POSTÊPY BIOLOGII BIA KO P53 KOMÓRKI STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU TOM WIRUSOWYM 36 2009 NR 4 (565 582) BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM P53 PROTEIN GUARDIAN OF THE GENOME IN THE VIRAL INFECTION Monika ZAPAŒNIK 1,2, Joanna Magdalena CYMERYS 1 1 Zak³ad Wirusologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie; 2 Pracownia Neuroplastycznoœci, Zak³ad Neurobiologii Molekularnej i Komórkowej, Instytut Biologii Doœwiadczalnej im. M. Nenckiego w Warszawie Streszczenie: P53 jest wielofunkcyjnym bia³kiem o masie cz¹steczkowej 53 kda, aktywowanym w odpowiedzi na ró norodne stresy komórkowe. Przyczynia siê do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G 1 oraz do indukcji apoptozy, bierze udzia³ w regulacji transkrypcji genów, w procesie ró nicowania siê komórek i angiogenezie, zaœ do jego najbardziej znanych funkcji nale y naprawa uszkodzeñ DNA. Niezbêdny w sytuacjach stresu komórkowego, mog¹cego zagroziæ integralnoœci genomu, nosi nazwê stra nika genomu. Zaka ona komórka d¹ y do uniemo liwienia wirusowi ekspresji genów uruchamiaj¹c szlak apoptozy, gdy jej œmieræ mo e powstrzymaæ rozprzestrzenianie siê zaka enia. W interesie wirusa le y jak najszybsze powielenie genomu i maksymalne odroczenie apoptozy, d¹ y on równie do aktywacji cyklu komórkowego. Ró ne wirusy w toku koewolucji z organizmem gospodarza wykszta³ci³y szereg z³o onych mechanizmów modyfikacji komórkowych szlaków biochemicznych zmierzaj¹cych ku autodestrukcji, w których podstawowym celem wirusa jest p53. W tym artykule dokonano ogólnej charakterystyki p53 zwracaj¹c szczególn¹ uwagê na strategie stosowane przez wirusy podczas zaka enia. S³owa kluczowe: p53, apoptoza, wirus, zaka enie. Abstract: P53 is a multifunctional protein of 53 kda, activated in response to various molecular stressors. It is involved in cell cycle arrest in G1 and induction of apoptosis, regulation of gene transcription, cell differentiation, angiogenesis, but its primary role is DNA repair. Necessary during molecular stress, when genome integrity is threatened, it was titled the guardian of the genome. In virus infected cell cellular approach is to prevent virus from gene expression and replication, activating apoptotic pathways, because cell death may defend a whole organism from infection. The aim of a virus is to replicate its genome quickly and delay apoptosis as far as possible to achieve it, as well as to activate cell cycle. Various viruses in course of coevolution with host organisms developed many complex mechanisms of biochemical cellular death pathways modification, in which the main aim of viral attack is p53. This article presents general characteristics of p53 particularly concentrating on viral strategies during infection, especially connected with the guardian of the genome.

566 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS Key words: p53, apoptosis, virus, infection. Wykaz stosowanych skrótów: Apaf-1 (apoptosis protease activating factor) czynnik aktywuj¹cy proteazy apoptotyczne; ASPP (apoptosis stimulating proteins of p53) rodzina bia³ek wzmacniaj¹cych odpowiedÿ p53; DISC (death-inducing signaling complex) kompleks incjuj¹cy œmieræ komórki; EBV (Epstein-Barr virus) wirus Epsteina-Barr, HHV4 (Human herpesvirus 4) ludzki herpeswirus 4; EMCV (Encephalomyocarditis virus) wirus zapalenia mózgu i miêœnia sercowego; HBV (Hepatitis B virus) wirus zapalenia w¹troby typu B; HCMV (Human cytomegalia virus) ludzki wirus cytomegalii, HHV5 (Human herpesvirus 5) ludzki herpeswirus 5; HCV (Hepatitis