TLC2 ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH ANTICOL Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie dehydrogenazy aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej szkodliwej substancji - kwasu octowego. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty spożywcze zawierające niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo nieprzyjemne reakcje: pulsujący ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu. Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku wzorca. W tym celu mierzy się pole powierzchni pików otrzymanych z plam odpowiadających roztworowi nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości wzorca do próbki badanej. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej. 30 pole powierzchni piku 25 20 15 10 5 0-2 -1 0 1 2 masa dodanego wzorca [mg] Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji. Odczynniki Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(cuso 4 )=0.5 mol/l Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram) Metanol, cz.d.a. Preparat farmaceutyczny ANTICOL disulfiramum 500 ml - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne, Warszawa Aparatura i sprzęt laboratoryjny Kolby miarowe pojemności 10 ml Kolby miarowe pojemności 1 ml Kolbki plastikowe o pojemności 1,5 ml Zlewka o pojemności 25 ml 4 szt. 4 szt. 1 szt.
Lejki Pipeta pojemności 2 ml Pipeta automatyczna nastawna pojemności 1000 µl 1 szt. Pipeta automatyczna nastawna pojemności 0,1-1 µl 1 szt. Naczynka wagowe Moździerz 1 szt. Łopatka 1 szt. Waga analityczna Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60 (wymiary 5 cm x 5 cm) Suszarka fryzjerska Komora chromatograficzna DESAGA Spryskiwacz TLC Suszarka laboratoryjna Płuczka ultradzwiękowa Wykonanie ćwiczenia 1. Włączyć suszarkę laboratoryjną (150 0 C). 2. Przygotowanie roztworów. a) odważyć 30 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 10 ml, rozpuścić w około 5 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do kreski. b) w moździerzu rozetrzeć jedną tabletkę preparatu farmaceutycznego. Odważyć 40 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 10 ml. Dodać około 5 ml metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski. c. Do 4 kolbek o pojemności 1 ml przenieść po 200 µl roztworu leku z punktu 2b, a następnie odpowiednio 0, 200, 400, 600 µl roztworu wzorca esperalu z punktu 2a. Kolbki uzupełnić metanolem do kreski. 3. Przygotowanie płytki chromatograficznej. a) z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach 5x5 cm b) w odległości 0.5 cm od dołu płytki zaznaczyć cienko ołówkiem linię startu, a w odległości 4 cm od linii startu zaznaczyć koniec drogi rozwijania chromatografu. Na linii startu w odległości 1 cm od siebie delikatnie zaznaczyć ołówkiem punkty, na które będą nanoszone roztwory; c) płytkę przymierzyć do komory chromatograficznej i dopasować ją do wymiarów jej wymiarów odcinając fragment poza linia końca. b) na linię startu nanieść mikropipetą 0.5 µl roztworów z punktu 2c. c) płytkę wysuszyć suszarką.
4. Przygotowanie komory chromatograficznej a) do zlewki o pojemności 25 ml przenieść 2 ml metanolu oraz 2 ml wody. Całość wymieszać i napełnić zbiorniczek komory chromatograficznej sąsiadujący z paskiem z materiału porowatego. b) płytkę umieścić w komorze chromatograficznej dociskając ją płytkę do materiału porowatego c) obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę 4 cm (do linii końca) wyjąć płytkę z komory i wysuszyć suszarką fryzjerską. 5. Wizualizacja płytki Wysuszona płytkę spryskać roztworem siarczanu (VI) miedzi (II) za pomocą spryskiwacza w odpowiedniej komorze spryskującej. Suszyć w suszarce w temperaturze 150 0 C przez 5 min. 6. Skanowanie płytki. 1. Otwieramy program Centrum Obsługi HP poprzez podwójne kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> znajdującej się na Pulpicie. 2. Następnie klikamy przycisk ->Skanuj obraz w tym momencie komputer sam uruchomi skaner i na monitorze wyświetli się skanowany obraz. 3. Zaznaczamy skanowany obszar (płytkę) poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy obszaru aktywnego (ilustracja 1). Ilustracja 1. Obszar aktywny skanowania 4. Naciskamy lewym przyciskiem myszy -> Akceptuj 5. Komputer zapisze zeskanowaną płytkę w folderze domyślnym -> D:\(data)\plytka(nr).jpg 6. Zamykamy program Centrum Obsługi HP poprzez klikniecie krzyżyka w prawym górnym rogu lewym przyciskiem myszy. 6. Instrukcja obsługi programu TLSee 1. Uruchamiamy program TLSee poprzez podwójnie kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> znajdującej się na Pulpicie
2. Następnie wybieramy opcję File->New Experiment->Without calibration poprzez pojedyncze kliknięcie lewym przyciskiem myszy owej funkcji (ilustracja 2). Ilustracja 2. Without calibration mode 3. Następuje otwarcie pełnej wersji programu TLSee (ilustracja 3.) Ilustracja 3. Pełne otwarcie programu TLSee 4. W wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę -> i wybieramy ścieżkę dostępu zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). Na monitorze wyświetla się zeskanowana płytka. 5. Aktywujemy lewym przyciskiem myszy zakładkę Plate (u dołu aktywnego okna) i suwaczkami (na ilustracji 4. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca przeciągając je lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości.
Ilustracja 4. Określanie linii startu i końca. 6. Aktywujemy funkcję Fixed Band poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (w pasku na górze) zaznaczonej na ilustracji 4. Najeżdżamy myszką na obraz płytki i zaznaczamy tzw. pasmo, czyli drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż do linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (patrz ilustracja 5.). Postępujemy tak dla wszystkich otrzymanych plamek. Ilustracja 5. Funkcja - Fixed Band 7. Klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles -> i na monitorze pojawiają się chromatogramy pikowe. Lane 1 odpowiada ścieżce 1, Lane 2 ścieżce 2 itd. By poruszać się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas Lane. Integracja pików 8. W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy aktywować funkcję Band Integration poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (zaznaczonej na ilustracji 4.). 9. Następnie trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałką pik u podstawy po całej jego szerokości, jak na ilustracji 6. Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane 1, Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość R f (Peak Rf) oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików. 10. Sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości R f oraz pola powierzchni każdego z otrzymanych pików.
Ilustracja 6. Integracja piku. 11. Zamykamy program klikając lewym przyciskiem myszy krzyżyk znajdujący się w prawym górnym rogu monitora. 12. Klikamy NIE. Opracowanie wyników ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia R f każdej z plamek. gdzie: a R f = b R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej b. 2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal? ANALIZA ILOŚCIOWA 1. Sporządzić wykres jak na rysunku we wstępnie zaznaczając na osi x punkt określony jako m x, w odległości 20 mm na prawo punkt opowiadający pierwszemu dodatkowi czyli 0.6 mg, dalej w odległości 40 mm od mx i 60 mm od m x punkty odpowiadające dodaniu do próbki badanej kolejnym wzorcom (1.2, 1.8 mg) 2. Przez otrzymane punkty poprowadzić prostą i znaleźć jej przecięcie z osią x. Odcinek osi x od przecięcia z osią x do punktu m x odpowiada zawartości esperalu w kolbce. Jeśli skorzysta się z programu EXCEL to wyznaczyć równanie prostej i zleźć punkt x odpowiadający y=0.
3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce, wiedząc że 1 tabletka ma masę 672 mg. Wyciągnąć wnioski.