Znaczenie polimorfizmów genów receptorów Toll-like-2 oraz Toll-like-4 w porodzie przedwczesnym

Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 5, zeszyt 2, 89-95, 2012 Znaczenie polimorfizmów genów receptorów Toll-like-2 oraz Toll-like-4 w porodzie przedwczesnym ELŻBIETA DREWS-PIASECKA 1, AGNIESZKA SEREMAK-MROZIKIEWICZ 2, 3, MAGDALENA BARLIK 2, 3, GRAŻYNA KURZAWIŃSKA 2, 3, KRZYSZTOF DREWS 2, 3 Streszczenie Wstęp. Poród przedwczesny (PTD preterm delivery) jest zjawiskiem złożonym, wywoływanym przez wiele różnych czynników. Obecnie coraz większą rolę przypisuje się genetycznym uwarunkowaniom wystąpienia PTD, wskazując na możliwe znaczenie wariantów polimorficznych genów kandydujących do udziału w etiologii PTD. Cel pracy. Ocena znaczenia wybranych polimorfizmów genów receptorów Toll-like w etiologii porodu przedwczesnego w populacji kobiet polskich. Analizie poddano polimorfizmy Arg753Gln (20877G > A) genu TLR2 oraz Thr399Ile (8993C > T ) genu. Materiał i metody. Grupę badaną stanowiło 150 kobiet, u których ciąża zakończyła się porodem przedwczesnym (22 + 0 tc.!36 + 6 tc.). Grupę kontrolną stanowiło 150 zdrowych kobiet ciężarnych, u których ciąża zakończyła się porodem o czasie (>37. tc.). Wszystkie badane polimorfizmy analizowano metodą reakcji łańcuchowej polimerazy oraz polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (PCR/RFLP). Wyniki. W czasie analizy polimorfizmu Thr399Ile genu odnotowano większą częstość występowania genotypu heterozygotycznego 8993CT w grupie kontrolnej (14,0 vs. 9,3%, p = ns), jak również nieznacznie większą frekwencję zmutowanego allela T w grupie kontrolnej (7,0 vs. 5,3%, p = ns). Odnotowano również, mimo braku różnic statystycznie istotnych, w grupie kontrolnej przewagę występowania zmutowanego allela 399Ile (7,0 vs. 2,6% w 28-32 tc., p = ns) oraz heterozygotycznego genotypu Thr399Ile (14,0 vs. 5,3% w 28-32 tc., p = ns). Zaobserwowano przewagę współwystępowania genotypów 20877GG TLR2 /8993CT w całej grupie kontrolnej zdrowych ciężarnych (14,0 vs. 8,0%, p = 0,0695). Wnioski. Polimorfizm Arg753 Gln genu TLR2 prawdopodobnie nie zwiększa ryzyka wystąpienia porodu przedwczesnego. Analiza wyników pracy sugeruje na możliwy modulujący wpływ zmutowanego allela 399Ile (polimorfizm Thr399Ile) genu na zmniejszenie ryzyka porodu przedwczesnego. Słowa kluczowe: poród przedwczesny, polimorfizm genetyczny, receptory Toll-like Wstęp Mechanizmy patofizjologiczne prowadzące do inicjacji porodu zarówno o czasie, jak i przedwczesnego (PTD preterm delivery) nie są do końca poznane. Obecnie wyróżnia się kilka głównych mechanizmów prowadzących do PTD, jak infekcja wewnątrzmaciczna, przedwczesna aktywacja matczyno-płodowej osi podwzgórze-przysadkanadnercza, matczyno-łożyskowe zaburzenia naczyniowe, nadmierne rozciągnięcie macicy oraz wpływ niektórych czynników środowiskowych [1, 2]. Ostatnio coraz większą rolę przypisuje się również genetycznym uwarunkowaniom wystąpienia porodu przed terminem, wskazując na możliwy udział około 300 genów [3, 4]. Są to geny warunkujące wzrost i rozwój płodu, gotowość hormonalną, gotowość skurczową macicy, kaskadę przemian fizjologicznych prowadzącą do rozpoczęcia porodu, wytrzymałość błon płodowych, skłonność do rozwoju infekcji, długość i elastyczność szyjki macicy [3]. Ponadto liczne badania wykazały, że nieprawidłowa odpowiedź na zakażenie może podlegać modulacji ze