C virus) wirus zapalenia w¹troby typu C; HHV6 (Human herpesvirus 6) ludzki herpeswirus 6; HIV (Human Immunodeficiency Virus) ludzki wirus niedoboru odpornoœci; HPIV3 (Human Parainfluenza-3 virus) ludzki wirus parainfluency 3; HPV (Human papillomavirus) ludzki wirus papilloma; HSV (Herpes simplex virus) wirus opryszczki; Mcl-1 (myeloid cell leukemia sequence 1) bia³ko z rodziny Bcl-2 zaanga owane w proces apoptozy; MDM2 (murine double minute 2) bia³ko przyspieszaj¹ce ubikwitynacjê p53; mt-p53 (mutant type protein 53) postaæ zmutowana p53; NF-kB (nuclear factor kb) czynnik transkrypcyjny kb; PCNA (proliferating cell nuclear antigen) bia³ko zaanga owane w replikacjê DNA; prb (retinoblastoma 1 protein) czynnik transkrypcyjny; p53wt bia³ko kodowane przez gen prawid³owy p53; PyLT (Polyoma virus large T antigen) du y antygen T wirusa polioma; STAT (signal transducers and activators of transcription) bia³ka przekazuj¹ce sygna³y i aktywatory transkrypcji; SUMO (small ubiquitin-like modifier) bia³ko komórkowe aktywuj¹ce bia³ko p53; SV40 (Simian virus 40) ma³pi wirus SV40; TIGAR (TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator) bia³ko reguluj¹ce proces glikolizy i odpowiedÿ komórki na stres oksydacyjny; TNFR (tumour necrosis factor receptor) receptor dla czynnika martwicy nowotworu; TNF-a (tumour necrosis factor) czynnik martwicy nowotworu; USP7 (ubi-quitin specific peptidase 7) peptydaza specyficzna wobec ubikwityny. 1. WSTÊP P53 to wielofunkcyjne bia³ko o masie cz¹steczkowej 53 kda, z³o one z 393 aminokwasów, kodowane przez gen tpp53 zlokalizowany na chromosomie 17 [58,69]. Aktywowane jest w odpowiedzi na ró norodne stresory komórkowe, np. promieniowanie gamma, UV, hipoksjê, zmiany w budowie czynników wzrostowych, niedobór czynników troficznych, zmiany temperatury i potencja³u oksydoredukcyjnego, delecje nukleotydów czy zmiany w budowie mikrotubul. P53 przyczynia siê do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G 1 oraz do indukcji apoptozy, bierze udzia³ w regulacji transkrypcji genów (jest czynnikiem transkrypcyjnym), w procesie ró nicowania siê komórek, angiogenezie (dzia³a jako jej inhibitor), zaœ do jego najbardziej znamiennych funkcji nale y bezpoœrednie przeprowadzanie naprawy uszkodzeñ DNA [46,35,10,- 40,52,41,61,58,60]. Choæ niewymagane w normalnych procesach wzrostu i rozwoju komórek (poza okresem ycia p³odowego [59]), p53 staje siê niezbêdne w sytuacjach szeroko rozumianego stresu komórkowego mog¹cego zagroziæ integralnoœci genomu, za które to zas³ugi otrzyma³o zaszczytn¹ nazwê stra nika genomu [46,24,10,12,40,52,62,61,- 58,69]. Inn¹ niezwykle wa n¹ rol¹ tego bia³ka jest jego dzia³anie przeciwnowotworowe. W ponad po³owie wszystkich ludzkich nowotworów nastêpuje utrata funkcji p53, spowodowana najczêœciej mutacj¹ punktow¹ w genie p53. P53 jest supresorem nowotworów ang. tumour supressor [10,50,59,69,60]. Jako czynnik reguluj¹cy transkrypcjê wielu genów p53 ma wp³yw tak e na inne procesy komórkowe. Wyniki badañ z ostatnich lat wskazuj¹ na jego udzia³ w regulacji glikolizy i autofagii,

