakcja wyrzutowa lewej komory [46, 77]) czy cierpi¹cych na dusznicê bolesn¹ (zwiêkszona perfuzja niedokrwionego obszaru [52]). Obiecuj¹ce wyniki da³y próby terapii komórkowej u osób z chorob¹ niedokrwienn¹ koñczyn dolnych. Zwiêkszy³o siê dostarczanie tlenu do tkanki, pacjenci odczuwali mniejszy ból spoczynkowy oraz zmniejszenie bólu podczas chodzenia w koñczynie nastrzykniêtej szpikowymi komórkami jednoj¹drzastymi w porównaniu z drugi¹ niedokrwion¹ koñczyn¹ bêd¹c¹ kontrol¹ [82]. Co wa ne, powy sze próby kliniczne pokaza³y, e w przypadku wymienionych chorób terapia komórkowa wydaje siê byæ zabiegiem bezpiecznym i niepowoduj¹cym powa nych skutków ubocznych. Jedynie iniekcja komórek bezpoœrednio do miêœnia sercowego jest bardziej inwazyjna, powoduj¹c lokalne uszkodzenie tkanki. Dlatego preferowanym sposobem podania komórek jest ich dostarczenie bezpoœrednio do têtnicy objêtej zawa³em [75]. Inn¹ strategi¹ zastosowania komórek progenitorowych œródb³onka w kardiologii jest u ycie stentów pokrytych przeciwcia³ami rozpoznaj¹cymi antygen CD34, który wystêpuje na ludzkich komórkach EPC. Strategia ta zak³ada przyspieszone pokrywanie stentów przez monowarstwê komórek œródb³onka, co w konsekwencji ma chroniæ przez zakrzepem i restenoz¹ [49]. Pierwsze tego typu próby zosta³y ju przeprowadzone. Jednak istniej¹ równie doniesienia o niekorzystnych i groÿnych dla pacjenta zjawiskach towarzysz¹cych tej terapii. Zaobserwowano komplikacje kwalifikuj¹ce do przoczenia krwi oraz wy³¹czenia leków przeciwzakrzepowych i przeciwp³ytkowych [49], jak równie póÿne (maj¹ce miejsce po 156 dniach od implantacji stentu) wyst¹pienie zakrzepu i restenozy, a w konsekwencji zawa³u serca u pacjenta poddanego takiej terapii [67]. Podsumowuj¹c, dotychczasowe próby kliniczne przynajmniej w czêœci potwierdzi³y terapeutyczny potencja³ komórek progenitorowych. Wyniki kilkunastu randomizowanych badañ wykaza³y skutecznoœæ takiej terapii, jednak e efekty nie by³y tak

180A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK spektakularne, jak mo na by siê spodziewaæ po wynikach eksperymentów na modelach zwierzêcych [38, 43, 75]. W przypadku zastosowania terapii komórkowej w regeneracji miêœnia sercowego po zawale, czêsto porównywany paramr, jakim jest frakcja wyrzutowa lewej komory, poprawia siê o kilka punktów procentowych. Warto natomiast odnotowaæ, e pomimo stosunkowo niewielkiej poprawy frakcji wyrzutowej obserwowanej w badaniach, w jednej z wiêkszych prób (REPAIR-AMI) leczeni za pomoc¹ terapii komórkowej pacjenci rzadziej wymagali ponownej hospitalizacji z powodów niewydolnoœci naczyniowo-sercowej, co wydaje siê byæ jednym z wa niejszych kryteriów oceny skutecznoœci terapii [71]. Korzystne s¹ tak e wyniki aplikacji komórek progenitorowych w przypadku zaawansowanej choroby niedokrwiennej koñczyn, dla której nie istnieje dzisiaj adna inna skuteczna terapia [82]. W przypadku kilku prób klinicznych nie wykazano korzystnych efektów terapeutycznych [53, 91]. Powodów t³umacz¹cych brak efektywnoœci lub tylko nieznaczny efekt terapeutyczny prób mo e byæ kilka. W dalszym ci¹gu nie wiemy, które komórki spoœród komórek krwi obwodowej czy szpiku kostnego maj¹ najwiêkszy potencja³ angiogenny. Byæ mo e dok³adniejsze okreœlenie subpopulacji