238 Podstawy biochemii 7.2. Biosynteza białek Biosynteza białka jest jednym z najważniejszych zjawisk współczesnej biologii. Podczas gdy w przyrodzie nieożywionej nowe drogi uzyskiwania energii mogą być odnajdywane dzięki postępowi fizyki nuklearnej, odpowiedź na pytanie o sterowanie podstawowymi procesami organizmów żywych można uzyskać badając naturę chemiczną i biologiczne funkcje białek. Intensywność biosyntezy białek charakteryzuje średnia szybkość syntezy łańcuchów polipeptydowych, wynosząca w komórkach bakterii 16-17 reszt aminokwasowych w ciągu jednej sekundy, 7-8 w komórkach drożdży i 5-7 w komórkach ssaków. Synteza cząsteczki globiny w retikulocytach królika trwa 20 sekund, podczas gdy cząsteczki owoalbuminy jajowodu kury i białek wątroby szczura 80 sekund. W ciągu 1 minuty w retikulocycie królika syntetyzowanych jest 5 10 4 cząsteczek globiny, w komórce jajowodu kury 6 10 5 cząsteczek owoalbuminy, podczas gdy komórki gruczołowe jedwabnika są w stanie wyprodukować w tym samym czasie 38 10 11 cząsteczek fibroiny. Przełomowym momentem w wyjaśnieniu mechanizmu biosyntezy białka było ustalenie roli jaką w procesie syntezy łańcuchów polipeptydowych pełnią poszczególne rodzaje kwasów rybonukleinowych (RA). a każdym etapie ciągu procesów prowadzących do syntezy białek udział cząsteczek RA polega na przekazywaniu informacji o strukturze nowo syntetyzowanych cząsteczek białkowych. Matrycowy mechanizm biosyntezy polimerów białkowych, gwarantujący bezbłędne odtwarzanie informacji o ich pierwotnej strukturze zakodowanej w cząsteczce kwasu dezoksyrybonukleinowego (DA), stanowi specyficzną właściwość żywej materii. Jest przykładem prawidłowości towarzyszących powstaniu i rozwoju biologicznych form żywej materii. Mniej efektywny mechanizm zwykłej chemicznej syntezy, podstawą której są chaotyczne zderzenia molekuł, zostaje tu zmieniony w ukierunkowaną syntezę o wydajności miliard razy przewyższającej syntezę w systemach nieuporządkowanych. Doniosłe znaczenie w odpowiedzi na pytanie o mechanizm biosyntezy białek miało wyjaśnienie miejsca jej lokalizacji w aparacie rybosomowym komórki i skonstruowanie systemów bezkomórkowych, gdzie jedyną strukturą, na której przebiegała biosynteza białka, były rybosomy. Wyjaśnienie ich budowy i funkcji przyniosło nieocenioną informację na temat biosyntezy białka i molekularnych mechanizmów jej przebiegu. Mechanizm biosyntezy białka. gólny schemat biosyntezy białka przedstawia rys. 7.5. bejmuje on trzy etapy przygotowawcze związane z transportem materii, energii i informacji do rybosomu oraz etap czwarty, w którym na podstawie kolejności nukleotydów mra odczytywana jest sekwencja łańcucha aminokwasów.
Rozdział 7. Przemiana białek 239 Rys. 7.5. Uproszczony schemat matrycowej biosyntezy białek (objaśnienie w tekście) Proces transkrypcji, czyli przepisywania informacji o kolejności ułożenia reszt aminokwasowych w cząsteczce syntetyzowanego białka, omówiony był wcześniej (prawa górna część rysunku). Informacja o kolejności ułożenia reszt aminokwasowych w syntetyzowanym białku zakodowana jest w aparacie genetycznym komórki w postaci sekwencji nukleotydów cząsteczki DA. Wraz z jej przepisaniem (transkrypcja) na sekwencję rybonukleotydów w cząsteczce informacyjnego RA (mra) transportowana zostaje do rybosomu, gdzie ulega przetłumaczeniu (translacja) na kolejne aminokwasy nowo powstającego łańcucha białkowego. Procesy związane z transportem substancji (18 proteinogenicznych aminokwasów i 2 amidy) i energii niezbędnej dla syntezy wiązań peptydowych (lewa górna część rysunku) oraz proces syntezy łańcuchów polipeptydowych na aktywnym translacyjnie rybosomie (środkowa część