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 567 ró nicowania i starzenia siê komórek oraz przeprowadzania zmian struktur kostnych [59]. Badania myszy pozbawionych genu p53 (tzw. knockout'ów) wskazuj¹, obok zwiêkszonej zachorowalnoœci na ró nego typu nowotwory, na obni enie odpornoœci, zaœ wstêpne obserwacje pozwalaj¹ powi¹zaæ zmniejszon¹ aktywnoœæ p53 w komórce z jej opóÿnionym starzeniem siê [59,69]. Bia³ko to pe³ni funkcje istotne dla prawid³owego funkcjonowania komórki i ulega aktywacji w sytuacjach stresowych. Jako czynnik transkrypcyjny bia³ko p53 zbudowane jest z domen wi¹ ¹cych siê z DNA i w formie tetramerycznej wi¹ e siê do kwasów nukleinowych przyczyniaj¹c siê do aktywacji lub zahamowania transkrypcji znacznej liczby genów, siêgaj¹cej wg niektórych Ÿróde³ ponad 500 [59,58,66]. Poza centraln¹ domen¹ odpowiedzialn¹ za wi¹zanie bia³ka z DNA wyró niæ mo na domenê transaktywacyjn¹ od strony N-koñca (w tym miejscu zachodzi fosforylacja) oraz regulatorow¹ domenê C-koñcow¹, za poœrednictwem której bia³ko ulega oligomeryzacji wskutek przy³¹czania siê czynników regulatorowych [9,8,44,20,23,61,59]. P53 nale y do ma³ej rodziny bia³ek, której cz³onkami s¹ jeszcze dwa inne bia³ka: p63 i p73 [44,58]. Wykazuj¹ one równie aktywnoœæ transkrypcyjn¹, reguluj¹ apoptozê i cykl komórkowy, nie zaobserwowano jednak by pe³ni³y jak¹kolwiek rolê w procesie supresji nowotworzenia. W przeciwieñstwie do p53, ich aktywnoœæ koncentruje siê na normalnych procesach zachodz¹cych w komórce. Mutacja lub utrata funkcji p63 prowadzi do defektów koñczyn i zaburzeñ rozwoju skóry, zaœ analogiczny deficyt p73 powoduje zaburzenia neurologiczne i zmiany zapalne [44]. 2. P53 JAKO STRA NIK GENOMU Rola p53 w procesie apoptozy Apoptoza, bêd¹ca jedn¹ z form programowanej œmierci komórki PCD (Programmed Cell Death) to szereg zmian biochemicznych i morfologicznych zachodz¹cych w komórce. PCD jest zjawiskiem naturalnym i niezbêdnym do prawid³owego funkcjonowania wszystkich ywych organizmów, zachodz¹cym w yciu embrionalnym oraz postnatalnym w narz¹dach i tkankach w celu wyeliminowania niepotrzebnych, martwych b¹dÿ uszkodzonych komórek, w cytotoksycznoœci zale nej od przeciwcia³ oraz odpowiedzi komórkowej, nadawaniu przywileju immunologicznego, a wiêc w utrzymaniu homeostazy w organizmie [46,35,22,21,68]. Do aktywacji apoptozy zachodzi pod wp³ywem czynników fizycznych (np. promieniowanie jonizuj¹ce, hipertermia), cytotoksycznych (np. perforyny i granzymy A i B, reaktywne formy tlenu), hormonów i cytokin oraz deficytu czynników wzrostowych i troficznych [22,21,68]. Mo na wyró niæ dwa szlaki apoptotyczne: zewnêtrzny i wewnêtrzny. Pierwszy z nich rozpoczyna odebranie sygna³u œmierci przez receptory zlokalizowane w b³onie komórkowej, prowadz¹ce przez transdukcjê sygna³u do powstania kompleksu indukuj¹cego œmieræ DISC (Death Inducing Signalling Complex) oraz aktywacji kaskady proteaz serynowych zwanych kaspazami, zakoñczonej kondensacj¹ DNA j¹drowego i jego fragmentacj¹, a nas-

568 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS têpnie zmianami pozosta³ych organelli komórkowych. Przy wewnêtrznym przebiegu apoptozy kompleksu DISC powstaje niewiele, dochodzi natomiast do zmian potencja³u b³ony mitochondrialnej. Kaspaza-8 tnie proapoptotyczne bia³ko BID, prowadz¹c do wyp³ywu cytochromu c z mitochondrium, w nastêpstwie czego powstaje apoptosom, dochodzi do uruchomienia kaskady kaspaz, indukcji zmian na terenie j¹dra komórkowego oraz w obrêbie innych organelli [46,35,21,68,59]. Wprawdzie p53 zaanga owane jest w przebieg obu szlaków apoptozy, jednak silniej wi¹ e siê z wewnêtrznym, reguluj¹c ekspresjê genów koduj¹cych bia³ka bior¹ce udzia³ w procesie PCD [10,59]. Apoptozê zale n¹ od p53 wywo³uje dzia³anie takich czynników, jak: uszkodzenie DNA, niedobór czynników wzrostowych, ekspresja onkogenów j¹drowych, np. c-myc, E2F oraz ekspresja ró nych bia³ek wirusowych. W sytuacji, gdy bia³ko p53 znajduje siê we w³aœciwej lokalizacji w komórce (a wiêc w j¹drze komórkowym), gdy nie uleg³o mutacji ani inaktywacji w aden inny sposób, pod