(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

PL 227091 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 227091 (21) Numer zgłoszenia: 419590 (22) Data zgłoszenia: 20.01.2014 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: 406879 (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12R 1/01 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) (54) Zestaw starterów do identyfikacji bakterii Legionella micdadei oraz Legionella bozemanae (43) Zgłoszenie ogłoszono: 03.08.2015 BUP 16/15 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2017 WUP 10/17 (72) Twórca(y) wynalazku: MONIKA JANCZAREK, Lublin, PL MARTA PALUSIŃSKA-SZYSZ, Lublin, PL

2 PL 227 091 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zestaw 2 starterów opracowanych na podstawie sekwencji genów pcs Legionella, służących do identyfikacji bakterii Legionella micdadei i Legionella bozemanae oraz sposób zastosowania tych starterów w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR. Bakterie należące do rodziny Legionellaceae to bardzo zróżnicowana grupa Gram-ujemnych bakterii, które w środowisku naturalnym egzystują wewnątrz niektórych gatunków pierwotniaków, a po przedostaniu się do sztucznych systemów dystrybucji wody, wywołują atypowe zapalenie płuc zwane chorobą Legionistów legionellozę oraz infekcję grypopodobną gorączkę Pontiac. Duże zagrożenie stanowi obecność bakterii Legionella w instalacjach wodnych występujących w ośrodkach takich jak: szpitale, sanatoria, stacje dializ, gabinety stomatologiczne, baseny oraz centra rekreacyjne. Siedliskiem tych bakterii mogą być również urządzenia wytwarzające rozproszone krople wody, np. systemy klimatyzacyjne, wieże chłodnicze, fontanny, komory zraszania. Jak podają Gomez-Valero i wsp., Infection, Genetics and Evolution 2009, Nr 9 czy też Lu i wsp., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, Nr 92, dotychczas wykryto 56 gatunków i 79 serotypów bakterii należących do rodziny Legionellaceae, odpowiedzialnych za największą liczbę zachorowań, na tzw. chorobę Legionistów zwłaszcza w Europie i Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że liczba wykrywanych przypadków stanowi jedynie do 10% wszystkich zachorowań. Stan ten spowodowany jest trudnościami w ustalaniu przyczyn zapalenia płuc wywoływanych przez bakterie Legionella wskutek braku szybkich, wiarygodnych i tanich testów diagnostycznych. Spośród bakterii z rodziny Legionellaceae, bakteriami wywołującymi chorobę Legionistów są L. pneumophila, L. longbeachae, L. bozemanae, L. micdadei, L. dumoffii, L. gormanii, L. drancourtii i L. anisa. Znane są sposoby identyfikacji bakterii z rodziny Legionellaceae, jednakże dotyczą one głównie najbardziej patogennego gatunku L. pneumophila i dodatkowo, oparte są na czasochłonnych metodach hodowli bakterii na podłożach mikrobiologicznych, bądź też skomplikowanych metodach z wykorzystaniem bardzo kosztownej i złożonej aparatury. Jak opisano w publikacjach Anonymous, 1998, AS/NZS3896:1998, Standards Australia, North Sydney, NSW, Australia; Anonymous, 1998, ISO 11731, International Organisation for Standardisation, Geneva, Switzerland, wywoływaną przez Legionella infekcję, potwierdza się poprzez hodowle bakterii na podłożach mikrobiologicznych. Standardowe metody hodowli bakterii Legionella na sztucznych podłożach - AS/NZS3896 - ISO 11731, wymagają długiego czasu inkubacji od 7 do 14 dni. Metody te bywają też nieskuteczne w przypadku, gdy materiał biologiczny zawiera nie hodowalne szczepy bakterii. Z kolei, znana z publikacji Cherry WB. i wsp., J. Clin. Microbiol., Nr 8, 1978, detekcja Legionella przy użyciu przeciwciał poliklonalnych połączonych z fluoresceiną, pozwalała na identyfikację jedynie szczepów Philadelphia należących do gatunku L. pneumophila. Opisany przez Edelstein i Edelstein, J. Clin. Microbiol., Nr 27, 1989, sposób identyfikacji bakterii z wykorzystaniem odczynnika Meriflour-Legionella zawierającego przeciwciała poliklonalne skonjugowane z barwnikiem fluorescencyjnym, umożliwia identyfikację większej liczby gatunków Legionella, jednakże nie pozwala na rozróżnianie bakterii należących do poszczególnych gatunków, a ponadto, identyfikacja Legionella z użyciem przeciwciał poliklonalnych daje reakcje krzyżowe z innymi bakteriami, np. Pseudomonas, co może skutkować uzyskaniem fałszywie pozytywnych wyników. Inne sposoby identyfikacji Legionella za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy DNA (PCR) i starterów specyficznych do wybranych genów, znane z publikacji Yanez i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 7, 2005; Joly i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 4, 2006; Stolhaug i Bergh, Appl. Environ. Microbiol., Nr 9, 2006; Yaradou i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 5, 2007; Behets i wsp., J. Microbiol. Meth., Nr 68, 2007; Chang i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 1, 2009, czy też Merault i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 5, 2011, skoncentrowane są głównie na identyfikacji jednego gatunku L. pneumophila i ilościowym oznaczaniu tych bakterii w próbkach biologicznych za pomocą Real-Time PCR oraz starterów specyficznych do genów: dota, 16S rrna, mip i rmla-csra. Wymienione sposoby, wykorzystują skomplikowane procedury z zastosowaniem drogich odczynników i starterów wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi oraz kosztowną aparaturę pomiarową, co istotnie ogranicza zastosowanie tych metod tylko w laboratoriach posiadających stosowny sprzęt analityczny.

PL 227 091 B1 3 Ponadto, jak wykazali Fittipaldi i wsp., Water SA, Nr 4, 2010, identyfikacja bakterii Legionella w technice Real-Time PCR z użyciem odczynnika SYBR Green, stwarza duże ryzyko pojawienia się fałszywie pozytywnych wyników, gdyż odczynnik ten wiąże się niespecyficznie do wszystkich dwuniciowych cząsteczek DNA, niezależnie od ich sekwencji nukleotydowej. Według Giglio i wsp., Appl. Envirion. Microbiol., Nr 12, 2005, podobne ryzyko stwarza użycie barwnika SYTO9 interkalującego do dwuniciowego DNA w metodzie identyfikacji Legionella z wykorzystaniem starterów LegF i LegR specyficznych do regionu 23S-5S rrna. Przedstawione metody identyfikacji Legionella z użyciem barwników fluorescencyjnych wymagają przeprowadzenia dodatkowych, kosztownych i czasochłonnych analiz obejmujących amplifikację i sekwencjonowanie otrzymanych produktów PCR, na co wskazują niżej wymienione publikacje: Kao i wsp., Environ. Sci. Pollut. Res. Int., Nr 9, 2013, a także Cloud i wsp., J. Clin. Microbiol. Nr 5, 2000; Stolhaug i Bergh, Appl. Environ. Microbiol., Nr 9, 2006; Svarrer i Uldum, Clin. Microbiol. Infect., Nr 18, 2011; Haroon