Prof. dr hab. inż. Bogusław Król Zakład Analizy i Technologii Żywności Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej Łódź, 15 lipca 2013r. R e c n z j a r oz p r a w y d o k t o r s k i e j Recenzja, przedłożonej rozprawy doktorskiej Pani Mgr AGATY SARNIAK pt,, Badanie wybuchu oddechowego i mitochondrialnej produkcji reaktywnych form tlenu metodą chemiluminescencji, wykonanej w Zakładzie Fizjologii Ogólnej, Katedry Fizjologii Doświadczalnej i Klinicznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi składa się z oceny poniższych elementów: 1.Wybór i znaczenie tematu rozprawy 2.Bibliogafia i znajomości literatury 3.Uklad pracy i wymagania formalne 4. Zastosowana metodyka badań 5.Sposób rozwiązania problemu naukowego i wnioskowanie 6. Ocena końcowa Ad 1.Temat rozprawy jest związany z dwoma uniwersalnymi zagadnieniami: po pierwsze funkcjonowaniem organizmów żywych jako samoutrzymujących się układów, w których w sposób ciągły zachodzi złożony proces przekształcania różnych postaci energii. Drugim powszechnym zagadnieniem jest rola analityki chemicznej w opisaniu i poznaniu materii i przyrodniczych zjawisk, a w tym homeostazy oraz znaczenia reaktywnych form tlenu, jako niestabilnych indywiduów chemicznych uczestniczących w reakcjach chemicznych wpływających na metabolizm, funkcjonowanie oraz starzenie się organizmów żywych. Badania ostatniego trzydziestolecia dostarczyły wiele danych o właściwościach RFT, możliwości śledzenia ich przemian, powstawania wtórnych produktów reakcji oraz wpływie RFT na destrukcyjne i obronne procesy w organizmach ludzi i zwierząt. Autorka w rozprawie doktorskiej podjęła zadanie weryfikacji wykorzystania testu lumiforozależnej chemiluminescencji krwi pełnej do monitorowania powstawania RTF w trakcie wybuchu oddechowego oraz do monitorowania mitochondrialnej produkcji RFT, uzależnionej od
zastosowanych inhibitorów łańcucha oddechowego.zaplanowane badania doświadczalne miały na celu poszerzenie wiedzy o wykorzystaniu zjawiska chemiluminescencji jako narzędzia metodycznego w prognostycznych badaniach laboratoryjnych, opartych na zmienności intensywności produkcji RTF, w szczególności, przez granulocyty obojętnochlonne w trakcie wybuchu oddechowego. W badaniach wykorzystano Luminometr 1251, firmy Bio-Orbit Oy z Finlandii i zastosowano zaplanowane procedury biomedyczne, oparte na wykorzystaniu do badań próbek krwi, osocza i granulocytów oraz luminolu i lucygeniny, jako luminoforów chemiluminescencji spoczynkowej, a także fmlp i PMA jako aktywatorów (stymulatorów) produkcji RFT w pomiarach chemiluminescencji wymuszonej. Praca ma dużą wartość poznawczą i praktyczną w zakresie analityki biomedycznej a w szczególności w odniesieniu do uwarunkowań pomiarów intensywności powstawania RFT w granulocytach obojętnochłonnych. Doktorantka podjęła się bardzo trudnego i ważnego zagadnienia naukowego. Ad 2.Ocena bibliografii i znajomości literatury Bibliografia pracy liczy 205 pozycji literaturowych, związanych ściśle z tematyką badań, w tym 203 cytowanych prac naukowych, opublikowanych w języku angielskim i dwie polskie pozycje książkowe, w tym monografia Prof. G. Bartosza pt,, Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie, opublikowana przez wydawnictwo PWN w roku 2008.Wiekszość artykułów została opublikowana w ostatnim piętnastoleciu. Nadto dziesięć pozycji pochodzi z lat 2012-2013, a dwanaście z przed roku 1990.