METODY SEPARACYJNE CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA. analityka chemiczna III rok 1 stopień. dr Monika Skowron

Transkrypt

1 METODY SEPARACYJNE CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA analityka chemiczna III rok 1 stopień dr Monika Skowron

2 TLC1 IDENTYFIKACJA JONÓW HALOGENKOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą jest ciecz, zaś faza nieruchoma umieszczona jest na płaszczyźnie, to mówimy o chromatografii cienkowarstwowej. Identyfikacja substancji sprowadza się do porównania wartości współczynników opóźnienia R F wzorca i próbki badanej. W tym celu wykonuje się chromatogram dla roztworów wzorcowych rozdzielanych substancji o stężeniach zbliżonych do zakładanego w próbce badanej. Wartość R F plamek substancji otrzymanych z roztworu badanego powinna odpowiadać R F plamek otrzymanych z odpowiednich roztworów wzorcowych. Składniki analizowanej w ćwiczeniu próbki nie są barwne, należy więc przeprowadzić ich wizualizację. Chromatogram wywołuje się spryskując go w pierwszej kolejności roztworem AgNO 3, a następnie roztworem K 2 CrO 4. Ćwiczenie ma na celu zapoznanie studenta z metodą chromatografii cienkowarstwowej (z ang. Thin Layer Chromatography - TLC) oraz rozdzielenie mieszaniny halogenków i ich identyfikację. Odczynniki roztwór amoniaku (1+3), aceton do HPLC, n-butanol do HPLC, roztwory wrozcowe KCl, KBr i KI o stężeniu 0.1 mol/l, roztwory AgNO 3 i K 2 CrO 4 o stężeniu 0.1 mol/l, badana mieszanina halogenków. Aparatura i sprzęt laboratoryjny zlewka pojemności 25 ml pipeta o pojemniści 1 ml pipeta o pojemniści 2 ml pipeta o pojemności 5 ml płytka aluminiowa pokryta celulozą komora chromatograficzna spryskiwacz TLC automatyczny aplikator Linomat 5 2 szt.

3 Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie płytki chromatograficznej: UWAGA: PODCZAS PRACY Z PŁYTKĄ CHROMATOGRAFICZNĄ NALEŻY UWAŻAĆ ABY NIE USZKODZIĆ POWIERZCHNI SORBENTU. - z aluminiowego arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 5x5 cm; - umieścić płytkę w suchej komorze w celu sprawdzenia jej dopasowania, a w razie konieczności przyciąć ją; - w odległości 4.5 cm od jednego z brzegów płytki narysować linię końca do której będzie rozwijany chromatogram. 2. Przygotowanie fazy ruchomei i komory chromatograficznej: - przygotowanie fazy ruchomej: do zlewki o pojemności 25 ml odmierzyć amoniak, aceton i n-butanol w stosunku objętościowym 0.8 : 2.6 : 1.2. Roztwór dobrze wymieszać; - ostrożnie napełnić fazą ruchomą komorę chromatograficzną; - przykryć komorę pokrywką i pozostawić ją w celu nasycenia parami eluentu (jest to czas na aplikację roztworów). 3. Aplikacja roztworów na płytkę za pomocą aplikatora - aplikację roztworów wzorcowych KCl, KBr i KI o objętości 0.5 μl oraz próbki badanej o objętości 0.2 μl przeprowadzić zgodnie z instrukcją obsługi aplikatora Linomat Rozwijanie chrmatogramu: - płytkę z naniesinymi roztworami umieścić w komorze chromatograficznej w celu rozwinięcia chromatogramu, - obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do lini końca wyjąć ją z komory i lekko wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza. 5. Wizualizacja chromatogramu: - do jednej butelki spryskiwacza wlać roztwór AgNO 3, a do drugiej K 2 CrO 4. Dokręcić butelki do korpusu spryskiwaczy; - spryskać płytkę roztworem AgNO 3, lekko podsuszyć, a następnie roztworem K 2 CrO 4 ; - płytkę dobrze osuszyć i zaznaczyć ołówkiem uwidocznione plamki.

4 Opracowanie wyników 1. Wyznaczyć wartość współczynników R f R f = A/B gdzie: R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od lini startu do czoła fazy ruchomej B), gdzie B w tym przypadku wynosi 8 cm. 2. Zinterpretować otrzymane wyniki.

