ROZSTRZYGNIĘCIE KONKURSU im. Witolda Drabikowskiego POLSKIEGO TOWARZYSTWA BIOCHEMICZNEGO I FIRMY MERCK SP. Z O.O. ZA NAJLEPSZĄ PRACĘ DOKTORSKĄ Z BIOCHEMII W 2011 ROKU Powołana przez Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Biochemicznego i zaakceptowana przez przedstawiciela firmy Merck (dr Karina Błachnio), Komisja w składzie: prof. dr hab. Ewa Birkner, prof. dr hab. Anna Filipek, prof. dr hab. Marek Mirowski, prof. dr hab. Krzysztof Sobolewski i dr hab. Elżbieta Rębas (przewodnicząca), zarekomendowała do nagrody im. W. Drabikowskiego pracę doktorską pt. Funkcja chloroplastowych lipidów prenylowych w odpowiedzi roślin na stres wykonaną i napisaną przez Panią dr Renatę Szymańską pod opieką prof. dr hab. Jerzego Kruka z Zakładu Fizjologii i Biochemii Roślin, Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego. Decyzję Komisji zatwierdził Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Biochemicznego na posiedzeniu w dniu 11 września 2012 roku. dr hab. Elżbieta Rębas Przewodnicząca Komisji Sylwetka naukowa Dr Renaty Szymańskiej Dr Renata Szymańska jest absolwentką dwóch kierunków: Biologia oraz Ochrona Środowiska na Uniwersytecie Jagiellońskim. Przygodę z biochemią roślin rozpoczęła w 2004 roku wykonując pracę magisterską w Zakładzie Fizjologii i Biochemii Roślin Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Kruka. Po obronie pracy magisterskiej Pani Szymańska rozpoczęła studia doktoranckie przy Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ kontynuując pracę w zespole Profesora Kruka, w Zakładzie kierowanym przez Profesora Kazimierza Strzałkę. Praca doktorska dotyczyła funkcji antyoksydacyjnych i biosyntezy chloroplastowych lipidów prenylowych. Pani Szymańska odbyła kilka staży w zagranicznych laboratoriach, zajmujących się badaniem roślinnych prenylochinonów, m.in. na Christian Albrechts University w Kilonii, Institute Science and Technology w Wiedniu czy Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology w Poczdamie. W trakcie studiów doktoranckich Pani dr Szymańska prezentowała swoje wyniki na wielu krajowych, a także międzynarodowych konferencjach, m.in. w Szkocji, Chinach czy Belgii. Pani dr Szymańska jest autorką 14 prac oryginalnych (w takich czasopismach jak Plant, Cell and Physiology, Phytochemistry czy Physiologia Plantarum), kilkunastu prac popularnonaukowych i przeglądowych, czterech rozdziałów w książkach. Osiągnięcia naukowe i popularyzatorskie Pani Szymańskiej były niejednokrotnie nagradzane. Pani Renata jest m.in. laureatką Małopolskiego Stypendium Doktoranckiego oraz Stypendium Prezydenta Miasta Krakowa dla szczególnie uzdolnionych doktorantów. Obrona pracy doktorskiej Pani Renaty Szymańskiej Funkcja chloroplastowych lipidów prenylowych w odpowiedzi roślin na stres odbyła się 8 kwietnia 2011 roku. Na wniosek obu recenzentów, Pana Profesora Tadeusza Chojnackiego oraz Pana Profesora Zbigniewa Miszalskiego, praca doktorska została wyróżniona przez Radę Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ. Obecnie Pani Szymańska jest zatrudniona na stanowisku adiunkta w Zakładzie Fizjologii i Biochemii Roślin WBBiB UJ, gdzie realizuje własny projekt finansowany przez MNiSW. Funkcja chloroplastowych lipidów prenylowych w odpowiedzi roślin na stres Streszczenie pracy Renata Szymańska Zakład Fizjologii i Biochemii Roślin, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków; e-mail: r.szymanska@uj.edu.pl Wzrost i rozwój roślin są uzależnione od stopnia ich adaptacji do funkcjonowania w środowisku, a więc od tego czy i w jakim stopniu wykazują odporność na występujące w nim stresory. W czasie działania czynników stre- 372 www.postepybiochemii.pl
