Streszczenie rozprawy doktorskiej lekarz Katarzyny Zybert Badania przesiewowe noworodków w kierunku mukowiscydozy - analiza algorytmów diagnostycznych i konsekwencji klinicznych Mukowiscydoza jest wrodzoną, przewlekłą, wieloukładową chorobą dzieci, młodzieży i dorosłych. Należy do najczęściej występujących w populacji kaukaskiej chorób o autosomalnym recesywnym sposobie dziedziczenia. Znanych jest ponad 1900 mutacji genu CFTR. Czynnikiem mającym kluczową rolę w powstawaniu patologicznych objawów jest zaburzenie funkcji gruczołów egzokrynnych. Skutkiem tych nieprawidłowości jest objęcie procesem chorobowym wielu narządów i układów organizmu. Ciężkość objawów, postępujący charakter CF, pogarszanie się jakości życia doprowadzające w efekcie do jego skrócenia, są przyczyną rozwoju badań nad metodami jak najwcześniejszego rozpoznania choroby, tak aby diagnoza została postawiona przed powstaniem nieodwracalnych zmian w układzie oddechowym oraz innymi komplikacjami. Z tego względu podjęto decyzję o wprowadzeniu badań przesiewowych noworodków w kierunku mukowiscydozy (CF NBS - ang. cystic fibrosis newborn screening). Pierwszy powszechny program CF NBS rozpoczął się w 1981 r w Nowej Zelandii i Australii. W latach 1999-2003r do dotychczas prowadzonych NBS dołączono na terenie czterech polskich województw badania w kierunku CF jako program pilotażowy. Od czerwca 2009r. NBS dla CF prowadzony jest w całym kraju. Celem pracy było przedstawienie ewolucji algorytmów diagnostycznych, według których prowadzono badanie przesiewowe noworodków w kierunku mukowiscydozy w Polsce oraz ocena konsekwencji wdrożonych schematów dla wczesnego rozpoznawania. W trakcie prowadzenia polskiego CF NBS algorytm diagnostyczny, podobnie jak w innych krajach, ulegał modyfikacji. Badanie pilotażowe, które rozpoczęto w 1999r przez pierwsze 18 miesięcy odbywało się według schematu IRT/IRT. Następnie do sierpnia 2003r obowiązywał schemat IRT/IRT/DNA z oznaczeniem mutacji F508del w genie CFTR. Częstość wykrywania CF wynosiła 1:6200 badanych dzieci. Niewiele było przypadków obserwacyjnych. Przyjęte wówczas strategie skutkowały dużą liczbą dzieci wzywanych na wizyty konsultacyjne do IMiD celem weryfikacji diagnozy i w efekcie chorobę rozpoznawano u 1 na 12-13 wezwanych do ośrodka dzieci. Podczas prowadzenia pilotażowego NBS rozpoznano niewielką liczbę nosicieli. Po wznowieniu CF NBS w 2006r zastosowano schemat IRT/IRT/DNA z oznaczeniem mutacji F508del w genie CFTR. Następnie zmieniano panel analizy DNA uwzględniający wykrywanie 16 najczęściej występujących w polskiej populacji mutacji genu CFTR, stopniowo zwiększając liczbę mutacji rzadziej występujących. Dzięki temu zmniejszyła się ilość wezwań do ośrodka na wizyty weryfikujące. Rozpoznanie stawiano u 1 na 5 konsultowanych w IMiD dzieci. Częstość wykrywania CF wynosiła 1:5800 badanych bibuł. Rozszerzanie panelu analizy molekularnej przyczyniło się do wzrostu liczby wykrytych nosicieli oraz przypadków obserwacyjnych. Badaniami objęto pacjentów, których rozpoznanie i leczenie prowadzone było w IMID. U wszystkich dzieci przeprowadzona została weryfikacja rozpoznania zgodnie z kryteriami zawartymi w konsensusach krajowych i międzynarodowych. Wyodrębniono cztery grupy badawcze. Grupę pierwszą - pilotaż NBS - stanowiło 56 dzieci objętych pilotażowym badaniem CF NBS, u których rozpoznano CF. Byli to pacjenci urodzeni na terenie 4 województw: mazowieckiego, warmińskomazurskiego, podlaskiego i lubelskiego. Do grupy drugiej - aktualnego NBS- zakwalifikowano dzieci z CF urodzone na terenie tych samych 4 województw w okresie od września 2006 do grudnia 2011, u których diagnozę postawiono w toku CF NBS. Do kolejnej grupy - obserwacyjnej - włączono 19 1
