KATEDRA BIOSTRUKTURY I FIZJOLOGII ZWIERZĄT, ZAKŁAD HISTOLOGII I EMBRIOLOGII O C E N A rozprawy doktorskiej magistra ARKADIUSZA PŁOWCA pt. Wpływ prebiotyków i synbiotyków podanych in ovo na zmianę ekspresji genomu kury. Wymieniona w tytule, przedstawiona mi do recenzji praca doktorska obejmuje 96 stron, 16 rysunków, 11 tabel oraz 117 pozycji piśmiennictwa, głównie anglojęzycznego. Dysertacja posiada klasyczny układ obejmujący 6 rozdziałów: wstęp, przegląd literatury, materiał i metody, wyniki, dyskusja oraz wnioski, a ponadto spis piśmiennictwa oraz streszczenie w języku polskim i angielskim. Wstęp pracy wprowadza czytelnika w temat czym są i jakie zastosowanie znajdują prebiotyki i probiotyki. Wskazuje również na efekty zastosowania u zwierząt bakterii probiotycznych oraz synbiotyków będących połączeniem pre- i probiotyku w jeden preparat. Wstęp kończy się sformułowaniem hipotezy badawczej oraz czterema, trafnie postawionymi, bardziej szczegółowymi pytaniami badawczymi. W przeglądzie literatury autor wyjaśnia kluczowe pojęcie mikrobiomu, stanowiącego zbiór drobnoustrojów saprofitycznych, komensalnych oraz pasożytów, zasiedlających określone przestrzenie w organizmie ludzi i zwierząt. Zwraca również uwagę, że drobnoustroje zasiedlające między innymi przewód pokarmowy, skórę, górne drogi oddechowe czy układ rozrodczy, mogą stymulować miejscową i ogólną odpowiedź immunologiczną gospodarza. Wśród wielu innych czynników humoralnych na szczególną uwagę zasługują tutaj wydzielnicze przeciwciała klasy IgA, będące kluczowym elementem odporności błon śluzowych. W obrębie jelita znajduje się najliczniejsza mikroflora, składająca się głównie z bakterii rodzaju Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidaceae oraz Eubacterium. Rola komensalnej flory jelitowej sprowadza się nie tylko do udziału w metabolizmie węglowodanów, kwasów żółciowych, steroli oraz produkcji witamin lecz również do hamowania zasiedlania jelita przez patogenne bakterie i grzyby. Zatem czas pojawienia Strona 1 z 5
się w trakcie rozwoju organizmu oraz rodzaj drobnoustrojów wchodzących w skład mikrobiomu, odgrywa kluczową rolę w rozwoju miejscowej i ogólnoustrojowej odporności. Mikrobiom może być modyfikowany poprzez podawanie probiotyków, czyli komensalnych bakterii, które na zasadzie konkurencji zajmują miejsce rezydującej w jelicie mikroflory. Drugą możliwość stanowi podawanie prebiotyków, a więc związków będących substancjami odżywczymi dla wybranej grupy bakterii. Doktorant omawia również możliwe drogi podania substancji bioaktywnych ze szczególnym uwzględnieniem techniki in ovo. Rozdział kończy charakterystyka właściwości mikroorganizmów probiotycznych oceniana w warunkach in vitro i in vivo. Rozdział Materiał i metody zawiera opis: wyboru i przygotowania linii komórkowej oraz probiotyków zastosowanych do jej stymulacji; sposobu oznaczania poziomu ekspresji receptorów TLR metodą RT-qPCR; analizę transkryptomu linii komórkowej po stymulacji probiotykami z wykorzystaniem całogenomowej macierzy ekspresyjnej oraz walidacji wyników uzyskanych z mikromacierzy. Następnie został wykonany test przenikania prebiotyków i probiotyków z komory powietrznej jaja do jego wnętrza. Ostatnie doświadczenie obejmowało podanie wyselekcjonowanych pre- i synbiotyków in ovo w 12 dniu inkubacji jaj oraz zbadanie