sowych rośliny dążą do utrzymania stanu równowagi pomiędzy wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (RFT), a ich usuwaniem przez obecne w komórkach mechanizmy antyoksydacyjne. W czasie stresu oksydacyjnego spowodowanego nadmiernym wytwarzaniem RFT może dochodzić do utleniania lipidów, białek, barwników czy DNA. Tlen cząsteczkowy może zostać przekształcony w formy bardziej aktywne chemicznie na dwa sposoby: poprzez transfer energii (tworzy się tlen singletowy; 1 ) lub poprzez reakcje elektronowe (wytwarzane - są, H 2 oraz HO ). W obrębie komórki roślinnej RFT powstają przede wszystkim w chloroplastach [1]. Miejscami szczególnie aktywnymi w wytwarzaniu RFT są błony tylakoidów, w szczególności fotosystem I (PSI) oraz fotosystem II (PSII). Rośliny wykształciły szereg mechanizmów obronnych przed szkodliwym działaniem RFT. Należą do nich systemy antyoksydacyjne, które dzielimy na enzymatyczne (m.in. dysmutazy, katalaza, peroksydazy) oraz nieezymatyczne. Do tych ostatnich zalicza się m.in. szeroko rozpowszechnione w komórkach roślinnych lipidy prenylowe, takie jak chinony prenylowe oraz tokochromanole. Zależnie od struktury pierścienia w cząsteczce chinonów prenylowych dzielimy je na naftochinony oraz benzochinony. Do benzochinonów należy plastochinon (PQ), znany z udziału w fotosyntetycznym łańcuchu transportu elektronów. Jego zredukowana forma (platochinol; PQH 2 ) wykazuje właściwości antyoksydacyjne. Liczne dane literaturowe świadczą o tym, że PQH 2 hamuje reakcję peroksydacji lipidów, jest wydajnym zmiataczem 1 i - [2]. Wiadomo także, że stan redoks puli-pq jest swoistego rodzaju czujnikiem redoks w chloroplastach i przez to inicjuje reakcje w komórce w odpowiedzi na zmiany zachodzące w środowisku (reguluje fosforylację anten LHCII poprzez aktywację kinazy zależnej od cytochromu b 6 f, fosforylację białka D1 w PSII, ekspresję genów chloroplastowych kodujących podjednostki PSI i PSII, ekspresję genów APX kodowanych w jądrze, SOD i innych enzymów). PQ jest także niezbędnym kofaktorem w biosyntezie karotenoidów, gdzie jest akceptorem elektronów w reakcji dehydrogenacji fitoenu [3]. Innym ważnym składnikiem roślinnego systemu antyoksydacyjnego jest witamina E, która jest kompleksem ośmiu naturalnie występujących związków należących do tokochromanoli. Syntetyzowane są one wyłącznie przez rośliny, glony oraz niektóre sinice [4], natomiast zwierzęta nie są zdolne do ich syntezy, dlatego pobierają je z pokarmem. Oprócz funkcji antyoksydacyjnych, tokochromanole wpływają na płynność błon, uczestniczą w przekazywaniu sygnału oraz regulują ekspresję genów, a u ssaków pełnią funkcję immunomodulacyjną, neuroprotekcyjną oraz przeciwmiażdżycową [5]. Podział tokochromanoli opiera się na liczbie oraz pozycji grup metylowych w pierścieniu aromatycznym, a także stopniu nasycenia łańcucha bocznego. Ze względu na stopień nasycenia łańcucha tokochromanole podzielono na dwie grupy: tokoferole oraz tokotrienole (posiadają w łańcuchu bocznym trzy wiązania podwójne). Ze względu na pozycję i liczbę grup Rycina 1. Budowa chemiczna tokochromanoli. metylowych w pierścieniu aromatycznym, wyróżniono cztery formy tokochromanoli: α, β, γ i δ (Ryc. 1) [5]. Do tokochromanoli zaliczany jest także plastochromanol, który jest homologiem γ-tokotrienolu, ale z dłuższym łańcuchem bocznym. Synteza tokochromanoli zachodzi we wszystkich roślinach wyższych oraz w komórkach niektórych gatunków sinic. U roślin ich synteza zachodzi w plastydach [4]. W obrębie chloroplastu tokoferole występują w otoczce chloroplastu, błonach tylakoidowych oraz w plastoglobulach (strukturach lipido-proteinowych o małej gęstości) [6]. Główną funkcją tokochromanoli jest ich działanie antyoksydacyjne zapobieganie peroksydacji lipidów błonowych oraz zapasowych, ochrona przed utlenieniem reszt tiolowych białek. Postulowany jest również udział tokochromanoli w przekazywaniu sygnału, choć większość z nich ściśle wiąże się z właściwościami antyoksydacyjnymi [5]. W komórkach roślin równowaga pomiędzy RFT a poziomem antyoksydantów jest kluczowa dla regulacji wielu procesów fizjologicznych [1]. Badania prowadzone w ramach pracy doktorskiej z jednej strony miały na celu określenie funkcji prenylolipidów chloroplastowych w roślinach poddanych działaniu stresu abiotycznego, a także dotyczyły biosyntezy tych związków. W pracy wykazano, że γ-tokoferol jest dominującym izomerem tokoferolu w siewkach i młodych liściach Postępy Biochemii 58 (4) 2012 373