dzieci z nieprawidłowym wynikiem CF NBS, posiadających defekt w obu allelach genu CFTR, ale nie spełniających kryteriów rozpoznania mukowiscydozy. Grupę ostatnią - bez NBS stanowiły dzieci, u których rozpoznano CF na podstawie objawów klinicznych w latach 1995-2003. W przypadku nieprawidłowego wyniku NBS CF dziecko było wzywane do IMID celem weryfikacji rozpoznania. Wykonywano badanie lekarskie, pomiary antropometryczne, przeprowadzano testy potowe metodą jontoforezy pilokarpinowej i konduktometrycznej. Opracowany w IMiD schemat opieki nad dzieckiem z CF, jak również nad dziećmi z grupy obserwacyjnej, obejmował wizyty kontrolne odbywające się kilkakrotnie w ciągu roku. Częstość ich była uzależniona indywidualnie od potrzeb pacjenta i jego rodziny. W pracy wykorzystano statystyki opisowe (odsetki, średnia arytmetyczna, odchylenie standardowe, mediana, zakres). Pomiary masy ciała oraz wzrostu badanych dzieci zostały przeliczone do wartości z-score z wykorzystaniem norm opracowanych przez Instytut Matki i Dziecka, na podstawie pomiarów antropometrycznych wykonanych w latach 1996-1999. Normalność rozkładów zmiennych ilościowych badano za pomocą testu Szapiro - Wilka i analizy graficznej. W analizie związków miedzy zmienną ilościową a zmienną jakościową zastosowano test t-studenta. Do porównań średnich parametrów z-score w poszczególnych grupach z populacją referencyjną (średni z- score = 0) zastosowano test t-studenta dla jednej próby. Przy porównaniu wieku rozpoznania w poszczególnych grupach ze względu na brak rozkładu normalnego wykorzystano test nieparametryczny Manna Whitney a. W analizie związków miedzy dwiema zmiennymi jakościowymi użyto testu Χ 2 Pearsona oraz dokładnego testu Fishera. W celu weryfikacji przydatności testu konduktometrycznego do rozpoznania mukowiscydozy (wynik dodatni 50mmol/l), w porównaniu do testu klasycznego (wynik dodatni 34mmol/l), zastosowano test McNemary. W analizie czynników wpływających na moment wprowadzenia suplementacji enzymatycznej (grupa badawcza, genotyp) zastosowano analizę przeżycia (regresja Coxa). W powyższych analizach przyjęto poziom istotności statystycznej p<0,05 i zastosowano pakiet statystyczny IBM SPSS v.18. U wszystkich pacjentów wykonano analizę DNA. Wśród dzieci z grupy pilotażowej NBS oraz bez NBS najczęściej stwierdzanym genotypem była mutacja F508del w obu allelach genu CFTRodpowiednio 58,9% oraz 57,1%. U chorych z grupy aktualnego NBS homozygoty F508del stanowiły 34,8%, najczęściej w 50% przypadków stwierdzano występowanie mutacji F508del w jednym allelu genu CFTR, a w drugim innej związanej z występowaniem mukowiscydozy mutacji. Rozkład genotypów różnił się istotne statystycznie w grupie aktualnego NBS oraz w grupie obserwacyjnej w porównaniu z grupą bez NBS. Najczęściej występującą mutacją genu CFTR we wszystkich badanych grupach, stwierdzaną w 66,1% wszystkich alleli, była mutacja F508del. Najniższa częstość występowania tej mutacji