Świadczy to o znacznej atrakcyjności, aktualności i wagi podjętego tematu. Wykorzystanie cytowanych pozycji literaturowych w części teoretycznej i dyskusji wyników jest należyte. Jednak autorka nie ustrzegła się wady jaką jest przypisywanie wielu odsyłaczy do złożonej kwestii poruszonej w jednym zdaniu. Ad.3.Układ pracy i wymagania formalne Praca przedłożona do recenzji zawiera 145 stron tekstu łącznie ze spisem literatury. Układ pracy jest zgodny z wymaganiami pisania rozpraw, opartych na podziale rzeczowym. Praca składa się z wstępu wraz z przeglądem piśmiennictwa (30 stron), uzasadnienia podjęcia badań i celu pracy, materiałów i metod (17stron), wyników (45 stron), omówienia wyników i dyskusji (20stron), wniosków, spisu rycin i tabel oraz streszczenia wraz z abstraktem w języku angielskim 37 ( stron). Wyniki badań są zebrane w 18 tabelach i przedstawione na 34
rycinach. We wstępie Doktorantka przedstawiła podstawowe określenia i definicje oraz opisała źródła reaktywnych form tlenu (RFT), ich powstawanie oraz rolę w wybuchu oddechowym fagocytów. Następnie szczegółowo scharakteryzowała oksydazę NADPH i opisała budowę mitochondrialnego łańcucha oddechowego, wraz z oddziaływaniem inhibitorów na jego funkcjonowanie. Krótko opisane zostało zjawisko chemiluminescencji, zaś szerzej przestawiono mechanizm działania i zastosowanie luminolu i lucygeniny w pomiarze RFT uwalnianych w wybuchu oddechowym. Szkoda, że Autorka nie opisała alternatywnych metod pomiaru stężenia uwalnianych RFT, a zwłaszcza anionorodnika ponadtlenkowego, oznaczanego np. metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPA) lub metodą sonoluminescencji. W tej części pracy są nieścisłości i drobne błędy, wskazane w pracy. Dla przykładu Doktorantka we wprowadzeniu, na stronie 1 przedstawiła nie zbyt udaną charakterystykę RFT. Zastrzeżenie może budzić użyte pojęcie reaktywnych molekuł zamiast indywiduów chemicznych oraz wskazanie zbyt daleko idącej koegzystencji pomiędzy organizmami a,, niebezpiecznymi cząsteczkami. W miejsce ogólnych rozważań należało wskazać najważniejsze cechy RFT i ich udział w regulacji funkcji komórki i wpływie na przebieg procesów fizjologicznych.w dalszej teoretycznej części pracy zagadnienie powstawania RFT, ich roli w organizmie, zwłaszcza ich produkcję i przemiany w trakcie wybuchu oddechowego fagocytów, Autorka przedstawiła poprawnie i w przystępny sposób. Jednakże, w tekście zbyt często występuje manieryczne sformułowanie,,skutkuje powstawaniem. W opinii recenzenta opis chemiluminescencji należało poprzedzić wyjaśnieniem zjawiska luminescencji. Luminescencja to właściwość fizyczna substancji do emitowania światła po wcześniejszym zaabsorbowaniu dawki energii pochodzącej z innego źródła niż ciepło. Luminescencja jest optycznym promieniowaniem, powstającym w trakcie przejścia z wyższego stanu wzbudzenia cząsteczki do podstawowego. Emisja zanika natychmiast po zakończeniu wzbudzenia. Luminescencję można podzielić m.in., na : bioluminescencję, chemiluminescencję, foto-, radioluminescencje, fluorescencję. Bio- i chemiluminescencja są zatem zjawiskami emisji promieniowania, wytworzonego, w wyniku, odpowiednio, niektórych procesów biologicznych lub niektórych reakcji chemicznych. Z pośród RFT jedynie tlen singletowy osiąga nietrwały stan wzbudzenia, po czym powraca do stanu podstawowego jako tlen tripletowy, emitując promieniowanie świetlne. Dodanie charakterystyki zjawiska luminescencji znacznie ułatwiłoby interpretacje uzyskanych wyników badań. Drobne uchybienia: ryc 8 brak na schemacie zapisu uwolnionej cząsteczki azotu, oraz mieszane angielskie i polskie nazewnictwo substancji chemicznych.