strony czynników genetycznych prowadząc do wystąpienia PTD. W ostatnich latach wskazano na korelację aktywności receptorów TLR (TLR Toll-like receptors) z występowaniem niektórych patologii położniczych, jak stanu przedrzucawkowego, bakteryjnej waginozy u kobiet ciężarnych, zakażenia wewnątrzowodniowego, przedwczesnego pęknięcia błon płodowych oraz porodu przedwczesnego [5, 6]. Receptory Toll-like są jedną z rodzin receptorów, które biorą udział w reakcji pomiędzy układem odpornościowym stymulowanym przez mikroorganizmy a reakcją obronną organizmu gospodarza. Aktywacja receptorów Toll-like powoduje uwalnianie peptydów antybakteryjnych oraz cytokin zapalnych [7]. Najlepiej poznanym mechanizmem prowadzącym do wystąpienia PTD, ze ścisłym wskazaniem na rolę receptorów TLR, jest model przedstawiony przez Romero i wsp. Na jego podstawie uważa się, że lipopolisacharydy bakterii Gram-ujemnych rozpoznawane są przez receptory z rodziny TLR, głównie receptor TLR-4. Pobudzenie tego receptora, poprzez aktywację szeregu białek powoduje indukcję syntezy cytokin, metaloproteinaz i innych enzymów. Czynnikiem bezpośrednio pobudzającym syntezę 1 Oddział Ginekologiczno-Położniczy, Szpital Wojewódzki w Poznaniu 2 Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 3 Pracownia Biologii Molekularnej, Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

90 E. Drews-Piasecka, A. Seremak-Mrozikiewicz, M. Barlik i wsp. tych substancji jest czynnik jądrowy NF-kappa B. Powoduje to uwolnienie przez makrofagi tkanek matczynych, płodowych i łożyskowych mediatorów reakcji zapalnych, które stymulują produkcję prostaglandyn przez owodnię, kosmówkę i doczesną, co prowadzi do wystąpienia przedwczesnej czynności skurczowej macicy [8, 9]. Receptory Toll-like są kluczowymi receptorami w odpowiedzi na działanie czynnika zapalnego indukującego poród przedwczesny. Zmiany ich aktywności spowodowane obecnością polimorfizmów genetycznych są prawdopodobnie jednym z ważniejszych czynników wpływających na rozwój PTD [6]. Gen kodujący TLR2 u ludzi zlokalizowany jest na chromosomie 4q32 i składa się z czterech eksonów, które kodują 784 aminokwasy. Omawiany w prezentowanej pracy polimorfizm genu TLR2 znajduje się w trzecim eksonie i spowodowany jest substytucją adeniny w miejsce guaniny w pozycji nukleotydowj 20877. Powoduje to zmianę sekwencji aminokwasowej białka, w miejsce argininy w pozycji 753 wbudowana zostaje glutamina (Arg753Gln). Gen kodujący receptor u ludzi został zmapowany w pozycji 9q32-q33 i składa się z czterech eksonów. Najczęściej badanymi polimorfizmami są Asp299Gly i Thr399Ile. W pracy analizowano polimorfizm Thr399Ile spowodowany zamianą cytozyny na tyminę w pozycji nukleotydowej 8993 (8993C > T). Celem pracy była ocena znaczenia polimorfizmów genów receptorów TLR-2 (Arg753Gln) oraz TLR-4 (Thr399Ile) w etiologii porodu przedwczesnego w populacji kobiet polskich. Materiał i metody Grupy badana i kontrolna Badania przeprowadzono w 2 grupach kobiet: 150 ciężarnych z PTD (średni wiek 29,2 ± 5,6 lat, średni tydzień zakończenia ciąży 33,7 ± 2,8 tc.) oraz 150 zdrowych ciężarnych, u których ciąża zakończyła się o czasie (średnia wieku 29,0 ± 3,7 lat, średni tydzień zakończenia ciąży 39,3 ± 1,2 tc.). U wszystkich kobiet z grupy kontrolnej ciąża zakończyła się urodzeniem zdrowego, donoszonego noworodka (średnia masa urodzeniowa 3497,13 ± 399,46 g). Ciężarne