charakteryzowała grupę obserwacyjną - 34,2%, a najwyższa częstość grupę pilotażową -77,7% oraz grupę bez NBS -75,9%. Inne mutacje stwierdzane w 3,8-2,2% badanych alleli to dele2,3(21kb), N1303K, 3849+10kbC>T, R553X, 2143delT. Do mutacji występujących z częstością 1-2% należały R117H, 2184insA, G542X, W1282X, R334W. Mutację R117H stwierdzano w grupie obserwacyjnej z częstością 18,4%. W grupie aktualnego NBS stwierdzono istotnie statystycznie częstsze występowanie mutacji 3849+10kbC>T w stosunku do grupy pilotażowego NBS oraz grupy bez NBS. Najwyższe wartości stężenia chlorków w pocie - 85,8mmol/l oznaczanych metodą ilościowej jontoforezy pilokarpinowej stwierdzano w grupie bez NBS. W porównaniu z grupą aktualnego NBS - 76,3 mmol/l były to różnice istotne statystycznie. Natomiast średnie stężenie chlorków w pocie badane tą metodą pomiędzy dziećmi rozpoznanymi poprzez pilotażowy i aktualnie prowadzony NBS nie różniło się istotnie statystycznie. Porównując wyniki testu potowego przeprowadzonego metodą konduktometryczną stwierdzono istotnie statystycznie niższe wartości stężeń w grupach aktualnego NBS - 100,8 mmol/l i grupie obserwacyjnej - 43,1 mmol/l w stosunku do grupy bez NBS 2
114,1mmol/l. W grupie obserwacyjnej wartości testu konduktometrycznego były istotnie niższe niż w grupie aktualnego NBS. Wśród pacjentów z grupy aktualnego NBS istotnie statystycznie niższe wartości testów potowych wykonanych zarówno metodą jontoforezy pilokarpinowej jak i konduktometryczną stwierdzono u chorych z mutacją 3849+10kbC>T. Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w przydatności obu metod przeprowadzania testów potowych celem wykazania nieprawidłowego stężenia Cl - w pocie w grupie aktualnego NBS. Średni wiek rozpoznania był istotnie statystycznie niższy w grupach pilotażowego NBS (średnia - 1,4 miesiąca, mediana - 1 miesiąc) i aktualnego NBS (średnia - 0,8 miesiąca, mediana 1 - miesiąc) w stosunku do grupy bez NBS (średnia - 20,1 miesiąca, mediana - 7 miesięcy). Natomiast średni wiek rozpoznania w grupie aktualnego NBS był także istotnie niższy w porównaniu z grupą pilotażowego NBS. W grupach pilotażowego NBS oraz aktualnego NBS większy odsetek rozpoznań postawiono przed ukończeniem 2. miesiąca życia odpowiednio 82,1% i 84,8% w porównaniu z grupą bez NBS -12,5%. Grupę aktualnie prowadzonego NBS wyróżnia najwyższy odsetek dzieci, u których diagnozę postawiono przed ukończeniem 1. miesiąca życia. W kolejnych latach prowadzenia pilotażowego i aktualnego NBS wzrastał odsetek dzieci z rozpoznaniem CF w ciągu 1. miesiąca życia. Nie stwierdzono, aby w grupie aktualnego NBS wystąpienie niedrożności smółkowej miało wpływ na wiek rozpoznania choroby. W grupie aktualny NBS oceniono częstość oraz charakter symptomów ze strony układu pokarmowego. Objawy te dotyczyły 71,7% dzieci. Najczęściej występującym objawem były zaburzenia przyrostu masy ciała - 45,7%. Innymi prezentowanymi symptomami były biegunka - 29,3%, niedrożność smółkowa - 20,7%, zaburzenia funkcji wątroby - 14,1%. Wszystkie dzieci będące homozygotami F508del prezentowały objawy ze strony układu pokarmowego. Częstość występowania tych symptomów u homozygot F508del była większa w stosunku do dzieci będących heterozygotami F508del, jak i do dzieci, u których mutacji F508del nie stwierdzano, różnice były istotne statystycznie. Stwierdzono, że