W uzasadnieniu podjęcia badań Doktorantka podkreśliła powszechność badanego zjawiska i znaczenie stresu oksydacyjnego w diagnostyce biomedycznej zwłaszcza z wykorzystaniem chemiluminescencji zależnej od dwóch najczęściej stosowanych luminoforów. Wskazała także potrzebę prześledzenie mitochondrialnej produkcji RFT w trakcie wybuchu oddechowego neutrofili z uwzględnieniem wybranych inhibitorów łańcucha oddechowego. Zakres pracy z punktu widzenia analitycznego i specyfiki badań został sprecyzowany w pięciu punktach opisujących sukcesywny model badania zjawiska chemiluminescencji przed i po zastosowaniu odpowiednich bodźców w układzie pomiarowym. Materiały i metody zastosowane w badaniach zostały dokładnie opisane na 17 stronach. Odczynniki i roztwory zostały przedstawione z podaniem źródła lub w powołaniu się na odpowiednią pozycję literaturową. W przypadku substancji należało podać statusu czystości, a nie jedynie producenta. Sposób przeprowadzenia doświadczeń dotyczących zakresu wymienionego w celu pracy jest dokładnie przedstawiony. Przygotowanie krwi i jej składników do badan jest szczegółowo opisane z powołaniem się na dokument źródłowy. W przypadku oznaczeń z użyciem krwi pełnej brakuje opisu postępowania, który określono jako,,dokładne napowietrzenie. Wyodrębnianie frakcji granulocytów jest żmudną procedurą, która wydłuża znacznie czas postępowania analitycznego i uzyskania wyniku końcowego. Można postawić pytania 1), czy taki sposób jest właściwy dla monitoringu i 2) czy procedury izolowania granulocytów, opracowanej przed blisko 50-laty, nie należałoby ulepszyć i skrócić? Testy chemiluminescencji pełnej krwi były wykonane według metodyki zaczerpniętej z danych literaturowych z dopiskiem, po wprowadzeniu modyfikacji własnych. Powstaje pytanie czego dotyczyły. Pomiary chemiluminescencji badanych próbek prowadzono z zastosowaniem specjalistycznego luminometru z odpowiednim oprogramowaniem i urządzeniem współpracującym, co daje podstawę do uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników analiz. Liczba 8-12 powtórzeń pomiarów jest typowa dla materiału biologicznego. Wyniki analiz poddano jednoczynnikowej analizie statystycznej w oparciu o analizę wariancji ANOVA i odpowiednich testów weryfikujących. Rozdział WYNIKI jest podzielony w logiczny sposób na podrozdziały według zaplanowanej kolejności i zgodnie z zakresem pracy. Wyniki badań, dotyczące różnych parametrów chemiluminescencji zależnej od luminolu lub luminolu i lucygeniny po aktywacji ( stymulacji) fmlp, a niekiedy PMA, są przedstawione w postaci estetycznych
rysunków, prawidłowo opisanych z wyszczególnieniem stwierdzonych statystycznie istotnych różnic dla populacji n=8-10. Rysunkom towarzyszą przykładowe wykresy ilustrujące dynamikę pomiaru chemiluminescencji, przed i po dodaniu stymulatora produkcji RFT, zarejestrowanej przez luminometr w czasie 10 minut w odniesieniu do konkretnej serii doświadczeń. Wykresy kształtem przypominają krzywą Gausa i są podobne do wykresów rejestrowanych przez fotometry w metodzie FIA ( przepływowo- nastrzykowej analizie). Wykresy w obydwu metodach są podobnie interpretowane przez obliczenie powierzchni pod krzywą, maksymalnej wartości sygnału oraz czasu jego wystąpienia. W pomiarach chemiluminescencji dodatkowo występuje względnie wysoka wartość chemiluminescencji podstawowej (spontanicznej), która utrudnia interpretacje wyniku. Z tego powodu oraz biorąc pod uwagę dynamikę tworzenia