rysunku) zostały omówione w dalszych rozdziałach. Aktywacja i transport aminokwasów do rybosomów. Synteza wiązania peptydowego z wolnych aminokwasów przebiega z pochłonięciem energii w ilości ok. 12 kj/mol, co wskazuje na powiązania biosyntezy białka z procesami utleniania lub rozpadu związków zawierających wiązania makroergiczne. W roku 1955 M. ogland jako pierwszy przedstawił schemat dwustopniowej reakcji enzymatycznego procesu aktywacji aminokwasów. W pierwszym etapie wskutek wzajemnego oddziaływania aminokwasów z ATP powstaje aminoacyloadenylan i wydziela się pirofosforan. ydrolityczny
240 Podstawy biochemii rozpad pirofosforanu przy udziale pirofosfatazy zapewnia nieodwracalność reakcji powstawania aminoacyloadenylanu. Drugi etap polega na przeniesieniu aminokwasu z powstałego uprzednio aminoacyladenylanu na resztę adenozyny akceptorowego tra: Łańcuch C2 2 2 2 C C ~ P C 2 + R C 2 Enzym aktywujący (Syntetaza aminoacylo-tra) Aminoacylodenylan tra Łańcuch C2 2 2 P C 2 + 2 C C 2 C~ Kwas adenilowy Aminoacylo-tRA Aminoacyloadenylan jest mieszanym bezwodnikiem aminokwasu i reszty kwasu fosforowego adenozyno-5`-fosforanu. Swobodne aminoacyloadenylany jako bezwodniki w środowisku zbliżonym do obojętnego (p = 7,4) wyjątkowo łatwo wchodzą w reakcje z aminokwasami nawet przy bardzo małym stężeniu (10-3 mol/l). Reakcja przebiega bez udziału enzymów, a jej wynikiem jest powstawanie wiązań peptydowych. Z podobną szybkością acylują wolne, dostępne grupy aminowe cząsteczki białka. W tym samym czasie związane z enzymem aminoacyloadenylany są nieaktywne i w związku z tym nie mogą być wykorzystane w syntezie białka. Specyficzność reakcji aktywowania aminokwasów, według przedstawionego schematu, jest zbliżona do bezwzględnej i można ją traktować jako super specyficzną. W reakcji tej aktywowane są tylko naturalne L-izomery aminokwasów, podczas gdy izomery D nie biorą w niej udziału. Jakkolwiek niektóre homologi L-aminokwasów aktywowane są w równym stopniu co wzorcowe białkowe L-aminokwasy. R
Rozdział 7. Przemiana białek 241 Aktywacja katalityczna każdego proteinogenicznego aminokwasu realizowana jest za pośrednictwem enzymu specyficznego tylko dla danego aminokwasu. Enzymy te zostały wykryte u przedstawicieli wielu gatunków zwierząt, roślin (w tym też wodorostów) i mikroorganizmów, co świadczy o ich szerokim rozpowszechnieniu wśród żywych organizmów. Konserwatywność ich występowania wskazuje na istotną rolę jaką spełniają w biosyntezie białek. Enzymy aktywujące izolowane są w niskiej temperaturze z nadosadowej frakcji (p 5) podczas ultrawirowania rozcieńczonego homogenatu komórek przy 105.000 g w ciągu jednej godziny. Zawartą w nadsączu mieszaninę enzymów aktywujących aminokwasy wytrąca się kwasem octowym (p 5,3), dlatego też pierwotnie określano je jako p-5 enzymy. Zgodnie z aktualnie obowiązującym nazewnictwem są to syntetazy aminoacylotra (ARSazy). Badania ostatnich lat dowodzą, że syntetazy aminoacylo-tra występują w komórkach w postaci makrocząsteczkowych kompleksów, tzw. kodosomów. Przy stałej sedymentacji 26-29S i M ~1,4 megada kompleksy te łączą w sobie kilka ARSaz (specyficznych m.in. dla ala, gly, glu, leu i ser lub dla liz, met, arg, liz i try) oraz enzymy które je modyfikują i regulują ich aktywność. Są to m.in. kinazy białkowe, metylotransferazy, transferazy ADP-rybozylowe, fosfoproteinofosforanazy. Enzymy aktywujące aminokwasy są małostabilne i łatwo ulegają denaturacji tracąc przy tym aktywność. Do ich inaktywacji prowadzi działanie na komórki ultradźwiękami, a nawet krótkotrwałe przechowywanie. Dla ich prawidłowego działania konieczna jest obecność w środowisku reakcyjnym jonów Mg 