o charakterze progenitorów œródb³onka, próba jej izolacji i podania oka e siê recept¹ na zwiêkszenie efektywnoœci kolejnych prób. Nie mo emy jednak zapominaæ o czynniku limituj¹cym, jakim jest liczba dostêpnych komórek. Pacjenci, którzy wymagaj¹ leczenia, czêsto s¹ w podesz³ym wieku, co wp³ywa u nich na wielkoœæ populacji EPC [37, 85]. Ponadto, chorobom niedokrwiennym towarzysz¹ takie schorzenia, jak: cukrzyca, nadciœnienie, hipercholesterolemia, które jak pokazano dodatkowo wp³ywaj¹ na zmniejszenie liczby komórek progenitorowych oraz na ich funkcjonowanie [75]. Warto równie zwróciæ uwagê, e komórki po iniekcji trafiaj¹ do niekorzystnego œrodowiska, takiego jak miêsieñ po zawale, koñczyna objêta martwic¹ i niedokrwieniem. W takich warunkach szansa przrwania komórek oczywiœcie spada. Rozwi¹zaniem tego problemu mo e okazaæ siê po³¹czenie terapii komórkowej z terapi¹ genow¹. W tego typu próbach, izolowane od pacjenta komórki poddaje siê modyfikacji genycznej ex-vivo, a nastêpnie podaje do tkanki wymagaj¹cej leczenia. Drog¹ modyfikacji genycznej mo emy uzyskaæ nadekspresjê genów cytoprotekcyjnych, które mog¹ pomóc prze yæ podawanym komórkom w trudnych warunkach niedokrwionej tkanki. Przyk³adem takiego badania jest uzyskanie nadekspresji oksygenazy hemowej pierwszej w mezenchymalnych komórkach macierzystych i podanie ich w obrêb miêœnia zawa³owego [81]. Uzyskane wyniki pozwalaj¹ z umiarkowanym optymizmem patrzeæ na przysz³e zastosowanie kliniczne terapii komórkowej w chorobach naczyniowych. Niezaprzeczalnie, aby udoskonaliæ dotychczasowe mody, potrzebne s¹ kolejne badania, zarówno na podstawowym poziomie wyjaœniaj¹cym mechanizm terapeutycznego dzia³ania i dok³adniej charakteryzuj¹ce populacje o potencjale angiogennym, jak równie nastêpne, wiêksze próby kliniczne III fazy.

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 181 LITERATURA [1] AHMADI H, BAHARVAND H, ASHTIANI SK, SOLEIMANI M, SADEGHIAN H, ARDEKANI JM, MEHRJERDI NZ, KOUHKAN A, NAMIRI M, MADANI-CIVI M, FATTAHI F, SHAHVERDI A, DIZAJI AV. Safy analysis and improved cardiac function following local autologous transplantation of CD133(+) enriched bone marrow cells after myocardial infarction. Curr Neurovasc Res 2007; 4: 153 160. [2] AICHER A, HEESCHEN C, MILDNER-RIHM C, URBICH C, IHLING C, TECHNAU-IHLING K, ZEIHER AM, DIMMELER S. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med 2003; 9: 1370 1376. [3] ASAHARA T, KAWAMOTO A. Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 287: C572 579. [4] ASAHARA T, MASUDA H, TAKAHASHI T, KALKA C, PASTORE C, SILVER M, KEARNE M, MA- GNER M, ISNER JM. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res 1999; 85: 221 228. [5] ASAHARA T, MUROHARA T, SULLIVAN A, SILVER M, VAN DER ZEE R, LI T, WITZENBICHLER B, SCHATTEMAN G, ISNER JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964 967. [6] ASSMUS B, HONOLD J, SCHACHINGER V, BRITTEN MB, FISCHER-RASOKAT U, LEHMANN R, TEUPE C, PISTORIUS K, MARTIN H, ABOLMAALI ND, TONN T, DIMMELER S, ZEIHER AM. Transcoronary transplantation of progenitor cells after myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1222 1232. [7] BARCELOS LS, DUPLAA C, KRANKEL N, GRAIANI G, INVERNICI G, KATARE R, SIRAGUSA M, MELONI M, CAMPESI I, MONICA M, SIMM A, CAMPAGNOLO P, MANGIALARDI G, STEVANA- TO L, ALESSANDRI G, EMANUELI C, MADEDDU P. Human CD133 + progenitor cells promote the healing of diabic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling. Circ Res 2009; 104: 1095 1102. [8] BARTUNEK J, VANDERHEYDEN M, VANDEKERCKHOVE B, MANSOUR S, DE BRUYNE B, DE BONDT P, VAN HAUTE I, LOOTENS N, HEYNDRICKX G, WIJNS W. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safy. Circulation 2005; 112: I178 183. [9] BEHRENDT D, GANZ P. Endothelial function. From vascular biology to clinical applications. Am J Cardiol 2002; 90: 40L 48L. [10] BONDER CS, SUN WY, MATTHEWS T, CASSANO C, LI X, RAMSHAW HS, PITSON SM, LOPEZ AF, COATES PT, PROIA RL, VADAS MA, GAMBLE JR. Sphingosine kinase regulates the rate of endothelial progenitor cell differentiation. Blood 2009; 113: 2108 2117. [11] CERADINI DJ, GURTNER GC. Homing to hypoxia: HIF-1 as a mediator of progenitor cell recruitment to injured tissue. Trends Cardiovasc Med 2005; 15: 57 63. [12] CHEN SL, FANG WW, QIAN J, YE F, LIU YH, SHAN SJ, ZHANG JJ, LIN S, LIAO LM, ZHAO RC. Improvement of cardiac function after transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in patients with acute myocardial infarction. Chin Med J (Engl) 2004; 117: 1443 1448. [13] CHENG XW, KUZUYA M, NAKAMURA K, MAEDA K, TSUZUKI M, KIM W, SASAKI T, LIU Z, INOUE N, KONDO T, JIN H, NUMAGUCHI Y, OKUMURA K, YOKOTA M, IGUCHI A, MUROHARA T. Mechanisms underlying the impairment of ischemia-induced neovascularization in matrix malloproteinase 2-deficient mice. Circ Res 2007; 100: 904 913. [14] CIARROCCHI A, JANKOVIC V, SHAKED Y, NOLAN DJ, MITTAL V, KERBEL RS, NIMER SD, BENEZRA R. Id1 restrains p21 expression to control endothelial progenitor cell formation. PLoS One 2007; 2: e1338. [15] CREAGER MA, LUSCHER TF, COSENTINO F, BECKMAN JA. Diabes and vascular disease: pathophysiology, clinical consequences, and medical therapy: Part I. Circulation 2003; 108: 1527 1532. [16] DERNBACH E, URBICH C, BRANDES RP, HOFMANN WK, ZEIHER AM, DIMMELER S. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood 2004; 104: 3591 3597. [17] DESHANE J, CHEN S, CABALLERO S, GROCHOT-PRZECZEK A, WAS H, LI CALZI S, LACH R, HOCK TD, CHEN B, HILL-KAPTURCZAK N, SIEGAL GP, DULAK J, JOZKOWICZ A, GRANT MB, AGARWAL A. Stromal cell-derived factor 1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase 1-dependent mechanism. J Exp Med 2007; 204: 605 618.

182 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK [18] DI SANTO S, YANG Z, WYLER VON BALLMOOS M, VOELZMANN J, DIEHM N, BAUMGARTNER I, KALKA C. Novel cell-free strategy for therapeutic angiogenesis: in vitro generated conditioned medium can replace progenitor cell transplantation. PLoS One 2009; 4: e5643. [19] DI STEFANO V, CENCIONI C, ZACCAGNINI G, MAGENTA A, CAPOGROSSI MC, MARTELLI F. p66shca modulates oxidative stress and survival of endothelial progenitor cells in response to high glucose. Cardiovasc Res 2009; 82: 421 429. [20] ERBS S, LINKE A, ADAMS V, LENK K, THIELE H, DIEDERICH KW, EMMRICH F, KLUGE R, KENDZIORRA K, SABRI O, SCHULER G, HAMBRECHT R. Transplantation of blood-derived progenitor cells after recanalization of chronic coronary artery occlusion: first randomized and placebocontrolled