wpływu tych substancji na transkryptom kury w 1., 14., i 35 dniu życia, oceniany w śledzionie, migdałkach jelit ślepych oraz prostnicy. Ekspresję genów związanych z układem immunologicznym, a więc: IL-4, IL-6, IL-8, IL-12p40, IL-18, CD80, IFN-β i IFN-γ oceniano metoda RT-qPCR w migdałkach jelitowych oraz śledzionie w 1., 14. i 35. dniu po wykluciu. Całogenomową macierz ekspresyjną wykonano w 35 dniu życia w śledzionie, migdałkach jelitowych oraz prostnicy. Do badań na zwierzętach wybrano dwa prebiotyki: inulinę i galaktooligosacharyd (GOS) oraz dwa synbiotyki: inulina + Lactococcus lactis subsp. lactis IBB 2955 i GOS + L. lactis subsp. cremoris IBB 477. Uzyskane wyniki wskazują, że po podaniu do komory powietrznej prebiotyk stopniowo przedostaje się do układu pokarmowego pisklęcia stymulując naturalną probiotyczną mikroflorę, natomiast probiotyk kolonizuje przewód pokarmowy od chwili przebicia komory powietrznej przez zarodek. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem kurzej makrofagowo-podobnej linii komórkowej HD11 wykazały, że trzy zastosowane probiotyki: Lactococcus lactis subsp. cremoris IBB 477, L. lactis subsp. lactis IBB 2955 oraz Lactobacillus salivarius IBB 3154 spowodowały bardzo podobną zmianę w transkryptomie. Jedynie zmiany wywołane przez Lactobacillus plantarum IBB 3036 znacząco odbiegały od pozostałych grup eksperymentalnych. Stwierdzono ponadto, że pierwsze trzy w/w szczepy bakterii posiadają silne właściwości immunostymulujące, co predysponuje je do wykorzystania jako suplement diety u drobiu, a nawet u ludzi. Strona 2 z 5
W badaniach na zwierzętach stwierdzono, że substancją wywołującą najwięcej zmian ekspresji genów był prebiotyk GOS oceniany w migdałkach jelit ślepych. Z punktu widzenia lokalizacji zmian ciekawym spostrzeżeniem jest fakt, że zdecydowana większość zmian molekularnych została stwierdzona w migdałkach jelitowych (reprezentujących tkankę limfatyczną związaną z jelitem określaną skrótem GALT), mniej w śledzionie (reprezentującej odpowiedź immunologiczną ogólnoustrojową), a najmniej w jelicie prostym (gdzie tkanka limfatyczna jest słabo rozwinięta). Ponadto stwierdzono, że wraz z wiekiem kurcząt następowały spadki ekspresji genów związanych z układem immunologicznym. Zaskakującą obserwacją było stwierdzenie, że prebiotyk podany in ovo wykazywał silniejszy wpływ na zmianę ekspresji genów niż odpowiadający mu synbiotyk. W ostatnim rozdziale Autor podaje siedem wniosków płynących z przeprowadzonych badań, które potwierdzają hipotezę, że podanie in ovo wybranych prebiotyków lub synbiotyków wpływa na poziom ekspresji genów u kur. Czytając tekst rozprawy zauważyłem kilka sformułowań, które wymagają korekty: Na str. 15. Doktorant używa potocznego (lub dosłownie tłumaczonego z języka angielskiego) określenia śluzówka jelit, podczas gdy prawidłowa nomenklatura tej warstwy jelita nosi nazwę błony śluzowej. W rozdziale Materiał i metody w punkcie dotyczącym analiz molekularnych (RT-qPCR oraz cełogenomowa macierz ekspresyjna) brakuje informacji, czy były one przeprowadzane w homogenacie całych odcinków jelit ślepych zawierających migdałki, czy wybranych warstw ściany narządu lub stron jelita ślepego. Ma to znaczenie, ponieważ odcinki jelit ślepych, w których ścianie znajdują się migdałki mają budowę asymetryczną. Na str. 