2+, ponieważ wiązanie ATP przebiega z udziałem imidazolowego rodnika histydyny aktywowanego przez jon magnezu. Większość z ponad 50 wyizolowanych i oczyszczonych ARSaz posiada masy cząsteczkowe bliskie 100.000 Da, chociaż w wyjątkowych przypadkach sięgają one powyżej 200.000 Da (syntetazy glicylo- i fenyloalanino-tra). W przeważającej części ARSazy są dimerami lub tetrametrami (sporadycznie trimerami) i tylko, u niektórych, takich jak: arginylowe, alanilowe, aspartylowe, walinowe i izoleucynowe stanowią jeden łańcuch polipeptydowy złożony z ok. 1000 reszt aminokwasowych. Charakterystyczne jest, że podjednostki ARSaz o strukturze dimerycznej wykazują równoległą aktywność. Uwolnienie syntetyzowanego aminoacylo-tra z jednej z nich przebiega w momencie, gdy do drugiej w ślad za ATP i aminokwasem przyłącza się tra. Tak więc każda podjednostka w cząsteczce ARSazy posiada trzy strukturalnie odmienne centra wiązania substratów, przy czym ulokowanie się każdego substratu ułatwia zaakceptowanie następnego. W związku z tym w procesie aminoacylowania tra łatwo powstają potrójne kompleksy typu enzym-substrat. ajsłabiej z ARSazami wiążą się ATP (K S = 10-4 M), średnio dziesięć razy lepiej aminokwasy (K S = 10-5 M) i najmocniej tra (K S = 10-8 M). ARSazy są jednymi z najmniej stabilnych enzymów o aktywności wynoszącej od kilkudziesięciu do kilkuset obrotów na minutę.
242 Podstawy biochemii Mechanizm działania ARSaz poznany został na podstawie badań struktury ich aktywnego centrum oraz kinetyki przyspieszanych minireakcji aktywacji aminokwasów. Początkowo do ARSazy zostaje przyłączona cząsteczka ATP adenylująca resztę histydyny centrum aktywnego. Reakcja ta zachodzi z wydzielaniem cząsteczki kwasu pirofosforowego: 2 E C 2 ARSaza + P~ P~ P C 2 ATP 2 E C 2 ~ P C 2 + Adenilowana ARSaza Z adenylowaną ARSazą oddziałuje aktywowany za jej pośrednictwem aminokwas, dając w wyniku reakcji aminoacyloadenylan posiadający zdolność aminoacylowania rodników, zawierających wolny atom wodoru. W efekcie grupa aminowa zostaje przeniesiona do rodnika histydyny aktywnego centrum ARSazy, tworząc aminoacylowany enzym: E C 2 ~ C C 2 R Po związaniu tra przez enzym grupa aminoacylowa przenoszona jest w pozycję 3 - końcowej adenozyny (równanie reakcji patrz wyżej). U niektórych ARSaz aktywującą rolę reszty histydyny może pełnić grupa boczna kwasu glutaminowego. Podczas tworzenia kompleksu enzym-substrat ARSazy i tra ulegają zmianom konformacyjnym, ułatwiając reakcje aminoacylowania. Jednak najistotniejszym momentem ich wzajemnego oddziaływania jest zdolność bezbłędnego wzajemnego rozpoznawania odpowiadająca specyficzności aminokwasowej. Prawdo- P P Kwas pirofosforowy
Rozdział 7. Przemiana białek 243 podobnie jest ona wynikiem wielopunktowego oddziaływania enzymu i tra, przy czym istotna rola w rozpoznawaniu należy do antykodonu tra. Przez długi czas uważano, że wiązanie grupy aminoacylowej z cząsteczką tra ma miejsce na końcowym atomie węgla adenozyny w pozycji 3 -. kazało się jednak, że funkcję tę może pełnić również grupa hydroksylowa reszty rybozy przy węglu 2. Zjawisko to obserwuje się podczas aktywacji fenyloalaniny, leucyny i izoleucyny specyficznymi dla nich ARSazami. Syntetazy seryno- i treonino-tra warunkują przyłączenie grup aminoacylowych tylko przy węglu 3 rybozy, natomiast enzymy specyficzne dla tyrozyny i cysteiny w pozycjach 2 i 3. Prawdopodobnie grupa aminoacylowa ma zdolność wiązania zarówno węgla 2, jak i 3 rybozy aż do ustalenia równowagi: Uważa się, że możliwość zmiany miejsca aminoacylacji tra związana jest z preferencją do aktywacji właściwego aminokwasu przy jednoczesnym zapobieganiu włączania ich stereo-chemicznych