wp³ywem jego aktywnoœci transkrypcyjnej dochodzi do zwiêkszenia ekspresji proapoptotycznego bia³ka Bax i zmniejszenia iloœci antagonistycznie dzia³aj¹cego Bcl-2 [46,35,25,59,14,52,41]. Aktywowane p53 zwiêksza równie ekspresjê Fas przyspieszaj¹c jego transport na powierzchniê komórki, dziêki czemu zwiêksza siê szansa odebrania przez ni¹ sygna³u œmierci [46,35,25,58]. Analogicznie dochodzi tak e do zwiêkszenia iloœci receptorów Trail/DR5/ Killer [35,46]. Najnowsze wyniki badañ nad bia³kami Puma i Noxa [25,62,59,46], nale ¹cymi do rodziny Bcl-2, wskazuj¹ na ich udzia³ w procesie apoptozy oraz regulacji ich ekspresji przez p53. Ich rola sprowadza siê do poœredniego przerwania ci¹g³oœci zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej, a wiêc procesu dotychczas uznawanego za skutek aktywacji bia³ek Bax i Bak oraz interakcji Bax i Bac z Bcl-2 [25,59,62]. P53 reguluje ponadto ekspresjê wielu genów (np. TIGAR, sestryny), których produkty maj¹ zdolnoœæ regulowania odpowiedzi komórki na reaktywne formy tlenu ROS (Reactive Oxygen Species), a wiêc jednych z czynników indukuj¹cych apoptozê na szlaku wewnêtrznym, z udzia³em mitochondriów [46,35,25,59]. Chocia znaczenie p53 w procesie apoptozy w du ej mierze opiera siê na jego aktywnoœci transkrypcyjnej, zaobserwowano, i zmutowane bia³ko p53 (mt-53), które nie jest zdolne do aktywacji transkrypcji genów, zachowuje zdolnoœæ do indukcji apoptozy. P53 potrafi braæ równie bezpoœredni udzia³ w apoptozie, wchodz¹c w interakcje z innymi proapoptotycznymi bia³kami (np. Bax, BclXL) oraz inhibitorami apoptozy z rodziny Bcl-2 [25]. Bia³ko p53 stanowi najpotê niejszy orê komórki w sytuacji stresu komórkowego, nie od niego jednak e zale y jej ostateczny los. Skierowanie procesów zachodz¹cych w komórce na drogê apoptozy b¹dÿ zatrzymania cyklu komórkowego i naprawa zaistnia³ych szkód zale y od rozmiaru uszkodzeñ DNA, obecnoœci lub nie czynników niezbêdnych komórce do przetrwania w œrodowisku zewn¹trzkomórkowym, poziomu. p53 i modyfikacji potranslacyjnych czy wreszcie od typu komórki [46,35,25,63,59]. Ogólnie rzecz ujmuj¹c, niewielkie uszkodzenia DNA spowodowane dzia³aniem stresorów prowadz¹ do zatrzymania cyklu komórkowego w celu przeprowadzenia naprawy uszkodzeñ, zmiany bardziej powa ne prowadz¹ do apoptozy [35,46,63,59].

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 569 RYCINA 1. Udzia³ p53 w procesie apoptozy: zwiêkszenie ekspresji bia³ka Bax powoduje zahamowanie aktywnoœci antyapoptotycznego Bcl-2, dochodzi do przerwania ci¹g³oœci b³ony mitochondrialnej i wyp³ywu cytochromu c oraz czynnika Smac wi¹ ¹cego IAPs (inhibitory apoptozy) z mitochondrium; ATP-zale ny czynnik aktywuj¹cy proteazê-1 (Apaf-1) wi¹ e siê z nieaktywn¹ kaspaz¹-9 tworz¹c apoptosom, w którym dochodzi do aktywacji kaspazy-9 i uruchomienia kaskady kaspaz, w efekcie której dochodzi do œmierci komórki (opracowanie w³asne wed³ug www.weizmann.ac.il/home/ligivol/ apoptosis_project) Iloœæ p53 wymagana do skierowania komórki na szlak apoptozy jest wprost proporcjonalna do uszkodzeñ DNA i niewielki poziom aktywnego bia³ka powoduje wstrzymanie cyklu komórkowego, zaœ jego du a zawartoœæ inicjuje apoptozê. Powy sza zale noœæ jest wa nym elementem regulacji p53 i ma zwi¹zek z ró nym powinowactwem do promotorów indukowanych genów, które jest niskie w przypadku genów szlaku apoptozy i wysokie u genów koduj¹cych bia³ka reguluj¹ce cykl komórkowy [35,25,58]. Wstrzymanie cyklu komórkowego oraz indukcja apoptozy s¹ wiêc dwiema niezale nymi aktywnoœciami p53, mog¹cymi zachodziæ w komórce równolegle [25,51].