kwalifikowane były do badań w Klinice Perinatologii i Chorób Kobiecych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu oraz w Oddziale Ginekologiczno-Położniczym Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu w okresie od stycznia 2010 roku do czerwca 2011 roku. Wszystkie pacjentki zostały poinformowane o celu i zakresie przeprowadzanych badań i wyraziły na nie świadomą, pisemną zgodę. Na przeprowadzenie badań została udzielona zgoda Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu nr 103/10. Kryteriami włączenia do grupy badanej było zakończenie ciąży w przedziale czasowym od 22 + 0 do 36 + 6 tygodnia ciąży, obecność klinicznych wykładników porodu przedwczesnego (regularna czynność skurczowa, bóle podbrzusza, oddzielenie czopa śluzowego, rozwieranie szyjki macicy) i/lub przedwczesne pęknięcie błon płodowych, ciąża pojedyncza, przynależność do rasy kaukaskiej, narodowość polska. W celu dokładnej analizy wpływu badanych polimorfizmów genetycznych na występowanie PTD całą grupę kobiet badanych podzielono na trzy podgrupy w zależności od tygodnia zakończenia ciąży: a) 22-28 tc., b) 28-32 tc., c) 32-36 tc. Kryteriami włączenia do grupy kontrolnej było zakończenie ciąży > 37+0 tygodnia ciąży, ciąża pojedyncza, prawidłowy przebieg ciąży, przynależność do rasy kaukaskiej, narodowość polska. Charakterystyka pacjentek z obydwu grup badanej i kontrolnej przedstawiona została w tabeli 1. Kryteriami wyłączenia pacjentek z badania była obecność ciąży wielopłodowej, nadciśnienie ciążowe/stan przedrzucawkowy, wady macicy, niewydolność cieśniowo-szyjkowa, obecność wad płodu, cukrzyca ciążowa, wielowodzie i małowodzie, obecność infekcji uogólnionej oraz jatrogenny poród przedwczesny, obumarcie wewnątrzmaciczne oraz obecność chorób internistycznych matki. Analiza genetyczna Ocena występowania polimorfizmów genetycznych receptorów Toll-like (polimorfizm Arg753Gln (20877G > A) genu TLR2, polimorfizm Thr399Ile (8993C > T) genu ) przeprowadzana była metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR polymerase chain reaction) oraz polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP restriction fragment length polymorphism). Sekwencje starterów dla genu TLR2 były następujące: 5` - GAG TGG TGC AA GTA TGA ACT GGA, 5` - TCC CAA CTA GAC AAA GAC TGG TCT, natomiast dla genu : 5`- TGG CAA CAT TTA GAA TTA GTT AAC, 5` - CTC AGA TCT AAA TAC TTT AGG CCG (TIBMolBiol, Polska). Wynik reakcji PCR sprawdzano w 2% żelu agarozowym przy napięciu 80 V. Uzyskane produkty PCR dla genu TLR2 wielkości 262 par zasad i dla genu wielkości 227 par zasad poddawano hydrolizie enzymem restrykcyjnym Pst I (dla TLR2) i MspI (dla ). Hydrolizę prowadzono w temperaturze 37EC przez 16 godz. Wyniki analizowano w 3% żelu agarozowym w świetle UV. Po hydrolizie uzyskiwano następujące fragmenty dla poszczególnych genotypów TLR2 (polimorfizm Arg753Gln (G20877A)): homozygota GG 262 par zasad, heterozygota GA 262 pz, 134 pz, 128 pz, homozygota AA 134 pz, 128 pz oraz (polimorfizm Thr399Ile (C8993T)): homozygota CC 203 pz, 24 pz, heterozygota CT 227 pz, 203 pz, 24 pz, homozygota TT 227 pz. Analiza statystyczna Analizę statystyczną otrzymanych w pracy wyników częstości występowania genotypów i polimorficznych alleli badanych genów przeprowadzono przy zastosowaniu programu statystycznego SPSS 14.0 PL dla Windows. Wartość p < 0,05 przyjęto za statystycznie istotną.