5 pole powierzchni piku TLC2 ILOŚCIOWE OZNACZANIE ESPERALU W TABLETKACH ANTICOL Esperal (disulfiram, disiarczek bis[dietylokarbamoilu]) jest substancją czynną leków stosowanych w leczeniu alkoholizmu. Zaburza on metabolizm alkoholu etylowego. Blokuje działanie dehydrogenazy aldehydowej (enzymu) przez co spowalnia utlenieniu aldehydu octowego do mniej szkodliwej substancji - kwasu octowego. Spożycia alkoholu (we wszelkiej postaci, nawet produkty spożywcze zawierające niewielkie ilości alkoholu) podczas kuracji esperalem towarzyszą bardzo nieprzyjemne reakcje: pulsujący ból głowy, gwałtowne bicie serca, wymioty, mdłości, silne zaczerwienienie twarzy, uczucie braku tchu. Ćwiczenie ma na celu ilościowe oznaczanie esperalu w tabletach ANTICOL metodą dodatku wzorca. W tym celu mierzy się pole powierzchni pików otrzymanych z plam odpowiadających roztworowi nieznanemu oraz roztworom sporządzonym przez wielokrotny dodatek znanej ilości wzorca do próbki badanej. Wykonuje się wykres jak na rysunku poniżej masa dodatku wzorca [mg] Punkt przecięcia linii z osią x odpowiada zawartości oznaczanej substancji. Odczynniki Roztwór siarczanu (VI) miedzi (II) o stężeniu c(cuso 4 )=0.5 mol/l Disiarczek tetraetylotiuramu (esperal, disulfiram) Metanol, cz.d.a. Preparat farmaceutyczny ANTICOL disulfiramum 500 mg - Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne, Warszawa Aparatura i sprzęt laboratoryjny Kolby miarowe pojemności 5 ml Kolby miarowe pojemności 1 ml Kolbki Eppendorfa o pojemności 1.5 ml 2 szt. 4 szt. 4 szt.

6 Zlewka o pojemności 25 ml Lejki 2 szt. Pipeta pojemności 5 ml pipeta o pojemności 1 ml Pipeta automatyczna nastawna pojemności 200 l Pipeta automatyczna nastawna pojemności l Naczynka wagowe 2 szt. Moździerz Łopatka Płytka pokryta żelem krzemionkowym Silica gel S60 RP-18 (wymiary 5 cm x 5 cm) Komora chromatograficzna DESAGA Spryskiwacz TLC Wykonanie ćwiczenia 1. Włączyć suszarkę laboratoryjną (temp. 50 o C). 2. Przygotowanie roztworów. a) odważyć 50 mg wzorca esperalu, przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml, rozpuścić w około 2 ml metanolu i uzupełnić kolbkę metanolem do kreski. Całość dobrze wymieszać b) jeśli to konieczne rozetrzeć w moździerzu jedną tabletkę preparatu farmaceutycznego. Odważyć 50 mg i przenieść ilościowo do kolbki o pojemności 5 ml. Dodać około 2 ml metanolu i wytrząsać przez 5 minut na płuczce ultradźwiękowej. Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski i całość dobrze wymieszać. c) do 2 probówek Eppendorfa o pojemności 1.5 ml wlać przygotowany roztwór preparatu farmaceutycznego z punktu 2b i odwirować mieszaninę na wirówce. d) Do 4 kolbek o pojemności 1 ml przenieść po 100 l roztworu leku z punktu 2c, a następnie odpowiednio 0, 50, 100 i 150 l roztworu wzorca esperalu z punktu 2a. Kolbki uzupełnić metanolem do kreski i całość dobrze wymieszać. 3. Przygotowanie płytki chromatograficznej. a) z arkusza wyciąć płytkę chromatograficzną o wymiarach 5x5 cm b) w odległości 0.5 cm od dołu płytki zaznaczyć cienko ołówkiem linię startu, a w odległości 4 cm od linii startu zaznaczyć koniec drogi rozwijania chromatografu. Na linii startu w odległości 1 cm od siebie delikatnie zaznaczyć ołówkiem punkty, na które będą nanoszone roztwory; c) płytkę przymierzyć do komory chromatograficznej i dopasować ją do wymiarów jej wymiarów odcinając fragment poza linia końca. b) na linię startu nanieść mikropipetą po 0.5 l każdego z roztworów z punktu 2d.

7 c) płytkę wysuszyć suszarką. 4. Przygotowanie komory chromatograficznej a) do zlewki o pojemności 25 ml przenieść 3.6 ml metanolu oraz 0.4 ml wody. Całość wymieszać i napełnić zbiorniczek komory chromatograficznej sąsiadujący z paskiem z materiału porowatego. b) płytkę umieścić w komorze chromatograficznej dociskając ją płytkę do materiału porowatego c) obserwować czoło rozpuszczalnika; kiedy pokona ono drogę do linii końca (4 cm) wyjąć płytkę z komory i wysuszyć suszarką fryzjerską. 5. Wizualizacja płytki Wysuszona płytkę spryskać roztworem siarczanu (VI) miedzi (II) za pomocą spryskiwacza w odpowiedniej komorze spryskującej. Suszyć w suszarce w temperaturze 50 o C przez 2 min. 6. Skanowanie płytki. a) Otwieramy program Centrum Obsługi HP poprzez podwójne kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> znajdującej się na Pulpicie. b) Następnie klikamy przycisk ->Skanuj obraz w tym momencie komputer sam uruchomi skaner i na monitorze wyświetli się skanowany obraz. c) Zaznaczamy skanowany obszar (płytkę) poprzez przeciągnięcie lewym przyciskiem myszy obszaru aktywnego (ilustracja 1). Ilustracja 1. Obszar aktywny skanowania d) Naciskamy lewym przyciskiem myszy -> Akceptuj.