47 czytamy: błona podskorupowa ( ) zawiera pory utworzone przez włókna fibrynogenu. Fibrynogen nie występuje w formie włókien. Jest to białko osocza krwi, które m. in. podczas tworzenia skrzepu polimeryzuje tworząc włókna fibryny. Jednocześnie w Dyskusji na str. 69 Doktorant pisze już poprawnie o włóknach kolagenowych obecnych w błonie podskorupowej. Na stronie 55 Doktorant pisze o ekspresji genów w obrębie tych samych tkanek. Jeżeli przedmiotem analizy były fragmenty narządów, to należałoby mówić raczej o narządach, a nie tkankach. Do oceny ekspresji genów w konkretnych tkankach należy uprzednio zastosować mikrodysekcję w celu precyzyjnego pobrania określonego fragmentu narządu lub pobierać materiał z dużych struktur o jednolitej budowie tkankowej takich jak np. mięśnie. Na stronie 76 czytamy: Ponadto GALT łączy się ze śledzioną za pośrednictwem wspólnej błony śluzowej. Proszę wyjaśnić jaką wspólną błonę śluzową Doktorant ma na myśli? Strona 3 z 5
Na stronie 78 Autor pisze: Stosowany w badaniach probiotyk (GOS) był izolowany z mleka i nie jest gatunkowo specyficzny dla drobiu. W kontekście bakterii probiotycznych spotykamy się z pojęciem gatunkowo specyficznego mikrobiomu. Czy jednak w przypadku GOS można mówić o jakiejkolwiek gatunkowej specyficzności? Na stronie 79 czytamy o wydzielaniu neutralizujących przeciwciał przez limfocyty nabłonkowe jelit (IEL). Limfocyty śródnabłonkowe określane skrótem IEL to głównie komórki CD8 + oraz w mniejszym stopniu nietypowe limfocyty B, które nie ekspresjonują na swojej powierzchni immunoglobulin. Ponadto poniżej zamieszczam drobne uwagi o charakterze redakcyjnym, które należałoby uwzględnić przy przygotowywaniu tekstu do publikacji naukowych. 1. Nietypowa forma zapisu cytowań w tekście nazwiska czterech pierwszych autorów, zamiast nazwiska pierwszego autora z dopiskiem i wsp.. 2. W rozdziale Materiały i metody : w zapisie ułamków dziesiętnych w języku polskim należy zastosować przecinki, a nie kropki jak w języku angielskim. 3. str. 32 i dalej W badaniach na zwierzętach pobierano fragmenty śledziony, migdałków jelit ślepych oraz jelita grubego. Wydaje mi się, że bardziej precyzyjnym określeniem zamiast jelita grubego byłaby prostnica (rectum), ponieważ anatomicznie rzecz biorąc jelita ślepe to również odcinki jelita grubego. 4. str. 37. Jest: a najniższy dla: TLR1B, a powinno być: TLR1A. 5. str. 19 i następne: Określenie odpowiedź antyzapalna chociaż spotykane w literaturze, zwykle jest nazywane odpowiedzią przeciwzapalną. 6. str. 41 Jest: zaprezentowane w Tabeli 5, a powinno być: w Tabeli 6. 7. str. 43 Jest: cytoksyczność, a powinno być: cytotoksyczność 8. str. 71 Jest: ( ) Lactobacillus johnsonii i Lactobacillus plantarum, charakteryzują się indukowaniem odpowiedzi antyzapalnej, w której wzrasta ekspresja IL-12 [Shida i wsp. 2009]. Właśnie w/w bakterie słabo lub bardzo słabo indukują produkcję IL-12 przez makrofagi, w przeciwieństwie do innych bakterii z rodzaju Lactobacillus (wg Shida i wsp. 2009). 9. str. 72 Jest: bakterie P1, P2, P3 spowodowały zwiększenie poziomu ekspresji genów. Zamiast P3 powinno być P4, ponieważ nieco dalej Doktorant pisze: Lactobacillus plantarum nie spowodowała zmiany w ekspresji powyższych genów. 10. str. 93 Jest: lactococcusów, powinno być: bakterii z rodzaju Lactococcus. Strona 4 z 5