odpowiedników (np. waliny i treoniny). Występujące w tym procesie błędy, polegające na włączaniu niespecyficznych dla danego tra aminokwasów, naprawiają ARSazay hydrolizując niespecyficzne aminoacyloadenylany. W związku z tym w procesie aktywacji zawsze realizowane jest selektywne przyłączenie aminokwasu do specyficznej dla niego cząsteczki tra i tworzenie kompleksu aminoacylo-tra dostarczającego do rybosomów wzbogaconych w energię reszt aminokwasowych. Za pomocą eksperymentów z zastosowaniem aminoacylo-tra o aminokwasach znakowanych izotopem 14 C udowodniono, że stanowią one jedyne źródło aminokwasów dla biosyntezy białka. W trakcie inkubacji radioaktywnych amino-
244 Podstawy biochemii acylo-tra obserwowano spadek zawartości aminokwasu w badanych preparatach i proporcjonalny wzrost w syntetyzowanym białku (rys. 7.6). P, imp/min 300 1 200 100 Rys. 7.6. Zależność promieniotwórczości próbek P (imp/min) od czasu inkubacji τ (min) podczas reakcji syntezy białka: 1 wzrost ilości C 14 -leucyny w białku; 2 spadek ilości C 14 -leucyny w preparacie aminoacylo-tra (objaśnienie w tekście) Aktywowany aminokwas rozpoznawany jest przez trzy kolejne nukleotydy w antykodonowej pętli tra (antykodon) łącząc się z odpowiadającą mu sekwencją mra (kodon). Wzajemne oddziaływanie kodonów mra z antykodonami aminoacylo-tra decyduje o kolejności uszeregowania aminokwasów w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym. W eksperymencie potwierdzającym tę prawidłowość cysteinylo-tra ulegał redukcji do alanylo-tra: 2 C(C 2 S)C~ tra cys 5 10 15 20 τ, min Re dukcja 2 C(C 3 )C~ tra cys + 2 S W układzie tym alanylo-tra cys zawiera resztę alaniny przyłączoną do tra, który posiada antykodon cysteiny. Do syntetyzowanego białka w pozycję cysteiny wprowadzane są reszty alaniny. Jednoznacznie wskazuje to na fakt, że cząsteczka tra odpowiada za umiejscowienie złączonej z nią reszty aminoacylowej w nowo syntetyzowanym białku. W związku z tym syntetazy aminoacylo-tra nazywane były pierwotnie kodazami lub szyfrazami. Jednak na wniosek komisji do spraw nazewnictwa enzymów zaniechano stosowania tych terminów wprowadzając w ich miejsce ogólną nazwę syntetaz aminoacylo-tra. Mechanizm syntezy łańcucha polipeptydowego. We wszystkich strukturalnych elementach komórki (jądro, mitochondria, chloroplasty) biosynteza białek przebiega na rybosomach. Dlatego badanie struktury, właściwości oraz mechanizmu ich oddziaływań z substancjami wyjściowymi do biosyntezy białek doprowadziło do określeń prawidłowości w syntezie białek. 2
Rozdział 7. Przemiana białek 245 Budowa i właściwości rybosomów. Rybosomy są ciałkami rybonukleoproteinowymi o średnicy 0,01-0,025 nm, obecnymi głównie w cytoplazmie komórek roślin, zwierząt oraz bakterii w ilości kilkudziesięciu tysięcy w każdej z nich. Rybosom składa się z dwóch podjednostek: małej i dużej, z których każda jest kompleksem rybosomowych RA (rra) i wielu białek rybosomowych. Jednym ze sposobów odróżnienia rybosomów od ich podjednostek jest umieszczenie próbki w probówce rotora i odwirowanie jej z dużą szybkością. Powoduje to rozdzielenie frakcji mikrosomowej, jądrowej i mitochondrialnej. Szybkość sedymentacji jakiejkolwiek cząsteczki jest wprost proporcjonalna do sił grawitacyjnych (sił odśrodkowych działających podczas wirowania). Stała sedymentacji zależy wyłącznie od kształtu, wielkości oraz gęstości cząstki i jest niezależna od siły odśrodkowej. Stałą sedymentacji mierzy się zwykle w jednostkach Swedberga (S). Elipsoidalno-kulisty kształt i rybonukleoproteinowa budowa rybosomów wyodrębnionych z różnych źródeł są podobne, ale na podstawie stałej sedymentacji dzieli się je na dwie klasy: 