i wsp., J. Infect. Chemother., Nr 18, 2012. Dodatkowe analizy uzyskanych produktów PCR, PCR-RFLP oraz hybrydyzacja dla identyfikacji Legionella opisują też Ko i wsp., J. Microbiol. Meth. 2003, Nr 54, 2003; Zhan i wsp., J. Clin. Microbiol., Nr 2, 2010, Joly i wsp., Appl. Environ. Microbiol., Nr 4, 2006; Su i wsp. J. Clin. Microbiol., Nr 5, 2009, a także opisy patentowe US 5491225 i 5614338. Inne metody do identyfikacji Legionella, znane z publikacji Lu i wsp., Appl. Microbiol. Biotechnol., Nr 92, 2011, wykorzystujące starter LS-LAMP dla genu 16S rrna do identyfikacji Legionella, są skomplikowane i nie nadają się do powszechnego zastosowania w laboratoriach diagnostycznych. Używane w sposobach identyfikacji Legionella, ujawnione w opisach patentowych US 5491225 i 5614338, startery specyficzne dla genu 5S rrna i dla mip, a także pięć par starterów specyficznych do sekwencji 16S rrna i gyrb, opracowanych przez Zhou i wsp., Appl. Microbiol. Biotechnol., Nr 91, 2011, są mało selektywne, umożliwiają rozróżnienie tylko niektórych bakterii należących do gatunków Legionella, a ponadto, wymagają potwierdzenia uzyskanych wyników za pomocą dodatkowych analiz molekularnych, znacząco wydłużających czas i podnoszących koszty diagnostyczne. Podobnie sposoby identyfikacji Legionella z użyciem reakcji Real-Time PCR opierające się na jednej parze starterów i odczynniku SYBR Green, niosą ryzyko uzyskania fałszywie pozytywnych wyników wskutek nieswoistego wiązania się tego barwnika do fragmentów dwuniciowego DNA niezależnie od ich sekwencji nukleotydowej. Znacząca większość znanych molekularnych metod diagnostyki Legionella dotyczy identyfikacji tylko jednego, najbardziej wirulentnego gatunku L. pneumophila. W oparciu o sekwencje nukleotydowe genów pcs i pmta L. pneumophila serotyp 3 zidentyfikowanych i opisanych w publikacjach Palusińska-Szysz i wsp., Materiały Zjazdowe Polskiego Towarzystwa Genetycznego, Lublin 2010; Janczarek i wsp., Materiały Zjazdowe Proceeding of XI Conference DIAGMOL 2010, Palusińska-Szysz i wsp., Microbiol Res., Nr 2, 2011, opracowane zostały startery do otrzymania sond do hybrydyzacji, 2 startery specyficzne do pcs: pcsf (5 -CTCTAGGATCCGTAATGAATCCAATAAA-3 ) i pcsr (5 -CATAAATTGGATCCAAACTCAATCTTTATTAT-3 ) oraz 2 startery specyficzne do pmta: pmta-f (5 -GTTTATAATATGAATTCTTCTTTT-3 ) i pmta-r (5 -TGTAATAATTTCCAATAGCCAAAA-3 ) bakterii L. pneumophila serotyp 3, a także startery pcs-df1 (5 -TACTGCMAGYGCWGCMTGTATTG-3 ) i pcs-dr3 (5 -GGATAATAAGTHCKRTARAARCTTA-3 ) oraz pmta-df2 (5 -GTTTATAATATTTATKCTTCTTTYTAYGA-3 ) i pmta-dr3 (5 -TGYAATAATTTCCAATAGCCAAA-3 ), służące do amplifikacji i sekwencjonowania genów pcs i pmta między innymi gatunku L. bozemanae. Wymienione startery służą wprawdzie do identyfikacji genu pcs w genomie bakterii z rodzaju Legionella, ale wykazują niską specyficzność w identyfikacji gatunku L. bozemanae. Celem wynalazku było opracowanie starterów oraz sposobu identyfikacji bakterii z gatunku L. bozemanae i L. micdadei, odpowiedzialnych za bardzo dużą liczbę zachorowań na legionellozę, służących do sporządzania szybkich, wiarygodnych i tanich testów diagnostycznych. Istotą wynalazku jest zestaw kolejno ponumerowanych 2 starterów do identyfikacji bakterii L. micdadei i L. bozemanae z rodziny Legionellaceae, przedstawionych w wykazie sekwencji.