8 e) Komputer zapisze zeskanowaną płytkę w folderze ustawionym jako domyślny. f) Zamykamy program Centrum Obsługi HP poprzez klikniecie krzyżyka w prawym górnym rogu lewym przyciskiem myszy. 6. Instrukcja obsługi programu TLSee 1. Uruchamiamy program TLSee poprzez podwójnie kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> znajdującej się na Pulpicie 2. Następnie wybieramy opcję File->New Experiment->Without calibration poprzez pojedyncze kliknięcie lewym przyciskiem myszy owej funkcji (ilustracja 2). Ilustracja 2. Without calibration mode 3. Następuje otwarcie pełnej wersji programu TLSee (ilustracja 3.) Ilustracja 3. Pełne otwarcie programu TLSee 4. W wierszu Image klikamy lewym przyciskiem myszy ikonkę -> i wybieramy ścieżkę dostępu zeskanowanej płytki (np. D:\(data)\plytka(nr).jpg). Na monitorze wyświetla się zeskanowana płytka. 5. Aktywujemy lewym przyciskiem myszy zakładkę Plate (u dołu aktywnego okna) i suwaczkami (na ilustracji 4. zaznaczone strzałkami) określamy linię startu i końca przeciągając je lewym przyciskiem myszy do odpowiedniej wysokości.

9 Ilustracja 4. Określanie linii startu i końca. 6. Aktywujemy funkcję Fixed Band poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (w pasku na górze) zaznaczonej na ilustracji 4. Najeżdżamy myszką na obraz płytki i zaznaczamy tzw. pasmo, czyli drogę migracji plamki oraz fazy ruchomej od linii startu aż do linii końca, tak by cała plamka mieściła się między ogranicznikami (patrz ilustracja 5.). Postępujemy tak dla wszystkich otrzymanych plamek. Ilustracja 5. Funkcja - Fixed Band 7. Klikamy lewym przyciskiem myszy ikonę View Profiles -> i na monitorze pojawiają się chromatogramy pikowe. Lane 1 odpowiada ścieżce 1, Lane 2 ścieżce 2 itd. By poruszać się między ścieżkami wystarczy lewym przyciskiem myszy kliknąć interesującą nas Lane. Integracja pików 8. W celu wyznaczenia pola powierzchni poszczególnych pików należy aktywować funkcję Band Integration poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony -> (zaznaczonej na ilustracji 4.). 9. Następnie trzymając wciśnięty lewy przycisk myszy przeciągamy strzałką pik u podstawy po całej jego szerokości, jak na ilustracji 6. Robimy tak dla wszystkich czterech pików (Lane 1, Lane 2, Lane 3, Lane 4), które otrzymaliśmy. Komputer automatycznie liczy wartość R f (Peak Rf) oraz pole powierzchni (Area) poszczególnych pików.

10 10. Sporządzamy tabelę, w której umieszczamy dane dotyczące wartości R f oraz pola powierzchni każdego z otrzymanych pików. Ilustracja 6. Integracja piku. 11. Zamykamy program klikając lewym przyciskiem myszy krzyżyk znajdujący się w prawym górnym rogu monitora. 12. Klikamy NIE. Opracowanie wyników ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Wyznaczyć współczynnik opóźnienia R f każdej z plamek. gdzie: a R f b R f określa stosunek drogi migracji substancji chromatografowanych (od punktu startu do środka plamki a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej b). 2. Zinterpretować otrzymane wartości. Czy w tabletce znajduje się esperal? ANALIZA ILOŚCIOWA 1. Sporządzić wykres jak na rysunku we wstępnie zaznaczając na osi x punkt określony jako m x, w odległości 20 mm na prawo punkt opowiadający pierwszemu dodatkowi czyli 0.5 mg, dalej w odległości 40 mm od m x i 60 mm od m x punkty odpowiadające dodaniu do próbki badanej kolejnym wzorcom (1.0 i 1.5 mg) 2. Przez otrzymane punkty poprowadzić prostą i znaleźć jej przecięcie z osią x. Odcinek osi x od przecięcia z osią x do punktu m x odpowiada zawartości esperalu w kolbce. Jeśli skorzysta się z programu EXCEL to wyznaczyć równanie prostej i zleźć punkt x odpowiadający y=0. 3. Obliczyć zawartość esperalu w 1 tabletce, wiedząc że 1 tabletka ma masę 668 mg. Wyciągnąć wnioski.