RFT, można przypuszczać, że głównymi parametrami różnicującymi mogą być wielkości :przyrost chemiluminescencji całkowitej (tzw. chemiluminescencja zredukowana) oraz czas wystąpienia sygnału maksymalnego. W pracy w odniesieniu do wykonanych serii pomiarów sporządzano tabelę porównawczą zawierającą parametry chemiluminescencji zależnej od luminolu lub chemiluminescencji zależnej od luminolu i lucygeniny. W przypadku badania chemiluminescencji krwi pełnej uzyskano zadowalające wyniki dotyczące przydatności diagnostycznej pomiarów przyrostu całkowitej chemiluminescencji zależnej od luminolu dla określonej objętości badanej próbki krwi( 30μl) oraz czasu inkubacji 90 min. Podobnie korzystne wyniki uzyskano dla przyrostu chemiluminescencji całkowitej zależnej od lucygeniny w przypadku neutrofilii aktywowanych rozcieńczonym roztworem cyjanku potasu oraz w doświadczeniach z użytymi inhibitorami łańcucha oddechowego oraz apocyniny jako inhibitora NADPH oksydazy.wszystkie wyniki, zamieszczone na rycinach i w tabelach, zostały skomentowane z uwzględnieniem występujących statystycznie istotnych różnic. Rozdział OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW jest podzielony w logiczny sposób na podrozdziały według zaplanowanej kolejności i zgodnie z zakresem pracy. Autorka w części dotyczącej chemiluminescencji jako miernika oksydatywnej aktywności fagocytów wskazała, ze jest to metoda zalecana do stosowania przez WHO do kontroli stanu odporności nieswoistej. Jednakże oznaczenie poszczególnych RFT, zwłaszcza wolnych rodników, jest bardzo trudne ze względu na ich niezwykle krótki czas istnienia, reaktywność i podatność na działanie niektórych enzymów.aktualność tego zagadnienia podnoszą obecnie dość liczne publikacje w tym względzie. Badania Doktorantki potwierdzają zalety stosowania luminolu jako najczulszego i powszechnie stosowanego luminoforu w teście wymuszonej
chemiluminescencji zarówno krwi jak i granulocytów. Wykazane w rozprawie blisko dwukrotnie niższe wartości wymuszonej chemiluminescencji zredukowanej, zależnej od lucygeniny w porównaniu do luminolu mogą być rozpatrywane jako sumaryczny efekt RFT, ze względu na zastosowany okres pomiarowy, naturę mechanizmów wzbudzenia obydwu luminoforów, oraz utrzymywane warunki reakcji w badanym układzie- bez wykluczenia działania dysmutazy ponadtlenkowej. Świeżo opublikowane dane wskazuję na możliwość selektywnego oznaczenia anionorodnika ponadtlenkowego z użyciem metylocyprydyny i zastosowaniem analizatora do ultra słabej chemiluminescencji. W tej części rozprawy w ferworze dyskusji Doktorantka użyła sformułowań typu,,wyniki naszych badań, co wskazywałoby na przyzwyczajenie do realizacji badań zespołowych.. Ad 4 Ocena zastosowanej metodyki badań Autorka wykazała się bardzo dobrym opanowaniem różnorodnych technik analitycznych, w tym biomedycznych, poczynając od jej analizy morfologicznej i pomiaru podstawowych parametrów, frakcjonowanie na osocze bogato- i ubogopłytkowe po wyodrębnianie granulocytów obojętnochłonnych. Podstawowy nurt badań dotyczył wykorzystania luminometru do pośredniego oznaczania RFT we krewi pełnej i neutrofilach, pochodzących od zdrowych dawców, przez zastosowanie dwóch wybranych luminoforów i dwóch aktywatorów fagocytozy. Kolejnym doświadczeniem analitycznym było prześledzenie mitochondrialnej produkcji RFT po zastosowaniu określonych inhibirów łańcucha oddechowego co ma ważne znaczenie do ustalenia najkorzystniejszych warunków