study. Circ Res 2005; 97: 756 762. [21] FERRARA N, HENZEL WJ. Pituitary follicular cells secre a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1989; 161: 851 858. [22] FOLKMAN J. What is the role of endothelial cells in angiogenesis? Lab Invest 1984; 51: 601 604. [23] FOUBERT P, SILVESTRE JS, SOUTTOU B, BARATEAU V, MARTIN C, EBRAHIMIAN TG, LERE- DEAN C, CONTRERES JO, SULPICE E, LEVY BI, PLOUET J, TOBELEM G, LE RICOUSSE-ROUS- SANNE S. PSGL-1-mediated activation of EphB4 increases the proangiogenic potential of endothelial progenitor cells. J Clin Invest 2007; 117: 1527 1537. [24] GALASSO G, SCHIEKOFER S, SATO K, SHIBATA R, HANDY DE, OUCHI N, LEOPOLD JA, LOSCAL- ZO J, WALSH K. Impaired angiogenesis in glutathione peroxidase-1-deficient mice is associated with endothelial progenitor cell dysfunction. Circ Res 2006; 98: 254 261. [25] GARCIA-BARROS M, PARIS F, CORDON-CARDO C, LYDEN D, RAFII S, HAIMOVITZ-FRIEDMAN A, FUKS Z, KOLESNICK R. Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 2003; 300: 1155 1159. [26] HAI-JIANG W, XIN-NA D, HUI-JUN D. Expansion of hematopoiic stem/progenitor cells. Am J Hematol 2008; 83: 922 926. [27] HAN JK, LEE HS, YANG HM, HUR J, JUN SI, KIM JY, CHO CH, KOH GY, PETERS JM, PARK KW, CHO HJ, LEE HY, KANG HJ, OH BH, PARK YB, KIM HS. Peroxisome proliferator-activated receptordelta agonist enhances vasculogenesis by regulating endothelial progenitor cells through genomic and nongenomic activations of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. Circulation 2008; 118: 1021 1033. [28] HE T, PETERSON TE, HOLMUHAMEDOV EL, TERZIC A, CAPLICE NM, OBERLEY LW, KATUSIC ZS. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 2021 2027. [29] HE T, PETERSON TE, KATUSIC ZS. Paracrine mitogenic effect of human endothelial progenitor cells: role of interleukin-8. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 289: H968 972. [30] HILL JM, ZALOS G, HALCOX JP, SCHENKE WH, WACLAWIW MA, QUYYUMI AA, FINKEL T. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med 2003; 348: 593 600. [31] HRISTOV M, ZERNECKE A, BIDZHEKOV K, LIEHN EA, SHAGDARSUREN E, LUDWIG A, WEBER C. Importance of CXC chemokine receptor 2 in the homing of human peripheral blood endothelial progenitor cells to sites of arterial injury. Circ Res 2007; 100: 590 597. [32] HUANG PH, CHEN YH, WANG CH, CHEN JS, TSAI HY, LIN FY, LO WY, WU TC, SATA M, CHEN JW, LIN SJ. Matrix malloproteinase-9 is essential for ischemia-induced neovascularization by modulating bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009; 29: 1179 1184. [33] HUR J, YOON CH, KIM HS, CHOI JH, KANG HJ, HWANG KK, OH BH, LEE MM, PARK YB. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 288 293. [34] INGRAM DA, CAPLICE NM, YODER MC. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood 2005; 106: 1525 1531. [35] JANSSENS S, DUBOIS C, BOGAERT J, THEUNISSEN K, DEROOSE C, DESMET W, KALANTZI M, HERBOTS L, SINNAEVE P, DENS J, MAERTENS J, RADEMAKERS F, DYMARKOWSKI S, GHEY- SENS O, VAN CLEEMPUT J, BORMANS G, NUYTS J, BELMANS A, MORTELMANS L, BOOGA- ERTS M, VAN DE WERF F. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with STsegment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled tri Lanc 2006; 367: 113 121.