570 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS Na proapoptotyczn¹ aktywnoœæ p53 ma wp³yw szereg czynników. Wspomniane ju bia³ko Puma, którego ekspresja jest wynikiem dzia³ania aktywnego p53, najprawdopodobniej umo liwia uwolnienie zablokowanego p53 z cytoplazmy i dzia³anie pozatranskrypcyjne przez bezpoœrednie interakcje z innymi bia³kami. P53 tworzy kompleksy z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, m.in. p300/cbp pe³ni¹cymi funkcjê acetylotransferaz oraz JMY. Ten ostatni czynnik wspó³pracuje wraz z p300 zwiêkszaj¹c zdolnoœæ p53 do ekspresji niektórych genów apoptotycznych, np. Bax bez równoczesnej indukcji ekspresji genów koduj¹cych bia³ka odpowiedzialne za zatrzymanie cyklu komórkowego (np. CDKN1A koduj¹cego p21). Istniej¹ równie bia³ka wi¹ ¹ce siê z p53 i bezpoœrednio wp³ywaj¹ce na jego interakcjê z DNA, tzw. koaktywatory transkrypcyjne ASPP1 i ASPP2. Wzmacniaj¹ one przy³¹czanie siê p53 do promotorów genów koduj¹cych bia³ka proapoptotyczne, np.: Bax. STAT1 z kolei przyczynia siê do zwiêkszenia ekspresji Bax, Noxa i Fas. E2F1 wi¹ ¹c siê z p53 bezpoœrednio wzmacnia jego aktywnoœæ proapoptotyczn¹, a proces ten regulowany jest przez cyklinê A, która rywalizuje z p53 o zwi¹zanie E2F1. Czynnik transkrypcyjny NF-kB bierze udzia³ zarówno w pozytywnej, jak i negatywnej regulacji szlaku apoptozy zale nego od p53: jest m.in. silnym inhibitorem apoptozy w sytuacji zwi¹zania ligandu (np. z grupy TNF) przez receptory œmierci, potrafi te hamowaæ aktywnoœæ p53 wi¹ ¹c czynnik p300. Z drugiej strony obecnoœæ NF-kB jest wymagana w procesie indukowanej przez p53 apoptozy. Na zakoñczenie trzeba wspomnieæ o dwóch pozosta³ych bia³kach z rodziny p53: p63 i p73, z których obecnoœæ przynajmniej jednego jest konieczna do zajœcia apoptozy w wyniku aktywacji p53. Wymóg ten mo na t³umaczyæ ich potencjalnym wp³ywem na aktywacjê przez p53 transkrycji genów [35,25,52,41,59]. Rola p53 w regulacji cyklu komórkowego Cykl komórkowy to proces, podczas którego obserwuje siê w komórce wzmo on¹ aktywnoœæ biosyntetyczn¹, jej wzrost i podwojenie masy, po której nastêpuje podzia³ ca³ej zawartoœci komórki, w tym podzia³ j¹dra komórkowego i równomierny rozdzia³ materia³u genetycznego do komórek potomnych [12]. Cykl komórkowy jest regulowany przez kinazy bia³kowe Cdk (cyklin-dependent protein kinases), które katalizuj¹ fosforylacjê podstawowych bia³ek inicjuj¹cych i kontroluj¹cych syntezê DNA, a w efekcie aktywnoœæ podzia³ow¹ komórek. Kinazy te zlokalizowane s¹ w cytoplazmie, zaœ ich aktywnoœæ objawia siê cyklicznie i regulowana jest przez podjednostkê regulatorow¹ cykliny B. Wyró nia siê ró ne typy kinaz cyklinozale nych reguluj¹ce ró ne fazy cyklu komórkowego. Ich pojawianie siê w nastêpuj¹cych po sobie kolejno fazach cyklu komórkowego jest wynikiem uruchamiania ekspresji konkretnych genów w œciœle okreœlonej kolejnoœci. Wiêkszoœæ genów regulowanych przez kinazy cyklinozale ne mo na podzieliæ na dwie kategorie: geny wczesnej odpowiedzi, koduj¹ce czynniki transkrypcyjne i geny póÿnej odpowiedzi, koduj¹ce bia³ka katalizuj¹ce ogólne procesy metaboliczne komórki, w tym bia³ka cyklu.