wykonania testu chemiluminescencji do ewentualnego rozszerzenia jego stosowania w diagnostyce medycznej. Zastosowane metody są wyjątkowo złożone i czasochłonne, wymagały dużego nakładu pracy, ale pozwoliły na osiągnięcie dobrych rezultatów w doświadczeniach. Metody analityczne były właściwie dobrane, a ich wyniki poddane należytej ocenie statystycznej..część metodyczna jest wartościowym osiągnięciem analitycznym Autorki. Ad.5.Sposób rozwiązania problemu naukowego i wnioskowanie Przedmiotem badań zgodnie z tematem rozprawy było zbadanie wybuchu oddechowego i mitochondrialnej produkcji RFT metodą chemiluminescencji zależnej od dwóch luminoforów z wykorzystaniem wybranych inhibitorów łańcucha oddechowego. Krew i jej pochodne oraz substancje pomocnicze i ich roztwory zostały prawidłowo dobrane. Na licznym materiale doświadczalnym i wielkiej liczbie próbek Autorka wykonała badania wymuszonej
chemiluminescencji zależnej od luminolu i lucygeniny w odniesieniu do pełnej krwi i neutrofili, wyznaczając na tej podstawie 5-6 podstawowych parametrów, przeprowadzonych testów. W oparciu o badania statystyczne wykazano, że przyrost całkowitej chemiluminescencji krwi pełnej, po określonym czasie inkubacji, jest najlepiej przystającym parametrem, charakteryzującym stan oksydacyjny podwyższony przez zastosowanie fmlp, jako stymulatora RFT. W aspekcie analitycznym badania zostały przeprowadzone prawidłowo. Badanie inhibitorów wybranych elementów łańcucha oddechowego granulocytów obojętnochlonnych wykonywano głównie w celu określenia ich skuteczności oddziaływania na aktywne centra. Wyniki oddziaływania rotenonu, inhibitora dehydrogenazy NADH, który blokuje przepływ elektronów pomiędzy ubichinonem a centrum żelazowo-siarkowym i powoduje zmniejszenie produkcji anionorodnika ponadtlenkowego mogą mieć inspirujące znaczenie w badaniach bezpieczeństwa stosowania insektycydów. W badaniach Autorki rotenon, użyty w bardzo niskim stężeniu istotnie obniżał wszystkie podstawowe parametry chemiluminescencji zależnej od lucygeniny w porównaniu do granulocytów nie poddanych działaniu inhibitora. Rotenon jest naturalnym insektycydem, otrzymywanym z klębianu, o silnych właściwościach toksycznych w stosunku do ryb. W związku z z tym bywa stosowany do ich wybijania, a mniejszych dawkach do odławiania. Ponieważ rotenon jest słabo wchłaniany w przewodzie pokarmowym człowieka, spożywanie potrutych ryb wydawało się względnie bezpieczne. W badaniach na zwierzętach okazało się jednak, że zaburzenia jedynie w obrębie kompleksu oddechowego w mitochondrium mogą prowadzić do występowania anatomicznych, neurochemicznych i behawioralnych charakterystyk choroby Parkinsona. Duża wartość poznawcza mają badania dotyczące zbadanego wpływu oddziaływania apocyniny (4-hydroksy-3-metoksyacetofenonu), inhibitora oksydazy NADPH na obniżanie podstawowych parametrów spoczynkowej i wymuszonej chemiluminescencji granulocytów obojętnochłonnych. Jest to interesujące i ważne, jeżeli weźmie się pod uwagę oddziaływanie polifenoli pokarmowych i ich metabolitów na funkcjonowanie organizmu człowieka. Rozprawa zawiera osiem szczegółowych wniosków, które w aspekcie analitycznym są zgodne z celem i zakresem rozprawy. Największa wartość naukową ma rozprawa w zakresie wykazania, że apocynina jest nie tylko inhibitorem oksydazy NADPH w komorkach fagocytów, ale działa jako zmiatacz wolnych RFT w komórkach oraz istotnie hamuje uwalnianie RFT z łańcucha oddechowego..