Znaczenie polimorfizmów genów receptorów Toll-like-2 oraz Toll-like-4 w porodzie przedwczesnym 91 Tabela 1. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu Thr399Ile genu oraz polimorfizmu Arg753Gln genu TLR2 w grupach badanej i kontrolnej Thr399Ile (8993C > T) Grupa badana PTD (n = 150) obserwowana n (%) oczekiwana (%) Grupa kontrola (n = 150) obserwowana n (%) oczekiwana (%) WR 95%PU p CC 135 (90,0) 896 129 (86,0) 865 146 0,68-3,19 19 CT 14 (9,3) 101 21 (14,0) 130 63 0,28-1,37 14 TT 1 (0,7) 3 0 (0,0) 5 ) ) ) Suma 150 (100,0) 1000 150 (100,0) 1000 C 284 (94,7) ) 279 (93,0) ) 134 0,65-2,79 25 T 16 (5,3) ) 21 (7,0) ) 75 0,36-1,54 25 Suma 300 (100,0) ) 300 (100,0) ) TLR2 Arg753Gln (20877G > A) GG 138 (92,0) 922 141 (94,0) 935 73 0,26-1,96 33 GA 12 (8,0) 77 8 (5,3) 64 154 0,55-4,49 24 AA 0 (0,0) 1 1 (0,7) 1 Suma 150 (100,0) 10000 150 (100,0) 1000 G 288 (96,0) 290 (96,7) 83 0,32-2,13 41 A 12 (4,0) 10 (3,3) 121 0,47-3,17 41 Suma 300 (100,0) 300 (100,0) Rozkład genotypów w badanych grupach i podgrupach porównano testem chi -kwadrat z poprawką Fishera (istotność asymptomatyczna dwustronna). Po oznaczeniu wszystkich badanych polimorfizmów genetycznych wyznaczono ich wzajemne korelacje, które porównano za pomocą współczynnika korelacji Persona oraz testem chi -kwadrat. Wyniki Polimorfizm Arg753Gln (20877G > A) genu TLR2 Podczas analizy polimorfizmu Arg753Gln genu TLR2 zaobserwowano podobną częstość występowania niezmutowanego genotypu homozygotycznego Arg753Arg (20877GG) w grupie badanej oraz kontrolnej (92,0% vs. 94,0%, WR = 0,73, p = ns). Odnotowano również podobną częstość występowania heterozygot Arg753Gln (20877GA) w grupie pacjentek z PTD w porównaniu z grupą kontrolnej zdrowych kobiet ciężarnych (8,0 vs. 5,3%, WR = 1,54, p = ns). Częstość występowania allela Arg753 (20877G) (96,0 vs. 96,7%, WR = 0,83, p = ns) oraz zmutowanego allela 753Gln (20877A) (4,0 vs. 3,3%, WR = 1,21, p = ns) była podobna w obydwu badanych grupach pacjentek. Przy zastosowaniu testu chi -kwadrat Pearsona również nie wykazano różnic statystycznie istotnych w częstości występowania genotypów pomiędzy badanymi grupami (p = 0,40, istotność asymptomatyczna dwustronna) (tab. 1). Polimorfizm Thr399Ile (8993C > T) genu W czasie analizy polimorfizmu Thr399Ile genu odnotowano większą częstość występowania genotypu heterozygotycznego Thr399Ile (8993CT) w grupie kontrolnej (14,0 vs. 9,3%, WR = 0,63, p = ns), jak również nieznacznie większą frekwencję zmutowanego allela 399Ile (8993T) w grupie kontrolnej (7,0 vs. 5,3%, WR = 0,75, p = ns) w porównaniu z grupą kobiet z porodem przedwczesnym. Jedyny zaobserwowany genotyp zawierający dwa zmutowane allele Ile399Ile (8993TT) stwierdzono u jednej pacjentki z grupy badanej (0,7 vs. 0,0%). Częstość występowania allela dzikiego Thr399 (8993C) była podobna w obydwu badanych grupach ciężarnych (94,7 vs. 93,0% w grupie kontrolnej, WR = 1,34, p = ns). Badając różnice w częstości występowania poszczególnych genotypów z zastosowaniem testu chi -kwadrat Pearsona nie odnotowano różnicy w istotności statystycznej pomiędzy grupą badaną i kontrolną (p = 0,28, istotność asymptomatyczna dwustronna) (tab. 1).