wśród homozygot F508del niezadawalające przyrosty masy ciała występowały znamiennie częściej w stosunku do heterozygot F508del, a także w stosunku do dzieci, u których nie stwierdzano mutacji F508del w żadnym allelu genu CFTR. Nie obserwowano wpływu genotypu na częstość występowania niedrożności smółkowej, biegunki, zaburzeń funkcji wątroby. Oceniano wydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki u pacjentów z badanych grup. Stwierdzono, że niewydolność dotyczy 94,6% chorych z grupy pilotażowego NBS, 80,4% aktualnego NBS, 91,1% bez NBS. Wszystkie dzieci z grupy obserwacyjnej miały zachowaną wydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki. U dzieci, u których rozpoznano niewydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki, rozpoczynano substytucję enzymatyczną. Stwierdzono, że u dzieci z grup aktualnego NBS oraz pilotażowego NBS suplementacja enzymatyczna rozpoczynana była wcześniej niż w grupie bez NBS (odpowiednio HR=3,28, p<0,001 i HR=1,77, p=0,004). U dzieci będących heterozygotami F508del lub posiadających inne mutacje niż F508del istotnie statystycznie później rozpoczynano suplementację enzymatyczną niż u homozygot F508del. Oszacowano czas włączenia suplementacji enzymatycznej w stosunku do pierwszej wizyty w IMiD u dzieci z aktualnego NBS. Obecność objawów niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki w okresie rozpoznania dotyczyła 66,3% pacjentów, ale w 17,4% rozpoczęcie suplementacji było możliwe przed wizytą w IMiD. Do czasu zakończenia obserwacji 19,6% dzieci z tej grupy miało zachowaną wydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki. Przy rozpoznaniu niewydolność zewnątrzwydzielnicza trzustki dotyczyła wszystkich homozygot F508del, 50% heterozygot i 42,9% dzieci, które miały inne mutacje niż F508del. W badanych grupach oceniono masę i długość ciała dzieci wyrażoną w wartościach znormalizowanych dla płci i wieku. Średnia masa ciała w wieku 12 miesięcy, 3 lat oraz 6 lat była najniższa w grupie bez NBS. Masa i długość ciała w wieku 12 miesięcy były istotnie wyższe w grupie aktualnego NBS (-0,27 oraz -0,24) i w grupie obserwacyjnej (0,26 oraz 0,00) w stosunku do grupy 3
bez NBS (-1,29 oraz -1,17 ). Masa i długość ciała dzieci w wieku 3 lat była także istotnie wyższa w grupie aktualnego NBS (0,05 oraz 0,44) oraz w grupie obserwacyjnej (0,04 oraz 0,21) w stosunku do grupy bez NBS (-0,66 oraz -0,66). W grupie pilotażowego NBS masa i długość ciała (-0,53 oraz - 0,56) w wieku 12 miesięcy były istotnie statystycznie wyższe niż w grupie bez NBS. Masa i długość ciała dzieci z aktualnego NBS oraz z grupy obserwacyjnej nie różniła się istotnie od norm dla populacji zdrowej, a w grupie pilotażowego NBS była do nich zbliżona. Natomiast masa i długość ciała dzieci z grupy bez NBS w wieku 12 miesięcy, 3 i 6 lat odbiegały od norm dla populacji referencyjnej. W grupie aktualnego NBS badano wpływ niedrożności smółkowej na masę i długość ciała w wieku 12 miesięcy i 3 lat. Dzieci, u których wystąpiła niedrożność smółkowa, charakteryzowały się niższą masą i długością ciała w stosunku do dzieci bez niedrożności smółkowej. Różnica była istotna statystycznie dla masy ciała w wieku 12 miesięcy (-0,94 u dzieci z niedrożnością smółkową vs -0,12 u dzieci bez niedrożności). W grupie aktualnego NBS analizowano częstość występowania