70S i 80S. Pierwsze z nich zbudowane z podjednostek o stałej sedymentacji 50S i 30S występują w organizmach prokariotycznych, a także w jądrach, mitochondriach i chloroplastach eukariotów. Rybosomy o stałej sedymentacji 80S, złożone z podjednostek 60S i 40S, zlokalizowane są w cytoplazmie zwierząt i roślin wyższych. Charakteryzują się stabilnością w środowisku zawierającym jony Mg 2+ w stężeniu do 0,001M. Wraz ze wzrostem stężenia Mg 2+ do 0,01M ulegają dimeryzacji lub agregacji. Przy zmniejszeniu stężenia Mg 2+ do 0,0001M dysocjują na podjednostki 70(80)S 30(40)S + 50(60)S. Proces dysocjacji i powtórnej asocjacji podjednostek rybosomów kontrolują poliaminy poprzez zmianę stężenia innych dwuwartościowych kationów. Rybosomy są zbudowane w niemalże równych ilościach z RA i białka, ale proporcje obu składników zmieniają się w zależności od ich rodzaju (tabela 7.1) z tendencją do zwiększenia zawartości określonego białka. Tabela 7.1. Skład rybosomów Rodzaj rybosomu 70S 80S Subcząstki rybosomu 30S 50S 40S 60S RA Ilość białek Masy cząsteczkowe białek w tys. Da Proporcje RA/białko, % 16S 21 12-65 37/63 23S i 5S 34 9-31 36/64 18S 31 10-44 54/46 28S, 5S i 5,8S 41 10-54 41/59 prócz białek i kwasów nukleinowych w składzie rybosomów wykrywane są także w śladowych ilościach jony Mg 2+ i Co 2+, di- i poliaminy, kationy (Fe 3+, Zn 2+, Al 3+, Ba 2+, Sr 2+, i 2+, Cr 2+, 4 + ) oraz latentna rybonukleoza. W komórkach rybosomy ulegają hydratacji. Przyjmuje się, że na 1 g suchej masy rybosomów z retikulocytów przypada około 2,7 g wody hydratacyjnej. Dowodzi
246 Podstawy biochemii to wyjątkowo wysokiej porowatości tych struktur. Białko i RA w cząsteczkach rybosomów połączone są słabymi wiązaniami, które ulegają zerwaniu w roztworach soli odpowiadających stężeniu od 0,5 do 1M. Analogiczna dysocjacja ma miejsce podczas elektroforezy w środowisku zasadowym (p 12). ddziaływanie białek z kwasami nukleinowymi rybosomów ma charakter elektrostatyczny. Wysoka sumaryczna zawartość aminokwasów kwaśnych o wysokim ładunku dodatnim (12% lizyny, 11% argininy i 3% histydyny) przy jednoczesnym dużym udziale naładowanych ujemnie reszt fosforanowych sprzyja tworzeniu wymaganej ilości wiązań jonowych. Mechanizm biosyntezy peptydów. Enzymatyczny mechanizm biosyntezy peptydów zaproponowany został przez F. Lipmana i współpracowników (1968). Kolejne badania wykazały, że co najmniej 5 antybiotyków pochodzenia peptydowego, tj. gramicydyna, tyrocydyna, bacytracyna, cyklosporyna i mykobacylina, syntetyzowane są bez udziału kwasów nukleinowych i tra, przy czym zachowany jest prawidłowy układ aminokwasów wyznaczających pierwszorzędową strukturę tych oligopeptydów. Biosynteza gramicydyny S przebiega z udziałem kompleksu enzymatycznego, składającego się z dwóch frakcji białkowych o masach cząsteczek 280.000 i 100.000 D. Uzyskuje się je drogą rozdziału ekstraktu białkowego Bacillus brevis, stosując filtrację żelową na sefadeksie G-200. Łączenie obu frakcji w obecności aminokwasów, ATP i jonów Mg 2+ umożliwia syntezę in vitro cyklicznego dekapeptydu gramicydtny S (rys. 7.7). Lekka frakcja białkowa (100.000 D) izomeryzuje i aktywuje D-fenyloalaninę, natomiast ciężka (280.000 D) aktywuje 4 pozostałe L-aminokwasy. Enzymatyczna aktywacja aminokwasów zachodzi poprzez utworzenie aminoacyloadenylanów wymienionych aminokwasów (wg reakcji między wolnymi aminokwasami i ATP z wydzieleniem pirofosforanu) (etap pierwszy). W drugim etapie zachodzi przeniesienie grup aminoacylowych z aminoacyloadenylanów na grupę S reszty cysteiny obecnej w łańcuchu polipeptydowym tego samego enzymu, z utworzeniem tioestrów aminokwasów. Frakcja lekka, zawierająca D-fenyloalaninę