92 E. Drews-Piasecka, A. Seremak-Mrozikiewicz, M. Barlik i wsp. Współwystępowanie badanych polimorfizmów W toku badań analizowano również współwystępowanie badanych polimorfizmów genów TLR2 i. W grupie badanej zaobserwowano podobne współwystępowanie genotypów homozygotycznych niezmutowanych GG TLR2/CC (83,3 vs. 80,0%, p = ns) oraz GA TLR2/CC (6,7 vs. 5,3%, p = ns) w porównaniu z grupą kontrolną. Uwagę zwraca fakt przewagi współwystępowania genotypów GG TLR2/CT w grupie kontrolnej zdrowych ciężarnych (14,0 vs. 8,0%, p = 0,0695) (tab. 2). Polimorfizm badanych genów w zależności od tygodnia zakończenia ciąży w grupie badanej W następnym etapie pracy podzielono grupę badaną ciężarnych z PTD na 3 podgrupy: a) kobiety, u których poród odbył się pomiędzy 22. a 28. tc., b) poród pomiędzy 28. a 32. tc. oraz c) poród pomiędzy 32. a 36.+6 tc. W każdej z tych grup analizowano częstość występowania genotypów i alleli poszczególnych polimorfizmów badanych receptorów Toll-like. Porównując częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmów Arg753Gln genu TLR2 w badanych trzech podgrupach kobiet z PTD w zależności od czasu trwania ciąży oraz w grupie kontrolnej nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych. Natomiast w przypadku polimorfizmu Thr399Ile genu, mimo braku różnic statystycznie istotnych, w grupie kontrolnej obserwowano przewagę występowania zmutowanego allela 399Ile (7,0 vs. 2,6% w 28-32 tc., p = ns) oraz heterozygotycznego genotypu Thr399Ile (14,0 vs. 5,3% w 28-32 tc., p = ns) (Tab. 3). Dyskusja W związku ze wzrastającym zainteresowaniem znaczeniem badań genetycznych w etiologii porodu przedwczesnego wiele analiz dotyczy roli polimorfizmów receptorów TLR. Jednak wyniki tych analiz nadal jednak pozostają niejednoznaczne i dotyczą występowania PTD. Kim i wsp. przeanalizowali lokalizację receptorów TLR2 i oraz zmianę ekspresji tych receptorów w błonach płodowych w grupie kobiet z zakażeniem wewnątrzowodniowym, u których wystąpiło przedwczesne pęknięcie błon płodowych i poród przedwczesny. Grupę kontrolną stanowiły kobiety z prawidłowym przebiegiem ciąży, u których ciąża zakończyła się po 37. tygodniu. Na podstawie przeprowadzonych badań udowodniono, że zarówno poród o czasie i poród przedwczesny powikłane występowaniem zakażenia wewnątrzowodniowego związane są ze zwiększoną ekspresją TLR2 oraz w błonach płodowych. Ponadto receptory TLR2 i 4 wykazują powinowactwo do ligandów obecnych na powierzchni patogenów odpowiedzialnych za występowanie przedwczesnego pęknięcia błon płodowych [6]. Za jeden ze stanów poprzedzających wystąpienie porodu przedwczesnego uważana jest obecność waginozy bakteryjnej. Bakteryjna waginoza stwierdzana u 40% kobiet ciężarnych może być przyczyną występowania poronień, zakażenia wewnątrzmacicznego, wystąpienia porodu przedwczesnego i małej masy urodzeniowej dziecka. W pracy Genc i wsp. udowodniono związek genu z kolonizacją pochwy przez bakterie z gatunku Gardnerella vaginalis i beztlenowe bakterie Gram-ujemne. W pracy Genc i wsp. u 238 kobiet między 18. a 22. tc. określono skład mikroflory pochwy. Oznaczano obecność genotypów polimorfizmu genu receptora. Stwierdzono, że u 10,3% kobiet nosicielek zmutowanego allela 896G doszło do wzrostu ph pochwy. Ponadto u kobiet nosicielek genotypu homozygotycznego 896AA odnotowano podwyższony poziom IL-1 (p = 0,01) i zwiększoną aktywność receptora IL-1ra (p = 0,00001), co mogło być związane ze zmniejszeniem odporności przed zakażeniami pochwy Gardnerella vaginalis i beztlenowymi pałeczkami Gramujemnymi. Zmiana mikroflory pochwy przyczyniała się do wystąpienia przedwczesnego pęknięcia błon płodowych, a co za tym idzie w wielu przypadkach do wystąpienia porodu przedwczesnego [5]. Grupa badana PTD (n = 150) Tabela 2. Współwystępowanie polimorfizmów genów TLR2 i w grupie badanej i kontrolnej TLR2 Suma GG GA AA CC 125 (83,3) 10 (6,7) 0 (0,0) 165 (90,0) CT 12 (8,0)* 2 (1,3) 0 (0,0) 14 (9,3) TT 1 (0,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,7) Suma 138 (92,0) 12 (8,0) 0 (0,0) 150 (100,0) Grupa kontrolna (n = 150) CC 120 (80,0) 8 (5,3) 1 (0,7) 129 (86,00) CT 21 (14,00)* 0 (0,0) 0 (0,0) 21 (14,0) TT 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Suma 141 (94,0) 8 (5,3) 1 (0,7) 150 (100,0) *p = 0,0695