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 183 [36] JIANG M, WANG B, WANG C, HE B, FAN H, GUO TB, SHAO Q, GAO L, LIU Y. Angiogenesis by transplantation of HIF-1 alpha modified EPCs into ischemic limbs. J Cell Biochem 2008; 103: 321 334. [37] JIE KE, GOOSSENS MH, VAN OOSTROM O, LILIEN MR, VERHAAR MC. Circulating endothelial progenitor cell levels are higher during childhood than in adult life. Atherosclerosis 2009; 202: 345 347. [38] JUJO K, II M, LOSORDO DW. Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol 2008; 45: 530 544. [39] KALKA C, MASUDA H, TAKAHASHI T, KALKA-MOLL WM, SILVER M, KEARNEY M, LI T, ISNER JM, ASAHARA T. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 3422 3427. [40] KANG HJ, KIM HS, ZHANG SY, PARK KW, CHO HJ, KOO BK, KIM YJ, SOO LEE D, SOHN DW, HAN KS, OH BH, LEE MM, PARK YB. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical tri Lanc 2004; 363: 751 756. [41] KANG LN, CHEN Q, WANG L, GAO L, MENG K, CHEN JH, FERRO A, XU B. Decreased Mobilization of Endothelial Progenitor Cells Contributes to Impaired Neovascularization in Diabes. Clin Exp Pharmacol Physiol 2009. [42] KAWAMOTO A, GWON HC, IWAGURO H, YAMAGUCHI JI, UCHIDA S, MASUDA H, SILVER M, MA H, KEARNEY M, ISNER JM, ASAHARA T. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation 2001; 103: 634 637. [43] KAWAMOTO A, LOSORDO DW. Endothelial progenitor cells for cardiovascular regeneration. Trends Cardiovasc Med 2008; 18: 33 37. [44] KERBEL RS, BENEZRA R, LYDEN DC, HATTORI K, HEISSIG B, NOLAN DJ, MITTAL V, SHAKED Y, DIAS S, BERTOLINI F, RAFII S. Endothelial progenitor cells are cellular hubs essential for neoangiogenesis of certain aggressive adenocarcinomas and mastatic transition but not adenomas. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: E54; author reply E55. [45] KIM SJ, KIM JS, PAPADOPOULOS J, WOOK KIM S, MAYA M, ZHANG F, HE J, FAN D, LANGLEY R, FIDLER IJ. Circulating monocytes expressing CD31: implications for acute and chronic angiogenesis. Am J Pathol 2009; 174: 1972 1980. [46] KLEIN HM, GHODSIZAD A, MARKTANNER R, POLL L, VOELKEL T, MOHAMMAD HASANI MR, PIECHACZEK C, FEIFEL N, STOCKSCHLAEDER M, BURCHARDT ER, KAR BJ, GREGORIC I, GAMS E. Intramyocardial implantation of CD133 + stem cells improved cardiac function without bypass surgery. Heart Surg Forum 2007; 10: E66 69. [47] KOCHER AA, SCHUSTER MD, SZABOLCS MJ, TAKUMA S, BURKHOFF D, WANG J, HOMMA S, EDWARDS NM, ITESCU S. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med 2001; 7: 430 436. [48] KWON SM, EGUCHI M, WADA M, IWAMI Y, HOZUMI K, IWAGURO H, MASUDA H, KAWAMOTO A, ASAHARA T. Specific Jagged-1 signal from bone marrow microenvironment is required for endothelial progenitor cell development for neovascularization. Circulation 2008; 118: 157 165. [49] LEE WL, HO HH, CHAN KW, HAI SH, SIN WC, TAM CC, LAM L, CHAN HW. Successful use of endothelial progenitor cell capture stents in two cases of acute coronary syndrome complicated by major bleeding episodes. Int J Cardiol 2009. [50] LIN HH, CHEN YH, YET SF, CHAU LY. Heme oxygenase-1/carbon monoxide enhances reendothelialization after vascular injury via promoting mobilization of circulating endothelial progenitor cells. J Thromb Haemost 2009. [51] LOOMANS CJ, DE KONING EJ, STAAL FJ, ROOKMAAKER MB, VERSEYDEN C, DE BOER HC, VERHAAR MC, BRAAM B, RABELINK TJ, VAN ZONNEVELD AJ. Endothelial progenitor cell dysfunction: a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabes. Diabes 2004; 53: 195 199. [52] LOSORDO DW, SCHATZ RA, WHITE CJ, UDELSON JE, VEERESHWARAYYA V, DURGIN M, POH KK, WEINSTEIN R, KEARNEY M, CHAUDHRY M, BURG A, EATON L, HEYD L, THORNE T, SHTURMAN L, HOFFMEISTER P, STORY K, ZAK V, DOWLING D, TRAVERSE JH, OLSON RE, FLANAGAN J, SODANO D, MURAYAMA T, KAWAMOTO A, KUSANO KF, WOLLINS J, WELT F, SHAH P, SOUKAS P, ASAHARA T, HENRY TD. Intramyocardial transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized controlled tri Circulation 2007; 115: 3165 3172.