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 571 Mechanizmy naprawcze zapobiegaj¹ce b³êdom, do których mog³o dojœæ w trakcie replikacji DNA, dzia³aj¹ w trakcie cyklu komórkowego na trzech poziomach: fazy G 1, S i G 2. Jako bia³ko odpowiedzialne za utrzymanie integralnoœci DNA, p53 wykrywa b³êdy w skopiowanej nici DNA w fazie G 1 i przy³¹cza siê do jednego z odcinków DNA, powoduj¹c zatrzymanie komórki w tej fazie cyklu komórkowego. P53 inicjuje transkrypcjê inhibitorów cyklin, wœród których znajduj¹ siê bia³ka nale ¹ce do rodziny p21 (p21, p27 i p57) oraz specyficzne inhibitory Cdk4 i Cdk6 nale ¹ce do rodziny bia³ek p15 i p16 [46,6,12,25,63]. Jako uniwersalny inhibitor cyklin bia³ko p21 powoduje równie zatrzymanie fosforylacji bia³ka Rb (retinoblastoma) oraz nagromadzenie siê nieufosforylowanej formy tego bia³ka w komórce. Rb ulega fosforylacji i defosforylacji w trakcie cyklu, zaœ przejœcie do kolejnego jego etapu uzale nione jest w du ej mierze od ufosforylowania Rb przez kinazy zale ne od cyklin, w którego efekcie dochodzi do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego E2F aktywuj¹cego ekspresjê genów potrzebnych do fazy S. Nieufosforylowana postaæ Rb pozostaje w kompleksie z E2F utrzymuj¹c jego inaktywacjê, w efekcie uniemo liwiaj¹c dalsze fazy cyklu komórkowego (ryc. 2) [5,12,25,55]. Bia³ko p21 aktywowane przez p53 zaanga owane jest ponadto w regulacjê naprawy DNA, zaœ przez hamowanie bia³ka PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) bia³ko pomocnicze dla DNA polimerazy d i e bezpoœrednio blokuje replikacjê DNA [12]. RYCINA 2. Mechanizmy, za poœrednictwem których p53 prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G. Aktywowane wskutek uszkodzenia DNA bia³ko p53 inicjuje transkrypcjê genów, m.in. p21, 1 uniwersalnego inhibitora kinaz zale nych od cyklin (Cdk), który uniemo liwia ufosforylowanie bia³ka Rb i tym samym uwolnienie i aktywacjê czynnika E2F (opracowanie w³asne wed³ug p53.free.fr/p53_info).

572 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS Po usuniêciu uszkodzenia p53 od³¹cza siê od DNA i zostaje zdegradowane. Jego brak w komórce powoduje zablokowanie inhibitora cyklin, przywrócona zostaje ich synteza i komórka podejmuje swój cykl. P53 wykazuje równie zdolnoœæ do zatrzymania komórki w fazie G 2. Wówczas dzia³a jako represor genów koduj¹cych cyklinê B1 i Cdk1, podjednostki czynnika inicjuj¹cego mitozê MPF (Mitosis Promoting Factor) oraz topoizomerazy II-alfa umo liwiaj¹cej tymczasowe rozdzielenie siostrzanych chromatyd [6]. 3. MECHANIZMY REGULACJI P53 Istnieje wiele mechanizmów reguluj¹cych aktywnoœæ bia³ka p53. Najprostszym sposobem regulacji jest zmiana jego lokalizacji na terenie komórki. Jako czynnik transkrypcyjny p53 znajduje siê na terenie j¹dra komórkowego, w niektórych przypadkach podlega jednak transportowi do cytoplazmy, w której zostaje unieczynnione i ulega degradacji w proteasomie. Dok³adne mechanizmy jego transportu oraz miejsce przechowywania w cytoplazmie nie s¹ jednak znane [66,58]. Do najwa niejszych regulatorów p53 nale y MDM2 (Murine Double Minute 2), równie HDM2 (Human Double Minute) bia³ko, którego ekspresjê indukuje samo p53, tworz¹c pêtlê