Znaczenie polimorfizmów genów receptorów Toll-like-2 oraz Toll-like-4 w porodzie przedwczesnym 93 Tabela 3. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu Arg753Gln genu TLR2 oraz polimorfizmu Thr399Ile genu w badanej grupie kobiet z PTD w zależności od tygodnia zakończenia ciąży TLR2 Grupa badana PTD Grupa Arg753Gln 22-28 tc. 28-32 tc. 32-36 tc. kontrolna 20877G > A n (%) WR p n (%) WR p n (%) WR p n (%) GG 7 (87,5) 45 41 18 (94,7) 144 68 113 (91,9) 72 33 141 (94,0) GA 1 (12,5) 253 38 1 (5,3) 98 73 10 (8,1) 157 24 8 (5,3) AA 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,7) Suma 8 (100,0) 19 (100,0) 123 (100,0) 150 (100,0) G 15 (93,7) 51 44 37 (97,4) 127 64 236 (95,9) 81 41 290 (96,7) A 1 (6,3) 193 44 1 (2,6) 78 64 10 (4,1) 122 41 10 (3,3) Suma 16 (100,0) 38 (100,0) 246 (100,0) 300 (100,0) Thr399Ile 8993C > T CC 8 (100,0) 18 (94,7) 293 25 109 (88,6) 127 33 129 (86,0) CT 0 (0,0) 1 (5,3) 34 25 13 (10,6) 73 25 21 (14,0) TT 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,8) 0 (0,0) Suma 8 (100,0) 19 (100,0) 123 (100,0) 150 (100,0) C 16 (100,0) 37 (97,4) 278 26 231 (93,9) 115 40 279 (93,0) T 0 (0,0) 1 (2,6) 35 26 15 (6,1) 86 40 21 (7,0) Suma 16 (100,0) 38 (100,0) 246 (100,0) 300 (100,0) Istnieją doniesienia wskazujące na związek polimorfizmu 896A > G genu z obniżoną odpowiedzią organizmu na stymulacje przez lipopolisacharydy (LPS), co powoduje, ze nosicielki zmutowanego allela są narażone na zwiększone ryzyko infekcji bakteryjnej i w konsekwencji na zwiększone ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego. Arbour i wsp. wykazali, że zewnątrzkomórkowe domeny receptora związane są z osłabioną odpowiedzią na LPS. Stwierdzili, że polimorfizm Asp299Gly ma wpływ na stymulację LPS przez te receptory [10]. Lorenz i wsp. analizowali obecność polimorfizmów Asp299Gly i Thr399Ile genu (polimorfizmy pozostające w nierównowadze sprzężeń). Badanie przeprowadzono w populacji 440 kobiet fińskich, u których ciąża zakończyła się < 35 tc. (281 ciąż pojedynczych oraz 158 ciąż wielopłodowych). Częstość występowania zmutowanego allela 299Gly oraz genotypów heterozygotycznego Asp299Gly i homozygotycznego Gly299Gly była wyższa w grupie dzieci urodzonych przedwcześnie (różnice statystycznie istotne odpowiednio: p = 0,024, p = 0,028). W otrzymanych wynikach stwierdzono, że obecność zmutowanych alleli i genotypów genu receptora była związana ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia PTD [11]. W badaniach przeprowadzonych w populacji noworodków z Urugwaju zaobserwowano wzrost ryzyka wystąpienia PTD w przypadku noworodków nosicieli zmutowanego allela dla polimorfizmu Asp299Gly przy jednoczesnym pęknięciu błon płodowych [12]. Dane te wskazują na różnice w przebiegu odpowiedzi zapalnej w zależności od obecności różnych wariantów polimorficznych genów czynników biorących udział w procesie zapalnym. W przebiegu analizy polimorfizmów receptora TLR2 (16934T > A oraz Arg753Gln) oraz (Thr399Ile) wśród 305 dzieci wskazano na związek tego polimorfizmu TLR2 z występowaniem PTD. Odnotowano również związek jednoczesnego występowania zmutowanych alleli obydwu badanych polimorfizmów (16934A/753Gln) ze statystycznie istotnym krótszym czasem trwania ciąży (30,6 vs. 34,1-36,8 tc. w grupie dzieci nosicieli tylko jednego zmutowanego allela z badanych polimorfizmów, nosicieli alleli typu dzikiego, p = 0,02) [13]. W niektórych natomiast badaniach nie wykazano wpływu badanych polimorfizmów genów TLR na wystąpienie PTD. Badanie w populacji kobiet niemieckich przeprowadzone przez Härtella i wsp. nie potwierdziło istnienia powyższej zależności [14]. Celem tej analizy było określenie wartości predykcyjnej polimorficznych alleli genów kodujących poszczególne warianty układu immunologicznego jako markerów porodu przedwczesnego.