fasoli. Biorąc pod uwagę fakt, że w nasionach fasoli 97% wszystkich tokoferoli stanowił α-tokoferol, uzyskane w pracy wyniki świadczą o tym, że γ-tokoferol w młodych liściach jest syntetyzowany de novo oraz, że synteza ta jest niezależna od światła. Rozmieszczenie oraz analiza ilościowa tokoferoli w obrębie hipokotylu fasoli wskazuje na to, że konwersja γ-tokoferolu w formę α jest również niezależna od światła, a ponadto, że część γ-tokoferolu jest degradowana do produktów niechromanolowych. Analiza lokalizacji wewnątrzchloroplastowej poszczególnych homologów tokoferoli w młodych liści fasoli wykazała, że γ-tokoferol występuje głównie w tylakoidach, podczas gdy α-tokoferol jest zlokalizowany poza tylakoidami, w plastoglobulach, co sugeruje, że γ-tokoferol może pełnić w tylakoidach specyficzną funkcję. Tokoferylochinony powstają jako produkty utleniania tokoferoli zarówno w warunkach in vitro jak też in vivo [2]. W czasie stresu suszy i działania silnego światła w młodych liściach fasoli następowała akumulacja γ-tq, natomiast α-tq gromadził się pod wpływem stresu chłodu z następującym po nim stresem świetlnym. Wskazuje to na inny mechanizm utleniania obu tokoferoli pod wpływem zastosowanych warunków stresowych. Obserwowana w pracy, akumulacja γ-tq w młodych liściach fasoli poddanych stresowi su- szy świadczy o udziale γ-tokoferolu w mechanizmach ochronnych w czasie odwodnienia. W pracy wykazano, że γ-tokoferol jest bardziej skuteczny niż α-tokoferol w zapewnianiu liściom i nasionom tolerancji na suszę. Wpływ wysokiego natężenia światła na poziom lipidów prenylowych w liściach Arabidopsis thaliana Z wykorzystaniem techniki HPLC wykazano po raz pierwszy, że w czasie fotoaklimatyzacji w liściach Arabidopsis wzrasta wielokrotnie poziom PQH2-9. Uzyskane wyniki dobitnie pokazują, że akumulacja PQH2-9 jest procesem niezależnym od obecności tokoferoli i, że większość powstającego PQH2-9 znajduje się poza tylakoidami, w plastoglobulach, gdzie znajduje się fotochemicznie nieaktywna frakcja PQH2-9 (Ryc. 2). Wysoki stopień redukcji tej frakcji PQ-9 związany jest z tym, że pierwotną formą biosyntezy PQ-9 jest PQH2-9. Prawdopodobnie, PQ-9 w plastoglobulach powstaje w wyniku nieezymatycznego utleniania PQH2-9 przez obecne w stromie RFT. W mojej pracy wykazałam, że rozmiar i ilość plastoglobul wzrasta pod wpływem różnych warunków stresowych, takich jak silne światło (Ryc. 2). Uzyskane wyniki sugerują, że plastoglobule są miejscem tymczasowego przechowywania Rycina 2. Obrazy z mikroskopu elektronowego chloroplastów Arabidopsis WT rosnących w warunkach słabego światła (lewa strona) oraz silnego światła (prawa strona). Pg plastoglobule; S ziarna skrobi [według 6]. 374 PQH2-9, który może dyfundować do tylakoidów, gdzie pełni rolę antyoksydantu. Gdy cząsteczki PQH2-9 w tylakoidach zostaną nieodwracalnie utlenione przez generowane tam RFT, mogą być one zastąpione przez inne cząsteczki PQH2-9 pochodzące z plastoglobul, ponieważ plastoglobule są strukturalnie połączone z tylakoidami. W pracy po raz pierwszy wykazałam, że plastochromanol (PC) jest naturalnym składnikiem liści Arabidopsis thaliana oraz udowodniłam, że jest on syntetyzowany z PQH2-9 przez cyklazę tokoferolu, ponieważ mutant pozbawiony tego enzymu (vte1) nie posiadał także PC. Dane te uzyskano analizując skład lipidów prenylowych mutantów Arabidopsis. Co więcej, wyniki te potwierdzono w trakcie doświadczeń z zastosowaniem