z aktywowaną grupą C, po połączeniu z frakcją ciężką, zawierającą aktywowane aminokwasy (L-prolinę, L-walinę, L-ornitynę i L-leucynę), inicjuje biosyntezę wiązań peptydowych między wymienionymi aminokwasami w kolejności odpowiadającej ich ułożeniu w cząsteczce gramicydyny S. Bezpośrednie przeniesienie reszty D-fenyloalaniny na grupę aminową reszty L-proliny, połączonej wiązaniem tioestrowym z podjednostką ciężkiej frakcji białkowej, realizowane jest za pośrednictwem białka aminoacylującego (BAA), które występuje w kompleksie enzymatycznym. Posiada ono masę cząsteczkową równą około 20.000 D i zawiera pantoteinę jako grupę prostetyczną:
C Rozdział 7. Przemiana białek 247 C 3 BAA C P C 2 C C C C 2 C 2 C C 2 C 2 S C 3 Początkowo reszta D-fenyloalaniny przeniesiona zostaje na grupę S pantoteiny, a następnie na grupę 2 L-proliny. W ten sposób powstaje pierwsze wiązanie peptydowe w budowanej cząsteczce gramicydyny. W kolejnej fazie reszta dipeptydu D-Phe-L-Pro przenoszona jest z wiązania tioestrowego (wraz z podjednostką ciężkiej frakcji białkowej) na grupę S pantoteiny BAA i z niej na grupę 2 reszty waliny. Reakcja powtarzana jest do momentu, w którym zostanie zsyntetyzowany pentapeptyd D-Phe-Pro-Val-rn-Leu (zob. rys. 7.6). Ponieważ w tym samym czasie na ułożonym obok identycznym kompleksie enzymatycznym syntetyzowany jest dodatkowy pentapeptyd, po zakończeniu tego procesu ulegają one połączeniu według schematu głowa do ogona i tworzą cząsteczkę cyklicznego dekapeptydu gramicydyny S (rys. 7.7). Podobnie przebiega biosynteza tyrocydyny, kolejnego antybiotyku o budowie peptydowej D-Phe Pro Phe D-Phe Asn Leu rn Val Tyr Gln Kompleks enzymatyczny syntetyzuje cykliczny dekapeptyd, tworząc kolejno 10 wiązań peptydowych. W skład kompleksu wchodzą trzy frakcje białkowe: 1) M = 100.000 D (izomeryzuje i aktywizuje D-fenyloalaninę); 2) M = 230.000 D (aktywuje L-prolinę); 3) M = 460.000 D (aktywuje D-fenyloalaninę, asparginę, glutaminę, tyrozynę, walinę, ornitynę, leucynę, a także izomeryzuje fenyloalaninę). statnio udowodniono, że z udziałem kompleksu enzymatycznego przebiega biosynteza mykobacyliny, cyklicznego peptydu złożonego z 13 aminokwasów oraz bacytracyny A i cyklosporyny A, które zbudowane są z 11 aminokwasów. pisany powyżej pozarybosomowy system syntezy charakterystyczny dla wyżej wymienionych krótkich peptydów jest prawdopodobnie pierwotny ewolucyjnie w porównaniu z mechanizmem biosyntezy białek, zlokalizowanym na rybosomach, w którym podstawową rolę odgrywa proces translacji. Kod genetyczny jest zestawem reguł, które określają sposób, w jaki sekwencja nukleotydów w mra zostaje przetłumaczona na sekwencję aminokwasów w polipeptydzie. W jaki sposób informacja zapisana w postaci czterech zasad, wchodzących w skład mra (A adenina, G guanina, C cytozyna i U uracyl), może być tłumaczona na sekwencję łańcuchów polipeptydowych składających się z 20 aminokwasów?
248 Podstawy biochemii Rys. 7.7. Enzymatyczny mechanizm biosyntezy fragmentu cząsteczki gramicydyny S (objaśnienie w tekście) Jeśli każdej kombinacji nukleotydów w mra przypisać zdolność kodowania jednego aminokwasu w łańcuchu białkowym, to kodon w postaci dupletu (2 nukleotydów) dawałby tylko 4 2 możliwych kombinacji nukleotydowych stanowiących informację zaledwie o 16 aminokwasach (liczba par nukleotydów jest mniejsza od liczby aminokwasów budujących białka). Kodony w postaci kwadrypletów (4 4 możliwych kombinacji) mocno przewyższałyby liczbę aminokwasów. Tak więc układ trzech nukleotydów (tryplet), dający 4 3 możliwych kombinacji, pozwala na utworzenie 64 kodonów zdolnych zapisać informacje o sekwencji wszystkich syntetyzowanych białek.
