dr hab. Ewa Obłąk, prof. nadzw. Instytut Genetyki i Mikrobiologii Uniwersytet Wrocławski Wrocław, 12.09.2017r. Ocena pracy doktorskiej mgr Urszuli Nataoskiej pt."funkcja i lokalizacja wewnątrzkomórkowa Hsp31p, białka odpowiedzi na wiele stresów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae" wykonanej pod kierunkiem dr hab. Marka Skonecznego. Przedstawiona do recenzji praca doktorska mgr Urszuli Nataoskiej dotyczy określenia funkcji oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka Hsp31p z komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae i jest kontynuacją wieloletnich badao naukowych prowadzonych przez dr hab. Marka Skonecznego z Zakładu Genetyki, Instytutu Biochemii i Biofizyki, PAN w Warszawie. Badania te były finansowane z grantu NCN 2011/01/B/NZ3/02904. Białko Hsp31p z komórek drożdży S. cerevisiae należy do rodziny białek DJ-1/ThiJ/PfpI, które występują zarówno w komórkach organizmów prokariotycznych jaki i eukariotycznych, ale są nadal słabo poznane. Do tej pory wiadomo było, że Hsp31p jest białkiem istotnym do przeżycia drożdży w stacjonarnej fazie wzrostu oraz chroni komórkę przed stresem oksydacyjnym. Hsp31p jest ortologiem ludzkiego białka DJ-1, którego dysfunkcja u ludzi powoduje dziedziczną postad choroby Parkinsona - na którą choruje obecnie 2% populacji ludzkiej powyżej 65 roku życia. Jest to poważny problem medyczny. Dlatego też w wielu laboratoriach na świecie wzrosło zainteresowanie funkcją białka Hsp31p S. cerevisiae (ortologa ludzkiego DJ-1) - ze względu na badania nad chorobą Parkinsona. Można założyd, że wyniki badao dotyczących Hsp31p uzyskane na modelowym organizmie eukariotycznym jakim są drożdże Saccharomyces cerevisiae będą miały odniesienie do wyższych eukariontów, w tym człowieka. Praca doktorska mgr Urszuli Nataoskiej została przedłożona do recenzji w formie maszynopisu liczącego 145 stron wraz ze spisem literatury liczącym 194 pozycje piśmiennictwa i stanowi typowe opracowanie o charakterze eksperymentalnym. Układ pracy, poza streszczeniem w języku polskim i angielskim, wykazem stosowanych w pracy skrótów, spisu tabel, rysunków oraz spisem literatury, obejmuje dodatkowo sześd rozdziałów: Wstęp, Cel
pracy, Materiały, Metody, Wyniki i Dyskusję. W pracy zamieszczono 12 tabel i 33 rysunki, z czego 4 tabele i 29 rysunków stanowią dokumentację wynikową. Tytuł ocenianej rozprawy odzwierciedla jej treści, cele i zakres prowadzonych badao. Szata graficzna pracy jest bardzo staranna i przejrzysta. Cytowania pozycji bibliograficznych w tekście pracy są prawidłowe. Wstęp pracy obejmujący 14 stron i podzielony na trzy podrozdziały jest napisany przejrzystym językiem naukowym. Dobór zagadnieo omawianych we "Wstępie" pracy jest dobrze przemyślany i ściśle związany z prezentowanymi w dalszych rozdziałach wynikami własnymi Autorki. Opierając się na najnowszej literaturze światowej Doktorantka przedstawiła we Wstępie dotychczasowy stan wiedzy dotyczącej różnych stresów środowiskowych, z jakimi zmagad się mogą drożdże. Następny podrozdział Wstępu jest poświęcony białkom należącym do rodziny DJ- 1/ThiJ/PfpI. Szczególnie istotne jest białko DJ-1, występujące w komórkach ludzkich, które chroni komórkę przed stresem oksydacyjnym, pełni funkcję chaperonową i ma aktywnośd proteazy. Zaangażowanie tego białka w różne procesy powoduje, że jego nieprawidłowe działanie powiązano z szeregiem chorób takich jak: procesy nowotworowe, cukrzyca typu II, zawał, choroby neurodegeneracyjne (choroba Parkinsona). Dane literaturowe donoszą, że delecja w genie kodującym białko DJ-1 oraz mutacja nonsensowna w kodonie dla leucyny 166 są związane z rozwojem choroby Parkinsona. W warunkach podstawowych DJ-1 jest zlokalizowane w cytoplazmie komórki, natomiast w warunkach stresu oksydacyjnego jest umiejscowione w mitochondriach oraz w jądrze. Jego drożdżowy ortolog - białko Hsp31p jest również zaangażowane w ochronę komórki przed stresem oksydacyjnym oraz stresem wywołanym ciśnieniem hydrostatycznym. Niedawno przypisano mu także aktywnośd chaperonową ora zaktywnośd glioksalazy odpowiedzialnej za detoksyfikację toksycznego metabolitu metyloglioksalu. Ortolog Hsp31p występuje także w komórkach Candida albicans - jest to białko Glx3. Podobieostwo sekwencji aminokwasowej tych białek wynosi 62% - to może wskazywad, że ich rola komórkowa jest zbliżona. Wykazano, że zlokalizowane periplazmatycznie białko Glx3 odgrywa rolę w ochronie komórki przed stresem oksydacyjnym, posiada aktywnośd glioksalazy III. Glx3 może uczestniczyd w patogenezie C. albicans, dlatego też jest ono ważne z punktu widzenia medycyny. Badania białka Hsp31p drożdży mogą tworzyd nowe możliwości walki z trudnymi do zwalczenia infekcjami grzybiczymi.