94 E. Drews-Piasecka, A. Seremak-Mrozikiewicz, M. Barlik i wsp. Przeanalizowano aż pięć polimorfizmów w dużej grupie wcześniaków o bardzo niskiej masie urodzeniowej, dzieci urodzonych w terminie porodu oraz ich matek. Wykazano, że ogólny wpływ badanych polimorfizmów na rozwój PTD wydaje się umiarkowany, a żaden z polimorfizmów nie jest istotnie związany z wystąpieniem zakażenia wewnątrzmacicznego jako przyczyną wystąpienia porodu przedwczesnego. Dla polimorfizmu Arg753Gln TLR2 potwierdzono podobną częstość występowania genotypów heterozygotycznego/homozygotycznego badanego wariantu (w grupie matek 6,9 vs. 6,1% oraz w grupie dzieci 5,7 vs. 5,1%). Dla polimorfizmu 896G stwierdzono częstość występowania genotypów homozygotycznego/heterozygotycznego w grupie matek 8,1 vs. 11,5% oraz w grupie dzieci 11,6 vs. 10,5% [14]. Wyniki prezentowane w powyższej pracy dotyczące polimorfizmu Arg753Gln TLR2 są zbieżne z obserwacjami zawartymi w pracy Härtella i wsp. Dla polimorfizmu Arg753Gln genu TLR2 odnotowano podobną częstość występowania heterozygot GA w grupie kobiet z porodem przedwczesnym (8,0 vs. 5,3% grupa kontrolna, WR = 1,54, p = ns), jak również zmutowanego allela A (4,0 vs. 3,3%, WR = 1,21, p = ns). W zakresie polimorfizmu Thr399Ile odnotowano natomiast przewagę występowania genotypu heterozygotycznego CT w grupie kontrolnej (14,0 vs. 9,3% w grupie badanej, WR = 0,63, p = ns). Taka sama obserwacja dotyczyła częstości zmutowanych alleli (7,0 vs. 5,3% w grupie badanej, WR = 0,75, p = ns). Szczególnie ciekawe wyniki obserwowano przy podziale pacjentek w zależności od czasu zakończenia ciąży, gdzie analiza pokazała przewagę występowania zmutowanego allela 399Ile w grupie kontrolnej (7,0 vs. 2,6% w 28-32 tc., p = ns). Te ciekawe obserwacje pozwoliły na wysunięcie wniosku o ochronnym wpływie obecności zmutowanego allela 399Ile polimorfizmu Thr399Ile na występowanie porodu przedwczesnego w badanej populacji kobiet polskich. Również w pracy Łukaszewskiego i wsp. dotyczącej populacji kobiet polskich oceniano polimorfizm Arg753Gln genu TLR2 oraz polimorfizm Thr399Ile genu w grupie kobiet z przedwczesnym pęknięciem błon płodowych i porodem przedwczesnym (33 kobiety z przedwczesnym pęknięciem błon płodowych między 30 a 36 tc.). Na podstawie zebranych danych stwierdzono, że przewaga występowania heterozygotycznego genotypu CT oraz zmutowanego allela T dla polimorfizmu Thr399Ile (C8993T) w genie, w grupie kontrolnej zdrowych kobiet ciężarnych może sugerować jego ochronną rolę w stosunku do występowania przedwczesnego pęknięcia błon płodowych i porodu przedwczesnego [15]. 2) Analiza wyników pracy sugeruje możliwy modulujący wpływ zmutowanego allela 399Ile (polimorfizm Thr399Ile) genu na zmniejszenie ryzyka porodu przedwczesnego. Piśmiennictwo [1] Hao K., Wang X., Niu T. i wsp. (2004) Candidate gene association study on preterm delivery: application of highthroughput genotyping technology and advanced statistical methods. Hum. Mol. Genet. 13(7): 683-691. [2] Esplin M.S., Varner M.W. (2005) Genetic factors in preterm birth the future. BJOG. 112(1): 97-102. [3] Ward K. (2003) Genetic factors in preterm birth. BJOG. 110: 117-121. [4] Ward K., Argyle V., Meade M. i wsp. (2005) The heritability of preterm delivery. Obstet. Gynecol. 106: 1235-1239. [5] Genc M.R., Vardhana S., Delaney M.L. i wsp. (2004) MAP Study Group. Relationship between a toll-like receptor-4 gene polymorphism, bacterial vaginosis-related flora and vaginal cytokine responses in pregnant women. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 116(2): 152-156. [6] Kim Y.M., Romero R., Chaiworapongsa T. (2004) Tolllike receptor-2 and -4 in the chorioamniotic membranes in spontaneous labor at term and preterm parturition that are associated with chorioamnionitis. Am. J. Obstet. Gynecol. 