Rozdział 7. Przemiana białek 249 Dupletowy kod Trypletowy kod Kwadrypletowy kod (4 2 = 16) (4 3 = 64) (4 4 = 256) AA UU GG CC AAA UUU GGG CCC AAAA UUUU GGGG CCCC AU UA GA CA AAU UUA GGA CCA AAAU UUUA GGGA CCCA AG UG GU CU UAA AUU AGG ACC itd. AC UC GC CG AUA UAU GAG CAC AAG UUG GGU CCU GAA GUU UGG UCC AGA UGU GUG CUC AAC UUC GGU CCG CAA CUU CGG GCC ACA UCU GCG CGC AUG UAG GUA CUA AGU UGA GUA CUA AGC UAC GAC CAG ACG UCA GCA CGA AUC UGC GUC CUG ACU UCG GCU CGU Trypletowy charakter kodu genetycznego został udowodniony eksperymentalnie poprzez ustalenie składu jakościowego reszt nukleotydowych, wchodzących w skład kodonów stanowiących informację o aminokwasach włączanych w łańcuch białkowy. Decydującą rolę w złamaniu kodu genetycznego odegrały doświadczenia irenberga (1961), polegające na syntezie polimerów nukleotydowych w układach pozakomórkowych, złożonych z cząsteczek kwasu poliurydynowego (poli U), rybosomów (pozbawionych mra), tra, syntetaz aminoacylotra, aminokwasów znakowanych izotopami 14 C lub 15 oraz z ATP, GTP i jonów Mg 2+, Mn 2+. W układzie tym możliwe okazało się otrzymanie reszt fenyloalaniny. Dalsze badania z zastosowaniem syntetycznych matryc homo- i heteropolirybonukleinowych, otrzymanych za pomocą polinukleotydofosforylazy, umożliwiły zakończenie prac zmierzających do ustalenia składu kodonów zawierających informację o wszystkich aminokwasach. Kolejną kwestią wymagającą wyjaśnienia było przypisanie każdemu kodonowi odpowiadającej mu sekwencji peptydowej, czyli określenie, jaka kolejność nukleotydów (np. ACU, CAU, UAC, AUC, CUA lub UCA) koduje dany aminokwas. dpowiedź na powyższe pytanie dały wyniki eksperymentów prowadzonych w laboratorium G. Korany, gdzie użyto syntetycznych m-ra, zawierających trinukleotydy o znanych sekwencjach i wprowadzano je w pozakomórkowy układ syntetyzujący białko. W rezultacie w końcu 1965 r. otrzymano pełne informacje na temat budowy kodu genetycznego. Z tabeli 7.2 wynika, że 61 z 64 kodonów zawiera informacje o 20 aminokwasach budujących białka. Trzy pozostałe, tzn. UAA (ochre), UAG (amber) i UGA (opal) nie kodują żadnego aminokwasu. Zwane są one kodonami terminacji
250 Podstawy biochemii i rozpoznawane przez białkowe czynniki terminacyjne odpowiadają za zakończenie syntezy łańcucha polipeptydowego. Tabela 7.2. Kod genetyczny Pierwsza Druga litera kodonu litera kodonu U C A G Trzecia litera kodonu Pierwsza Druga litera kodonu litera kodonu U C A G Trzecia litera kodonu U C Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Tyr Typ Gis Gis Gln Gln Cys Cys Try Arg Arg Arg Arg U C A G U C A G A G Ile Ile Ile Met Val Val Val Val Tre Tre Tre Tre Ala Ala Ala Ala Asn Asn Liz Liz Asp Asp Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gli Gli Gli Gli U C A G U C A G Szczegółowe prace prowadzone nad zapisem informacji genetycznej pozwoliły na ustalenie, że kod genetyczny ma charakter trójkowy, ciągły, niezachodzący, zdegenerowany i uniwersalny. Trójkowy charakter kodu genetycznego potwierdzony został szeregiem eksperymentów, wśród których najistotniejsze znaczenie miało: zestawienie liczby mutacji w genomie fagu T4 z pojawieniem się mutantów i ich rewersji do wyjściowego fenotypu po działaniu czynników mutagennych (F. Crick); określenie minimalnej długości fragmentu kwasu oligourydynowego zdolnego do związania fenyloalaniny-tra (M. irenberg); zsyntetyzowanie matryc oligorybonukleotydowych i zbadanie ich właściwości kodujących w układach pozakomórkowych (G. Khorana); przeanalizowanie wymiany aminokwasów w białkach homologicznych (G. Vittman). Wzajemne oddziaływanie trypletów nukleotydów (kodonów) w mra z trypletami nukleotydów (antykodonów) w tra, decydujące o wiązaniu odpowiedniego aminoacylo-tra z rybosomem, może dopuszczać sytuację, w której ten sam aminokwas kodowany jest przez więcej niż jeden kodon. kazuje się, że istotne znaczenie dla kodowania aminokwasu mają tylko dwie z trzech reszt nukleotydowych w kodonie (Lagerkwist, 1978), a w przypadku kodonów różniących się tylko trzecią literą możliwe jest odczytywanie tych samych aminokwasów (tab. 7.2). Zjawisko to wyjaśnia hipoteza tolerancji (wobble hypothesis), zgodnie z którą pierwsza zasada w antykodonie (koniec 5 ) może tworzyć niespecyficzne wiązania z trzecią zasadą kodonu (koniec 5 ), w następstwie czego jeden aminokwas może być rozpoznawany przez więcej niż jeden kodon. becnie przyjmowana jest także hipoteza dwa z trzech, przedstawiająca kod genetyczny jako kwazidupletowy (umownie pozornie dupletowy). Ciągłość kodu genetycznego wynika z faktu, że wszystkie kodony mra odczytywane są bez żadnych przerw, a ich kolejność wyznacza kolejność aminokwasów w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym.