Bez wątpienia, częśd teoretyczna rozprawy prezentuje wysoki poziom merytoryczny i świadczy o znajomości zagadnieo związanych z tematem rozprawy. A przedstawione we Wstępie informacje w sposób przekonywujący uzasadniają celowośd podjętych przez Doktorantkę badao. Cel pracy został jasno sformułowany - chodziło o wyjaśnienie roli białka Hsp31p w komórce drożdży S. cerevisiae, ustalenie systemów regulacyjnych jakim podlega gen HSP31 oraz lokalizacji Hsp31p w komórce w warunkach podstawowychoraz w warunkach działania różnych stresów środowiskowych - co może przybliżyd poznanie jego funkcji, a tym samym funkcji innych białek - ortologów Hsp31 - istotnych w medycynie, takich jak ludzkiego DJ-1 oraz Glx3 z C. albicans. W rozdziale "Materiały" Autorka szczegółowo wymienia w Tab. 2-6 wykorzystane w badaniach szczepy drożdżowe i bakteryjne, plazmidy, startery oraz stosowane podłoża mikrobiologiczne i odczynniki. Autorce należy się uznanie za szeroki zakres prowadzonych badao, z wykorzystaniem nowoczesnych technik genetycznych i biologii molekularnej. Stosowane procedury zostały opisane w części metodycznej rozprawy (36 protokołów) i świadczą o bardzo dobrym przygotowaniu warsztatowym Doktorantki. Metody te zostały prawidłowo dobrane do postawionych zadao badawczych. Zamieszczony w tym rozdziale opis przeprowadzenia eksperymentów jest bardzo precyzyjny i z całą pewnością pozwala na ich odtworzenie. Rozdział poświęcony omówieniu wyników liczy 47 stron i został podzielony na cztery podrozdziały odpowiednio do postawionych zadao. Każdy podrozdział zawiera opis celu eksperymentu, wyniki doświadczeo udokumentowane w tabelach lub w postaci diagramów czy też rysunków i jest zakooczony krótkim wnioskiem. Doktorantka w swojej pracy podjęła próbę wyjaśnienie funkcji białka Hsp31p z S. cerevisae. Zbadała jego zaangażowanie w ochronę komórki przed różnymi stresami środowiskowymi poprzez analizę sieci regulacyjnej kontrolującej odpowiedź genu HSP31 na te stresy. Wykazała, że HSP31 jest genem biorącym udział w odpowiedzi komórki na wiele stresów. Jego ekspresja jest regulowana przez szereg czynników transkrypcyjnych takich jak: Msn2/4p, Yap1p, Cad1p, Hsf1p oraz Haa1p, które pośredniczą w odpowiedzi promotora genu HSP31 na stres oksydacyjny, termiczny, osmotyczny, na toksyczne produkty glikolizy (kwas octowy, etanol, metyloglioksal i glicerol) oraz na przeprogramowanie komórki na wykorzystanie innych niż glukoza źródeł węgla. (Rys. 5 i 6, Tab. 10)
Odpowiedź genu na dany stres jest kontrolowana przez kilka sieci regulacyjnych, ale inaktywacja tylko jednej z nich, wystarcza do zablokowania odpowiedzi na dany czynnik stresowy. Sugeruje to kooperatywnośd pomiędzy czynnikami transkrypcyjnymi, która zależy od rodzaju bodźca stresowego np. pod wpływem stresu termicznego obserwowano kooperacje pomiędzy Yap1p, Msn2/4p i Hsf1p, a w stresie osmotycznym pomiędzy Yap1p, Msn2/4p i Haa1p. Udowodniła Ona również, że brak genu HSP31 uwrażliwia komórki drożdży na te same warunki stresowe, które indukują jego ekspresję (Rys.10). Wykazała również, że nadprodukcja białka Hsp31p w komórce drożdży częściowo odwraca fenotyp wrażliwości szczepów pozbawionych glioksalazy Glo1p lub cytozolowej dehydrogenazy aldehydowej Ald6p odpowiednio na metyloglioksal i kwas octowy. Wiąże się to z zależną od obecności Cys-138 aktywnością