184 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK [53] LUNDE K, SOLHEIM S, AAKHUS S, ARNESEN H, ABDELNOOR M, EGELAND T, ENDRESEN K, ILEBEKK A, MANGSCHAU A, FJELD JG, SMITH HJ, TARALDSRUD E, GROGAARD HK, BJORNER- HEIM R, BREKKE M, MULLER C, HOPP E, RAGNARSSON A, BRINCHMANN JE, FORFANG K. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1199 209. [54] MADEDDU P, KRAENKEL N, BARCELOS LS, SIRAGUSA M, CAMPAGNOLO P, OIKAWA A, CAPO- RALI A, HERMAN A, AZZOLINO O, BARBERIS L, PERINO A, DAMILANO F, EMANUELI C, HIRSCH E. Phosphoinositide 3-kinase gamma gene knockout impairs postischemic neovascularization and endothelial progenitor cell functions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008; 28: 68 76. [55] MASSA M, ROSTI V, FERRARIO M, CAMPANELLI R, RAMAJOLI I, ROSSO R, DE FERRARI GM, FERLINI M, GOFFREDO L, BERTOLETTI A, KLERSY C, PECCI A, MORATTI R, TAVAZZI L. Increased circulating hematopoiic and endothelial progenitor cells in the early phase of acute myocardial infarction. Blood 2005; 105: 199 206. [56] MOGI M, WALSH K, IWAI M, HORIUCHI M. Akt-FOXO3a signaling affects human endothelial progenitor cell differentiation. Hypertens Res 2008; 31: 153 159. [57] MURRY CE, SOONPAA MH, REINECKE H, NAKAJIMA H, NAKAJIMA HO, RUBART M, PASU- MARTHI KB, VIRAG JI, BARTELMEZ SH, POPPA V, BRADFORD G, DOWELL JD, WILLIAMS DA, FIELD LJ. Haematopoiic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664 668. [58] NISHIWAKI Y, YOSHIDA M, IWAGURO H, MASUDA H, NITTA N, ASAHARA T, ISOBE M. Endothelial E-selectin potentiates neovascularization via endothelial progenitor cell-dependent and -independent mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27: 512 518. [59] OH IY, YOON CH, HUR J, KIM JH, KIM TY, LEE CS, PARK KW, CHAE IH, OH BH, PARK YB, KIM HS. Involvement of E-selectin in recruitment of endothelial progenitor cells and angiogenesis in ischemic muscle. Blood 2007; 110: 3891 3899. [60] ORLIC D, KAJSTURA J, CHIMENTI S, JAKONIUK I, ANDERSON SM, LI B, PICKEL J, MCKAY R, NADAL-GINARD B, BODINE DM, LERI A, ANVERSA P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701 705. [61] PURHONEN S, PALM J, ROSSI D, KASKENPAA N, RAJANTIE I, YLA-HERTTUALA S, ALITALO K, WEISSMAN IL, SALVEN P. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 6620 6625. [62] RAEMER PC, HAEMMERLING S, GIESE T, CANADAY DH, KATUS HA, DENGLER TJ, SHANKAR SG. Endothelial progenitor cells possess monocyte-like antigen-presenting and T-cell-co-stimulatory capacity. Transplantation 2009; 87: 340 349. [63] RAFII S, LYDEN D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med 2003; 9: 702 712. [64] REHMAN J, LI J, ORSCHELL CM, MARCH KL. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secre angiogenic growth factors. Circulation 2003; 107: 1164 1169. [65] RISAU W, SARIOLA H, ZERWES HG, SASSE J, EKBLOM P, KEMLER R, DOETSCHMAN T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies. Development 1988; 102: 471 478. [66] ROHDE E, MALISCHNIK C, THALER D, MAIERHOFER T, LINKESCH W, LANZER G, GUELLY C, STRUNK D. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells 2006; 24: 357 367. [67] ROSSI ML, ZAVALLONI D, GASPARINI GL, MANGO R, BELLI G, PRESBITERO P. The first report of late stent thrombosis leading to acute myocardial infarction in patient receiving the new endothelial progenitor cell capture stent. Int J Cardiol 2009. [68] ROSSIG L, URBICH C, BRUHL T, DERNBACH E, HEESCHEN C, CHAVAKIS E, SASAKI K, AICHER D, DIEHL F, SEEGER F, POTENTE M, AICHER A, ZANETTA L, DEJANA E, ZEIHER AM, DIMME- LER S. Histone deacylase activity is essential for the expression of HoxA9 and for endothelial commitment of progenitor cells. J Exp Med 2005; 201: 1825 1835. [69] SALES VL, ENGELMAYR GC, JR., METTLER BA, JOHNSON JA, JR., SACKS MS, MAYER JE, JR. Transforming growth factor-ba1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation 2006; 114: I193 199.