191: 1346-1355. [7] Szczepański M.J., Góralski I., Mozer-Lisewska I. i wsp. (2004) Rola receptorów toll-podobnych w odporności. Postępy Biologii Komórki 31: 543-561. [8] Romero R., Friel L.A., Velez Edwards D.R. i wsp. (2010) A genetic association study of maternal and fetal candidate genes that predispose to preterm prelabor rupture of membranes (PROM). Am. J. Obstet. Gynecol. 203(4): 361-370. [9] Romero R., Velez Edwards D.R., Kusanovic J.P. i wsp. (2010) Identification of fetal and maternal single nucleotide polymorphisms in candidate genes that predispose to spontaneous preterm labor with intact membranes. Am. J. Obstet. Gynecol. 202(5): 431-435. [10] Arbour N.C., Lorenz E., Schutte B.C. i wsp. (2000) mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. Nature America Inc. 15: 187-189. [11] Lorenz E., Hallman M., Marttila R. i wsp. (2002) Association between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and premature births in the Finnish population. Pediatr. Res. 52(3): 373-376. [12] Rey G., Skowronek F., Alciaturi J. i wsp. (2008) Toll receptor 4 Asp299Gly polymorphism and its association with preterm birth and premature rupture of membranes in a South American population. Mol. Hum. Reprod. 14(9): 555-559. [13] Krediet T.G., Wiertsema S.P., Vossers M.J. i wsp. (2007) Tolllike receptor 2 polymorphism is associated with preterm birth. Pediatr. Res. 62(4): 474-476. [14] Härtel Ch., Finas D., Ahrens P. i wsp. (2004) Polymorphisms of genes involved in innate immunity: association with preterm delivery. Mol. Hum. Reprod. 10(12): 911-915. [15] Łukaszewski T., Barlik M., Seremak-Mrozikiewicz A. i wsp. (2009) Polimorfizm genów receptorów Tollpodobnych typu 2 oraz 4 (TLR-2 i TLR-4) a ryzyko wystąpienia przedwczesnego pęknięcia błon płodowych. Ginekol. Pol. 80(12): 914-919 Wnioski 1) Polimorfizm Arg753Gln genu TLR2 prawdopodobnie nie zwiększa ryzyka wystąpienia porodu przedwczesnego. J Agnieszka Seremak-Mrozikiewicz Klinika Perinatologii i Chorób Kobiecych Uniwersytet Medyczny w Poznaniu ul. Polna 33, 60-535 Poznań e-mail: asm@data.pl

Znaczenie polimorfizmów genów receptorów Toll-like-2 oraz Toll-like-4 w porodzie przedwczesnym 95 Correlation of Toll-like-2 and Toll-like-4 receptors gene polymorphisms with preterm delivery Introduction. It is assumed that preterm delivery (PTD) is a complex phenomenon caused by different pathophysiological factors. Nowadays, important role is attributed to genetic determinants of PTD, pointing to possible relevance of polymorphic variants of candidate genes. Aim of study. To assess the relevance of polymorphisms of genes coding for selected Toll-like receptors in the etiology of PTD in Polish women. We analyzed following polymorphisms: Arg753Gln (20877G > A) of TLR2 gene and Thr399Ile (8993C > T) of gene. Material and methods. Study group consisted of 150 women with preterm delivery (22+0-36+6 gw.). To the control group 150 healthy pregnant women who delivered > 37 gw. were enrolled. All investigated polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results. The analysis of Thr399Ile polymorphism of gene shows higher incidence of CT heterozygous in the control group (14,0 vs. 9,3%, p = ns), as well as slightly higher frequency of mutated T allele in controls (7,0 vs. 5,3%, p = ns) compared to PTD group. In controls, beside lack of statistically significance, the overrepresentation of mutated 399Ile allele (7,0 vs. 2,6% in 28-32 gw., p = ns) and heterozygous Thr399Ile genotype (14,0 vs. 5,3% in 28-32 gw., p = ns) has been noted. Combination of 20877GG TLR2 / 8993CT genotypes in the control group was significantly higher compared to PTD (14,0 vs. 8,0%, p = 0,0695). Conclusions. The Arg753Gln polymorphism of TLR2 gene probably are not connected with the risk of preterm delivery. The study results points to the possible modulating effect of mutated 399Ile allele (Thr399Ile polymorphism) of gene in decreased risk of preterm delivery. Key words: preterm delivery, genetic polymorphism, Toll-like receptors