Rozdział 7. Przemiana białek 251 iezachodzący charakter kodu genetycznego polega na tym, że żaden nukleotyd jednego kodonu nie jest składową częścią ani poprzedzającego, ani następnego. Zdegenerowanie kodu genetycznego określa możliwość kodowania jednego aminokwasu przez więcej niż jeden kodon. Jak wynika z tabeli 7.2, za syntezę leucyny i argininy odpowiada sześć różnych kodonów. Większość aminokwasów kodowana jest przez dwa lub cztery kodony, a tylko metionina i tryptofan przez pojedyncze. Uniwersalność kodu genetycznego to jego powszechny charakter u wszystkich organizmów żywych, jakkolwiek zmiany w porównaniu z kanonem przedstawionym w tabeli 7.2 spotykane są w mitochondriach, gdzie AUA koduje metioninę, UGA tryptofan, a AGA i AGG są kodonami terminacyjnymi. Podobną sytuację obserwować można u organizmów prokariotycznych, u których za inicjację syntezy łańcucha polipeptydowego odpowiadają AUG i GUG. Do wymienionych pięciu właściwości kodu genetycznego należy dodać jeszcze wspominaną powyżej obecność kodonów inicjacyjnych i terminacyjnych, układ seryjny (patrz serie kodonów w tabeli 7.2), symetryczność (obrót o 180 nie narusza układu silnych i słabych zasad), zgodność składu i położenia zasad w kodonie z polarnością i rozmieszczeniem aminokwasów, oraz jednoznaczność (jeden kodon odpowiada jednemu aminokwasowi). Czy zawsze kodowanie odbywa się z absolutną dokładnością i czy może zachodzić włączenie aminokwasu w łańcuch polipeptydowy niezgodnie ze strukturą kodonu? Uważa się, że określony poziom błędnego kodowania aminokwasów jest zaprogramowany ewolucyjnie. Mutacje powodujące zmiany w kodonach w mra, zgodnie z hipotezą tolerancji, nie muszą powodować zmian w procesie translacji ( kłamstwo uświęcone szlachetnym celem ). ieprawidłowe włączanie aminokwasów w łańcuch polipeptydowy obserwowano w warunkach doświadczalnych podczas syntezy peptydów w systemach pozakomórkowych. a poli(u) podczas syntezy fenyloalaniny włączana była również leucyna i izoleucyna oraz w mniejszej ilości seryna, tyrozyna i walina. Przyczyną syntezowania dodatkowych aminokwasów może być kwazidupletowość (dwa z trzech) kodu genetycznego i możliwość ograniczonej zgodności kodonu z antykodonem w procesie translacji. Poziom błędnego kodowania wzrasta przy zwiększaniu stężenia putrescyny, sperminy, etanolu w środowisku Mg 2+ oraz w warunkach obniżonego p i temperatury inkubacji. W warunkach fizjologicznych poziom kodowania aminokwasów nieodpowiednich dla antykodonu ma zakres od 10-4 do 10-3. Konsekwencją tych zmian może być zwiększenie różnorodności syntetyzowanych białek i wzrost tolerancji komórki na przeżywanie w niekorzystnych warunkach. Badania ostatnich lat zwracają uwagę na szczególny rodzaj syntezy białek pojawiających się w organizmie w odpowiedzi na infekcje i odpowiadające im procesy patologiczne. Według B.A. Korduma, w takich przypadkach synteza białek może mieć charakter samoodtwarzania się struktur przestrzennych łańcuchów polipeptydowych, przebiegając bez udziału kwasów nukleinowych i prowadząc do ich syntezy, akumulacji i aktywności w wyznaczonym procesie w wyniku samopowielenia.