PROANGIOGENNA TERAPIA KOMÓRKOWA 185 [70] SBAA E, DEWEVER J, MARTINIVE P, BOUZIN C, FRERART F, BALLIGAND JL, DESSY C, FERON O. Caveolin plays a central role in endothelial progenitor cell mobilization and homing in SDF-1-driven postischemic vasculogenesis. Circ Res 2006; 98: 1219 1227. [71] SCHACHINGER V, ERBS S, ELSASSER A, HABERBOSCH W, HAMBRECHT R, HOLSCHERMANN H, YU J, CORTI R, MATHEY DG, HAMM CW, SUSELBECK T, WERNER N, HAASE J, NEUZNER J, GERMING A, MARK B, ASSMUS B, TONN T, DIMMELER S, ZEIHER AM. Improved clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the REPAIR-AMI tri Eur Heart J 2006; 27: 2775 2783. [72] SCHARNER D, ROSSIG L, CARMONA G, CHAVAKIS E, URBICH C, FISCHER A, KANG TB, WAL- LACH D, CHIANG YJ, DERIBE YL, DIKIC I, ZEIHER AM, DIMMELER S. Caspase-8 is involved in neovascularization-promoting progenitor cell functions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009; 29: 571 578. [73] SCHATTEMAN GC, HANLON HD, JIAO C, DODDS SG, CHRISTY BA. Blood-derived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabic mice. J Clin Invest 2000; 106: 571 578. [74] SCHMEISSER A, GARLICHS CD, ZHANG H, ESKAFI S, GRAFFY C, LUDWIG J, STRASSER RH, DANIEL WG. Monocytes coexpress endothelial and macrophagocytic lineage markers and form cordlike structures in Matrigel under angiogenic conditions. Cardiovasc Res 2001; 49: 671 680. [75] SEKIGUCHI H, II M, LOSORDO DW. The relative potency and safy of endothelial progenitor cells and unselected mononuclear cells for recovery from myocardial infarction and ischemia. J Cell Physiol 2009; 219: 235 242. [76] SONG MB, YU XJ, ZHU GX, CHEN JF, ZHAO G, HUANG L. Transfection of HGF gene enhances endothelial progenitor cell (EPC) function and improves EPC transplant efficiency for balloon-induced arterial injury in hypercholesterolemic rats. Vascul Pharmacol 2009. [77] STAMM C, KLEINE HD, CHOI YH, DUNKELMANN S, LAUFFS JA, LORENZEN B, DAVID A, LIEBOLD A, NIENABER C, ZURAKOWSKI D, FREUND M, STEINHOFF G. Intramyocardial delivery of CD133 + bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease: safy and efficacy studies. J Thorac Cardiovasc Surg 2007; 133: 717 725. [78] STONE OA, RICHER C, EMANUELI C, VAN WEEL V, QUAX PH, KATARE R, KRAENKEL N, CAMPAGNOLO P, BARCELOS LS, SIRAGUSA M, SALA-NEWBY GB, BALDESSARI D, MIONE M, VINCENT MP, BENEST AV, AL HAJ ZEN A, GONZALEZ J, BATES DO, ALHENC-GELAS F, MA- DEDDU P. Critical role of tissue kallikrein in vessel formation and maturation: implications for therapeutic revascularization. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009; 29: 657 664. [79] TAKAHASHI T, KALKA C, MASUDA H, CHEN D, SILVER M, KEARNEY M, MAGNER M, ISNER JM, ASAHARA T. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 1999; 5: 434 438. [80] TAMARAT R, SILVESTRE JS, LE RICOUSSE-ROUSSANNE S, BARATEAU V, LECOMTE-RACLET L, CLERGUE M, DURIEZ M, TOBELEM G, LEVY BI. Impairment in ischemia-induced neovascularization in diabes: bone marrow mononuclear cell dysfunction and therapeutic potential of placenta growth factor treatment. Am J Pathol 2004; 164: 457 466. [81] TANG YL, TANG Y, ZHANG YC, QIAN K, SHEN L, PHILLIPS MI. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1 vector. J Am Coll Cardiol 2005; 46: 1339 1350. [82] TATEISHI-YUYAMA E, MATSUBARA H, MUROHARA T, IKEDA U, SHINTANI S, MASAKI H, AMANO K, KISHIMOTO Y, YOSHIMOTO K, AKASHI H, SHIMADA K, IWASAKA T, IMAIZUMI T. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled tri Lanc 2002; 360: 427 435. [83] TENDERA M, WOJAKOWSKI W, RUZYLLO W, CHOJNOWSKA L, KEPKA C, TRACZ W, MUSIA- LEK P, PIWOWARSKA W, NESSLER J, BUSZMAN P, GRAJEK S, BREBOROWICZ P, MAJKA M, RATAJCZAK MZ. Intracoronary infusion of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+ cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusion of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction (REGENT) Tri Eur Heart J 2009; 30: 1313 1321. [84] TEPPER OM, GALIANO RD, CAPLA JM, KALKA C, GAGNE PJ, JACOBOWITZ GR, LEVINE JP, GURTNER GC. Human endothelial progenitor cells from type II diabics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation 2002; 106: 2781 2786.