objawów ze strony układu oddechowego. U 59,8% pacjentów objawy nie występowały w okresie okołorozpoznaniowym. U 12% dzieci stwierdzano izolowany kaszel, a u 28,3% - zmiany w badaniu przedmiotowym, takie jak duszność, obniżenie saturacji, zmiany osłuchowe nad polami płucnymi, co skutkowało wdrożeniem intensywnego leczenia. W okresie okołorozpoznaniowym wykonano badanie radiologiczne klatki piersiowej u dzieci z grupy aktualnego NBS. Prawidłowy obraz radiologiczny opisano u 44,6%. W 28,3% stwierdzono minimalne zmiany pod postacią nieznacznie wzmożonego rysunku śródmiąższowego lub cechy rozdęcia. Natomiast w 27,2% zmiany były bardziej zaawansowane stwierdzano zgrubienia okołooskrzelowe, zagęszczenia miąższowe lub niedodmowe. W wymazach z gardła pobranych w okresie okołorozpoznaniowym u 33,7% dzieci potwierdzono obecność Staphylococcus aureus, a u 3,3% Pseudomonas aeruginosa. W grupie dzieci aktualnie prowadzonego NBS badano związek pomiędzy występowaniem objawów klinicznych, a obecnością zmian w badaniu radiologicznym klatki piersiowej. Nie wykazano, aby izolowany kaszel (bez towarzyszących zmian w badaniu przedmiotowym) korelował z obecnością zmian w badaniu radiologicznym klatki piersiowej. Natomiast w grupie dzieci z objawami przedmiotowymi ze strony układu oddechowego istotnie częściej stwierdzano występowanie zmian w zdjęciu RTG klatki piersiowej. Nie stwierdzono wpływu genotypu na częstość występowania objawów klinicznych i zmian radiologicznych w układzie oddechowym w okresie rozpoznania. Stan kliniczny dzieci ze wszystkich badanych grup oceniano stosując punktową skalę Schwachmana Kulczyckiego. Wykazano, że stan kliniczny dzieci z aktualnego NBS oraz w grupie obserwacyjnej w wieku 12 miesięcy oraz 3 lat był istotnie lepszy niż dzieci z grupy bez NBS. W wieku 12 miesięcy stan bardzo dobry stwierdzano u 50,6% pacjentów z grupy aktualnego NBS i u 81,8% pacjentów z grupy obserwacyjnej oraz u 9,1% pacjentów z grupy bez NBS. W wieku 3 lat natomiast stan bardzo dobry stwierdzano u 55,3% pacjentów z grupy aktualnego NBS i u 100% pacjentów z grupy obserwacyjnej oraz u 9,3% pacjentów z grupy bez NBS. Nie wykazano takiej zależności w ocenie grupy pilotażowego NBS w stosunku do grupy bez NBS. Na podstawie przedstawionych wyników można wnioskować, że zastosowanie schematu IRT/DNA z rozszerzonym panelem analizy DNA dało możliwość wczesnego rozpoznania CF nawet u dzieci z prawidłowymi wartościami testów potowych. Jednakże zastosowanie tego modelu spowodowało zwiększenie liczby wykrywanych nosicieli i przypadków obserwacyjnych w porównaniu do schematu IRT/IRT lub IRT/IRT/DNA z ograniczonym panelem mutacji. Test potowy wykonywany metodą konduktometryczną jest przydatny w rozpoznawaniu CF u dzieci z nieprawidłowym wynikiem NBS. Obniżenie wieku rozpoznania poprzez CF NBS w połączeniu z intensywną terapią żywieniową daje szansę na osiągnięcie przez dzieci chore masy ciała i wzrostu nieróżniącego się istotnie od populacji zdrowej oraz poprawę ich stanu klinicznego. Dzieci z 4
niedrożnością smółkową powinny być objęte specjalnym nadzorem poprzez raportowanie tych przypadków na bibułach przesiewowych. W związku z większymi deficytami masy i długości ciała dzieci z niedrożnością smółkową, należy w tej grupie chorych zastosować szczególnie intensywną interwencję żywieniową. lek. Katarzyna Zybert 5