4 PL 227 091 B1 Zestaw starterów do identyfikacji bakterii L. micdadei i L. bozemanae według wynalazku charakteryzuje się tym, że startery zawierają fragmenty genu pcs o określonej sekwencji i długości łańcucha nukleotydowego, posiadają różny stopień konserwatywności i podobne temperatury topnienia, dzięki czemu pozwalają na identyfikację wymienionych gatunków bakterii, w danym środowisku reakcji. Istotą wynalazku jest również sposób identyfikacji bakterii L. micdadei i L. bozemanae w łańcuchowej reakcji polimerazy, z użyciem pary starterów według wynalazku. Sposób identyfikacji bakterii Legionella micdadei i Legionella bozemanae, według wynalazku charakteryzuje się tym, że łańcuchowa reakcja polimerazy w obecności genomowego DNA wyizolowanego z próbki środowiskowej, przebiega z udziałem pary starterów stanowiących istotę wynalazku, użytych w tej samej mieszaninie reakcyjnej, o sekwencjach komplementarnych do określonych regionów genu pcs. Sposób identyfikacji Legionella micdadei i Legionella bozemanae, według wynalazku, został przedstawiony w poniższym przykładzie wykonania. P r z y k ł a d Z wyhodowanego materiału biologicznego zawierającego 8 gatunków bakterii Legionella znanymi metodami, wyizolowano 8 próbek niescharakteryzowanego DNA genomowego i każdą próbkę zawieszono w 50 l wody dejonizowanej. Tak przygotowane matryce użyto do przeprowadzenia reakcji PCR z udziałem 0,5 U polimerazy TaqI z kofaktorem MgCl 2 o stężeniu 1,5 mm, 2 l buforu i 0,2 mm mieszaniny deoksynukleotydów datp, dttp, dctp i dgtp (producent: FERMENTAS UAB, Litwa). Dla każdej z próbek DNA przeprowadzono reakcję PCR z użyciem układu starterów 1 i 2 (każdy starter o stężeniu 10 M użyto w ilości 2 l). Stosowano następujące parametry reakcji PCR: wstępna denaturacja 4 min w temp. 94 C i 30 cykli: denaturacja 1 min w temp. 94 C, przyłączanie starterów przez 40 s, w temp. 36 C, wydłużanie starterów w ciągu 60 s w temp. 72 C i końcowe wydłużanie starterów przez 4 min w temp. 72 C. Produkty PCR poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w 1,3% żelu agarozowym, ze standardowym buforem boranowym do elektroforezy (1xTBE) w czasie 40 min. i przy napięciu prądu 7V/cm, z użyciem markera M wielkości fragmentów DNA MassRuler Low Range DNA Ladder (producent: FERMENTAS UAB, Litwa). Żele wybarwiono standardowymi technikami i oglądano pod lampą UV. Zdjęcie przedstawione na rysunku, jako fig. 1, obrazuje profile uzyskane z użyciem starterów 1 i 2, odpowiadające produktom PCR: o wielkości 890 pz specyficznej dla L. bozemanae (studz. 2) oraz o wielkości 440 pz, specyficznej dla L. micdadei (studz.5). Wykaz sekwencji Starter 1 Starter 2 ATGAAYYYAAKMAARYYKMMMTT TGRCAAAATTGATARGCRGARGTAA Zastrzeżenia patentowe 1. Zestaw starterów do identyfikacji i różnicowania bakterii Legionella micdadei oraz Legionella bozemanae, przedstawionych w wykazie sekwencji. 2. Zestaw starterów według zastrz. 1, znamienny tym, że startery zawierają fragmenty genu pcs bakterii Legionella micdadei oraz Legionella bozemanae z rodziny Legionellaceae o określonej sekwencji i długości łańcucha nukleotydowego oraz charakteryzują się różnym stopniem konserwatywności i podobnymi temperaturami topnienia. 3. Sposób identyfikacji i różnicowania bakterii Legionella micdadei oraz Legionella bozemanae przy pomocy łańcuchowej reakcji polimerazy genomowego DNA, wyizolowanego z materiału próbki środowiskowej, znamienny tym, że przebiega z udziałem starterów jak określono w zastrz.1 i 2. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się układ dwóch starterów o sekwencjach komplementarnych do różnych regionów genu pcs.

PL 227 091 B1 5 Rysunek

6 PL 227 091 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)