glioksalazy III jaką posiada białko Hsp31p (Rys. 11 i 12). Aby wyjaśnid funkcje Hsp31p z S. cerevisiae Doktorantka badała również jego lokalizację wewnątrzkomórkową zarówno w warunkach podstawowych jak i po ekspozycji komórek na różne stresy środowiskowe. Wykazała, że Hsp31p ze znacznikiem GFP w warunkach podstawowych jak i w warunkach różnych stresów ma lokalizację cytoplazmatyczną (Rys. 15), z wyjątkiem stresu oksydacyjnego, kiedy to Hsp31p-GFP jest częściowo zlokalizowany w "drobinach" rozmieszczonych na terenie cytoplazmy (Rys. 15, 16 i 17). Ich liczba wzrastała w szczepie pozbawionym białek opiekuoczych Hsp104p i Ssa2p, których rolą jest ochrona innych białek przed agregacją. Podobne zjawisko Doktorantka obserwowała również w szczepie wyrażającym Hsp31p-GFP pozbawione cysteiny 138, która jest istotna dla funkcji enzymatycznej tego białka (Rys. 18). Doktorantka wykazała, że ani natywny Hsp31p ani Hsp31p znakowany epitopem myc, a jedynie Hsp31p ze znacznikiem GFP ma tendencję do tworzenia drobin. Sugeruje Ona, że obserwowane "drobiny" są najprawdopodobniej niefunkcjonalnymi agregatami. W związku z powyższą obserwacją w kolejnych badaniach dotyczących lokalizacji tego białka w warunkach podstawowych jak i stresów środowiskowych zastosowano białko Hsp31p znakowane epitopem myc i metodę immunofluorescencji. Dużym sukcesem Doktorantki jest wykazanie lokalizacji periplazmatycznej białka Hsp31p z S. cerevisiae. Zgodnie z uzyskanymi wynikami lokalizacja Hsp31p w komórkach drożdży szczepu Ʃ1278b w warunkach podstawowych jest cytoplazmatyczno-periplazmatyczna, zaś w obecności stresu oksydacyjnego
periplazmatyczna (Rys. 28). Taka lokalizacja białka Hsp31p może odpowiadad za ochronę komórki podczas stresu oksydacyjnego. Otrzymane wynik badao dowodzą skutecznej realizacji celów pracy. Wszystkie eksperymenty opisane w tym rozdziale zostały w sposób logiczny i fachowy zaplanowane, wykonane i opisane przez Doktorantkę. Dyskusja wyników pracy (liczy 15 stron) jest dojrzała, wielowątkowa i przeprowadzona w oparciu o najnowszą literaturę. Ta częśd pracy pokazuje, że Doktorantka jest w pełni ukształtowanym młodym badaczem przygotowanym do samodzielnej pracy naukowej. Warto również zaznaczyd, że Doktorantka jest współautorką ośmiu doniesieo konferencyjnych na konferencjach krajowych i międzynarodowych oraz dwóch publikacji w renomowanych czasopismach z listy filadelfijskiej, a w jednej z nich, która obejmuje zagadnienia będące przedmiotem dysertacji - jest pierwszym autorem. Nie mam uwag krytycznych do pracy. Zauważyłam tylko w manuskrypcie nieliczne literówki. Podsumowując uważam, że przedstawiona do recenzji rozprawa spełnia warunki określone w ustawie z dn. 14.03.2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym (Dz.U. nr 65 poz.595) z późniejszymi zmianami. Jestem przekonana, że cele rozprawy doktorskiej zostały osiągnięte, a uzyskane wyniki należy uznad za oryginalne i wartościowe o znacznych walorach poznawczych. Wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie o dopuszczenie mgr Urszuli Nataoskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Pozwalam sobie również złożyd Wysokiej Radzie wniosek o wyróżnienie tej pracy ze względu na dużą wartośd merytoryczną i bardzo dobre wykonanie części doświadczalnej oraz napisanie całej rozprawy. dr hab. Ewa Obłąk, prof. nadzw.