11 INSTRUKCJA OBSŁUGI AUTOMATYCZNEGO APLIKATORA TLC LINOMAT 5 1. Załadowanie płytki TLC (Rys. 1) - przesunąd, znajdującą się z prawej strony dźwignię stolika ( 1 ) do góry i w tylne położenie dla obniżenia płyty stolika; - mieścid płytkę TLC ( 2 ) w lewym górnym rogu stolika w taki sposób aby stykała się z tylną krawędzią i dwoma kołkami pozycjonującymi ( 3 ); - zabezpieczyd położenie płytki za pomocą listwy ( 4 ); - przemieścid uważnie dźwignię stolika ( 1 ) w poprzednie położenie. Kierowanie dźwignią powinno odbywad się w taki sposób aby uniknąd zbyt szybkiego unoszenia się ruchomej płaszczyzny stolika. Rys Odkręcid butlę z azotem. 3. Włączyd aplikator przyciskiem O/I umieszczonym na lewym boku obudowy (świeci się dioda POWER ON). Aplikator będzie teraz spełniad następujące funkcje kontrolne: - inicjowanie napędu płyty. - inicjowanie napędu strzykawki. Jeśli uruchomienie się powiodło na ekranie pojawi się napis: ** Linomat 5 ** Instrument ready 3. Wprowadzanie parametrów metody. - w celu wybrania metody nacisnąd przycisk RUN: zostanie wyświetlona metoda, która w ostatnim okresie czasu była najczęściej używana. Przy pomocy klawiszy i można wybrad inną przechowywaną metodę. - w celu zmiany parametrów dla wybranej metody nacisnąd przycisk DIALOG: przy pomocy klawiszy i wybrad grupę parametrów, które chcemy zmienid. Aby zmienid parametry z danej grupy nacisnąd ENTER. - dostępne są następujące grupy parametrów: wybór kolejnego parametru, który ma byd zmieniony następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER, a wybrany parametr zmienia się przy pomocy klawiszy i. Zatwierdzenie i jednocześnie przejście do kolejnego parametru następuje przez przyciśnięcie przycisku ENTER.

12 UWAGA! Po zapisaniu metody naciśnięcie kolejne przycisku ENTER powoduje rozpoczęcie procedury aplikacji

13 Aplikacja badanych roztworów na płytkę 2. Napełnienie strzykawki dozującej 1 trzykrotnie przemyd strzykawkę wodą dejonizowaną 2 trzykrotnie strzykawkę roztworem, który ma byd nanoszony na płytkę 3 napełnid strzykawkę roztworem, który ma byd nanoszony na płytkę w objętości przynajmniej takiej jak jest wyświetlana na wyświetlaczu; Kroki 2-3 powtórzyd dla wszystkich roztworów, które mają byd aplikowane. Po zakooczeniu aplikacji wszystkich roztworów przemyd strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem. 3. Umieszczanie napełnionej strzykawki dozującej w aplikatorze (Rys. 2) - upewnid się czy płyta jest w odpowiednim położeniu i poziome ramię wieżyczki znajduje się w górnym położeniu; - przy pomocy lewej ręki przesunąd ramię dźwigni ( 1 ) w lewo i pozostawid w tym położeniu; - ostrożnie przełożyd strzykawkę przez uchwyt strzykawki ( 2 ) i ostrożnie obniżad aż do oparcia strzykawki w głowicy rozpylającej ( 3 ). Rys Rozpoczęcie aplikacji próbki - nacisnąd przycisk ENTER co spowoduje inicjację napędu strzykawki i ustawienie stolika. - nacisnąd ponownie przycisk ENTER: Napęd strzykawki będzie teraz wykonywad automatyczne wypuszczanie ustalonej objętości wstępnego dozowania, a następnie nastąpi aplikacja pierwszej próbki. - po aplikacji pierwszej próbki napęd strzykawki i stolik powrócą automatycznie do pozycji wstępnego dozowania. - napełnid strzykawkę kolejnym dozowanym roztworem i postępując analogicznie jak w przypadku pierwszej próbki zaaplikowad go na płytkę. Całą procedurę powtórzyd dla wszystkich roztworów. 5. Zakooczenie aplikacji - wyłączyd aplikator przyciskiem O/I i zakręcid butlę z gazem; - przemyd strzykawkę trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie siedmiokrotnie metanolem.