186 A. GROCHOT-PRZÊCZEK, K. SZADE, J. KOTLINOWSKI, A. JÓZKOWICZ, J. DULAK [85] THUM T, HOEBER S, FROESE S, KLINK I, STICHTENOTH DO, GALUPPO P, JAKOB M, TSIKAS D, ANKER SD, POOLE-WILSON PA, BORLAK J, ERTL G, BAUERSACHS J. Age-dependent impairment of endothelial progenitor cells is corrected by growth-hormone-mediated increase of insulin-like growth-factor-1. Circ Res 2007; 100: 434 443. [86] URBICH C, AICHER A, HEESCHEN C, DERNBACH E, HOFMANN WK, ZEIHER AM, DIMMELER S. Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells. J Mol Cell Cardiol 2005; 39: 733 742. [87] URBICH C, DIMMELER S. Endothelial progenitor cells functional characterization. Trends Cardiovasc Med 2004; 14: 318 322. [88] URBICH C, HEESCHEN C, AICHER A, DERNBACH E, ZEIHER AM, DIMMELER S. Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor cells. Circulation 2003; 108: 2511 2516. [89] VASA M, FICHTLSCHERER S, AICHER A, ADLER K, URBICH C, MARTIN H, ZEIHER AM, DIMME- LER S. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res 2001; 89: E1 7. [90] WICKERSHEIM A, KERBER M, DE MIGUEL LS, PLATE KH, MACHEIN MR. Endothelial progenitor cells do not contribute to tumor endothelium in primary and mastatic tumors. Int J Cancer 2009. [91] WOLLERT KC, MEYER GP, LOTZ J, RINGES-LICHTENBERG S, LIPPOLT P, BREIDENBACH C, FICHTNER S, KORTE T, HORNIG B, MESSINGER D, ARSENIEV L, HERTENSTEIN B, GANSER A, DREXLER H. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical tri Lanc 2004; 364: 141 148. [92] WU Y, IP JE, HUANG J, ZHANG L, MATSUSHITA K, LIEW CC, PRATT RE, DZAU VJ. Essential role of ICAM-1/CD18 in mediating EPC recruitment, angiogenesis, and repair to the infarcted myocardium. Circ Res 2006; 99: 315 322. [93] YIN T, MA X, ZHAO L, CHENG K, WANG H. Angiotensin II promotes NO production, inhibits apoptosis and enhances adhesion potential of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Cell Res. 2008; 18: 792 799. [94] YODER MC, MEAD LE, PRATER D, KRIER TR, MROUEH KN, LI F, KRASICH R, TEMM CJ, PRCHAL JT, INGRAM DA. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoiic stem/progenitor cell principals. Blood 2007; 109: 1801 1809. [95] ZENG L, XIAO Q, MARGARITI A, ZHANG Z, ZAMPETAKI A, PATEL S, CAPOGROSSI MC, HU Y, XU Q. HDAC3 is crucial in shear- and VEGF-induced stem cell differentiation toward endothelial cells. J Cell Biol 2006; 174: 1059 1069. [96] ZHANG S, GE J, SUN A, XU D, QIAN J, LIN J, ZHAO Y, HU H, LI Y, WANG K, ZOU Y. Comparison of various kinds of bone marrow stem cells for the repair of infarcted myocardium: single clonally purified non-hematopoiic mesenchymal stem cells serve as a superior source. J Cell Biochem 2006; 99: 1132 1147. Prof. dr hab. Józef Dulak, Zak³ad Biotechnologii Medycznej Wydzia³ Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersyt Jagielloñski ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków e-mail: jozef.dulak@uj.edu.pl; 12 664 6375