rekombinantowej cyklazy, która w warunkach in vitro przekształcała PQH2-9 do PC. Uzyskane w obecnej pracy wyniki pozwoliły na zaproponowanie schematu biosyntezy PC (Ryc. 3). Frakcjonowanie chloroplastów pozwoliło ustalić, że większość plastydowego PC zlokalizowana jest w plastoglobulach, niewielka część zasocjowania jest z tylakoidami, natomiast w otoczce chloroplastowej PC występuje w znikomych ilościach. Obecność PC w liściach Arabidopsis sugeruje, że związek ten może pełnić podobną funkcję jak tokoferole czy PQH29, zwłaszcza w nasionach i starszych liściach. O antyoksydacyjnych właściwościach PC może świadczyć także fakt, że związek ten występuje w liściach mutanta vte2, u którego brak fizjologicznych symptomów niedoboru tokoferoli może być spowodowany działaniem antyoksydacyjnym PC, który rekompensuje niedobór innych antyoksydantów lipidowych. Interesujące jest, że poziom PC nie wzrastał wraz z zawartością PQH2-9 pod wpływem silnego światła w liściach Arabidopsis WT i mutanta vte4, natomiast jego zawartość wzrastała wraz z wiekiem roślin rosnących w warunkach niskiego natężenia światła. Efekt ten wyraźnie wskazuje, że PC nie jest syntetyzowany jako produkt uboczny działania TC, lecz jego synteza przebiega specyficznie z PQH2-9, głównie w czasie starzenia się roślin. Jednak, www.postepybiochemii.pl
Rycina 3. Biosynteza plastochromanolu [według 6]. mechanizm tego zjawiska nie został jeszcze poznany. Oprócz wykrycia i poznania biosyntezy PC u Arabidopsis, doświadczenia przeprowadzone w ramach pracy doktorskiej doprowadziły do identyfikacji hydroksy-plastochromanolu (PC-OH) jako nowego związku występującego u roślin. Dotychczas, nie wyznaczono pozycji grupy -OH w cząsteczce nowoodkrytego związku, jednak z pewnością jest ona zlokalizowana w izoprenoidowym łańcuchu bocznym, a nie w pierścieniu chromanolowym, ze względu na identyczne własności spektralne PC i badanej pochodnej tego związku. Biorąc pod uwagę fakt, że reakcja utleniania przez 1 nie jest reakcją enzymatyczną, to teoretycznie każde z podwójnych wiązań obecnych w cząsteczce PC może być utlenione i w ten sposób może powstać mieszanina izomerów PC-OH. Wstępna analiza frakcji PC-OH na kolumnie z normalną fazą wykazała obecność 8 izomerów tego związku. PC-OH został zidentyfikowany w układzie in vitro jako produkt utlenienia PC w czasie wygaszania 1. Identyfikacja PC- -OH w liściach Arabidopsis wskazuje, że taka reakcja ma miejsce in vivo oraz że funkcją PC w liściach może być wygaszanie i zmiatanie 1 generowanego w obrębie PSII w czasie stresu świetlnego. Ponadto hipotezę tę poparł fakt, że PC-OH nie występował w nasionach, gdzie 1 nie jest wytwarzany. Powstawanie PC-OH jako produktu utleniania PC przez 1 lub inne RFT, sugeruje również zdecydowanie wyższy poziom tego związku w roślinach rosnących w silnym świetle. PC- -OH tworzy się także w liściach rosnących w warunkach słabego światła, gdzie produkcja RFT jest niska. W związku z tym nie jest wykluczone, że PC- -OH może tworzyć się także w wyniku enzymatycznego utleniania PC przez niezidentyfikowaną jak dotychczas oksydazę. PC-OH może być także antyoksydantem, ze względu na obecność pierścienia chromanolowego. Potwierdzeniem tego przypuszczenia są wyniki doświadczeń polegające na utlenianiu PC przez 1 w warunkach in vitro gdzie wykazano, że oprócz hydroksylowych pochodnych PC, tworzył się również homolog 8-hydroperoksy-γtokoferonu, związek analogiczny do tego, który powstaje w czasie reakcji γ-tokoferolu z 1. Wpływ stresu świetlnego na zawartość lipidów prenylowych w liściach Arabidopsis U roślin hodowanych przez okres 3 dni w silnym świetle (400 µmoli fotonów/m 2 /s) pula związków o charakterze antyoksydacyjnym wzrastała podobnie jak w czasie długotrwałej fotoaklimatyzacji. Efekt ten w obu przypadkach jest wynikiem stopniowej syntezy lipidów prenylowych jako odpowiedzi na powstały stres oksydacyjny. Jednak gdy stres świetlny jest wywołany światłem o znacznie wyższym natężeniu (2000 µmoli fotonów/m 2 /s), powoduje to szybki spadek poziomu lipidów prenylowych. W warunkach tych synteza nie nadąża za konsumpcją antyoksydantów lipidowych w zaistniałych warunkach i roślina musi korzystać głównie z zapasu antyoksydantów, które aktualnie posiada. W liściach Arabidopsis WT oraz we wszystkich analizowanych mutantach największy spadek miał miejsce w przypadku PQH 2-9. Po infiltracji liści ciężką wodą, w której czas życia 1 jest wydłużony i naświetlaniu silnym światłem poziom α-tokoferolu oraz PQH 2-9 jeszcze szybciej spadał. Dowodem na antyoksydacyjne działanie tych związków jest powstawanie produktów ich utlenienia, odpowiednio α-tq oraz PQ-C. Nieznaczny spadek pozostałych prenylolipidów sugeruje, że pełnią one w tych warunkach funkcję pomocniczą. Mając na uwadze dane literaturowe oraz rezultaty moich badań, można z całą pewnością stwierdzić, że PQH 2-9 stanowi pierwszą linię obrony w chloroplastach przed destrukcyjną działalnością RFT. Udział cyklazy tokoferolu w biosyntezie tokochromanoli badania in vitro Cyklaza tokoferolu (VTE1; TC) katalizuje w chloroplastach reakcję cyklizacji MPBQ do δ-tokoferolu i DMPBQ do γ-tokoferolu. Jak wykazały wcześniej zaprezentowane badania, enzym ten in vivo uczestniczy także w biosyntezie PC z PQH 2-9. Badania przeprowadzone w pracy, dotyczące specyficzności TC w układzie in vitro potwierdziły, że substratem dla TC może być DMP- BQ, gdzie powstawał γ-tokoferol oraz PQH 2-9, w wyniku czego tworzył się PC. Powstawanie PC przy udziale sklonowanej cyklazy w układzie in vitro potwierdza wcześniej przedstawione hipotezy badań in vivo, które wykazały, że PC powstaje z PQH 2-9 pod wpływem enzymu szlaku biosyntezy tokoferoli TC. Niewielka wydajność reakcji syntezy PC obserwowana w obecnych badaniach in vitro prawdopodobnie Postępy Biochemii 58 (4) 2012 375
wynika z wysokiej hydrofobowości substratu (PQH 2-9), a co za tym idzie, słabej dostępności dla enzymu. Przypuszczenia te może potwierdzać fakt, że spośród wszystkich stosowanych substratów, dla PQH 2-9 zanotowano najniższy spadek stężenia w czasie oraz nie wykryto utlenionej formy substratu jako produktu reakcji. TC wykazywała także aktywność wobec plastochinonów o krótszym łańcuchu bocznym (PQH 2-2 i PQH 2-4), a ponadto dla substratów tych obserwowano powstawanie form utlenionych. Sugeruje to podwójną funkcję enzymu, katalizowanie reakcji cyklizacji oraz reakcji utleniania. Pomimo tego, że TC w warunkach in vivo katalizuje reakcję cyklizacji MPBQ do δ-tokoferolu, to in vitro taka reakcja nie zachodziła. Uzyskane w pracy wyniki przyczyniły się do lepszego zrozumienia funkcji lipidów prenylowych i rzuciły nowe światło na rolę plastochinolu i homologów witaminy E w odpowiedzi na warunki stresowe. Co więcej, badania prowadzone w pracy pozwoliły na odkrycie nowych związków należących do grupy prenylolipidów i poznania szlaku ich biosyntezy. Piśmiennictwo 1. Szymańska R, Strzałka K (2010) Reaktywne formy tlenu w roślinach: powstawanie, dezaktywacja i rola w przekazywaniu sygnału. Postepy Biochem 55: 182-190 2. Kruk J, Trebst A (2008) Plastoquinol as a singlet oxygen scavenger in photosystem II. Biochim Biophys Acta 1777: 154-162 3. Nowicka B, Kruk J (2010) Occurrence, biosynthesis and function of isoprenoid quinones. Biochim Biophys Acta 1797: 1587-1605 4. Munne-Bosch S (2005) The role of a-tocopherol in plant stress tolerance. J Plant Physiol 162: 743-748 5. Szymańska R, Nowicka B, Kruk J (2009) Witamina E metabolizm i transport. Kosmos 58: 199-210 6. Szymańska R, Kruk J (2010) Plastoquinol is the main prenylolipid synthesized during acclimation to high light conditions in Arabidopsis and is converted to plastochromanol by tocopherol cyclase. Plant Cell Physiol 51: 537-545