ujemnego sprzê enia zwrotnego. W komórkach prawid³owych, których funkcjonowanie nie zosta³o w aden sposób zaburzone, MDM2 zwi¹zane jest z p53 unieczynniaj¹c je tym samym w tworzonym kompleksie. MDM2 wi¹ e siê do bia³ka od N-koñca, blokuj¹c domenê transaktywacyjn¹ i uniemo liwiaj¹c interakcje koaktywatorów transkrypcyjnych z p53, blokuj¹c aktywnoœæ transkrypcyjn¹ tego bia³ka [12,17,55,44,61,59,58,66]. MDM2 pe³ni ponadto inn¹ wa n¹ rolê w regulacji stabilizacji p53 przyczyniaj¹c siê do jego ubikwitynacji i degradacji w proteasomie. Niski poziom p53 w prawid³owych komórkach jest wynikiem ci¹g³ej degradacji jego nadmiernych iloœci przez enzymatyczne modyfikacje bia³ek w procesie ubikwitynacji. W tej specyficznej formie proteolizy nadrzêdn¹ rolê odgrywaj¹ enzymy zwane ligazami ubikwityny, które do degradowanego bia³ka przy³¹czaj¹ kilka cz¹steczek ubikwityny, po czym powsta³y kompleks jest wprowadzany do proteasomu. MDM2 jest ligaz¹ ubikwityny (E3) i przeprowadza ubikwitynacjê zarówno p53, jak i siebie [7,9,30,4,32,55,44,66,67]. Podczas tego procesu MDM2 powoduje eksport p53 z j¹dra do cytoplazmy, gdzie zachodzi jego degradacja. Proces ten jest kolejnym, istotnym mechanizmem regulacji funkcji p53. W cytoplazmie p53 traci aktywnoœæ, wyniki badañ wskazuj¹ zaœ, e w niektórych przypadkach transportu do cytoplazmy obecnoœæ MDM2 jest konieczna [7,9,30,26,66]. Pisz¹c o regulacji funkcji p53 przez MDM2 nie sposób nie wspomnieæ o bia³ku L11 i jego udziale w procesie proteasomalnej degradacji p53. L11 jest bia³kiem rybosomu, wi¹ e siê z MDM2 powoduj¹c zmianê jego lokalizacji w obrêbie j¹dra komórkowego i hamuj¹c jego zdolnoœæ do degradacji p53 poœrednio wiêc wp³ywa na utrzymanie w komórce wyjœciowej iloœci stabilnego i aktywnego bia³ka p53 [26,59]. Analogiczny wp³yw na stabilizacjê p53 ma bia³ko ARF (inaczej: p14arf), które po po³¹czeniu z MDM2 hamuje jego

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 573 aktywnoœæ ligazy E3, upoœledzaj¹c w ten sposób zdolnoœæ kierowania bia³ek do degradacji; utworzenie kompleksu ARF-MDM2 mo e równie powodowaæ relokalizacjê tego ostatniego na teren j¹derka i jego inaktywacjê [26,44,59]. Kolejnym, istotnym mechanizmem regulacji p53 jest jego fosforylacja. Bia³ko mo e ulegaæ fosforylacji od C-koñca, co ma zwi¹zek z jego aktywacj¹ oraz od N-koñca, wówczas wp³ywa na jego stabilizacjê w sytuacji zadzia³ania czynników stresowych [66]. P53 jest bia³kiem czêsto fosforylowanym i w zale noœci od miejsca fosforylacji proces ten mo e skierowaæ dzia³anie p53 na drogê apoptozy. Zaobserwowano, i fosforylacja reszt seryny bia³ka p53 w sytuacji stresu komórkowego wywo³anego wystawieniem komórki na dzia³anie promieniowania UV lub jonizuj¹cego prowadzi, przy udziale ró nych czynników (m.in. kinaz ATM i ATR), do indukcji ekspresji genów proapoptotycznych [58,66]. P53 jest przedmiotem wielu potranslacyjnych modyfikacji, wœród których mo na wyró niæ acetylacjê i SUMO-lacjê. Acetylacja C-koñca prowadzi do aktywacji zdolnoœci wi¹zania siê p53 do DNA. Za poœrednictwem tego mechanizmu na p53 oddzia³uj¹ równie koaktywatory transkrypcji, m.in. p300. Zahamowanie acetylacji os³abia aktywnoœæ transkrypcyjn¹ p53 [58,66]. Podobne do ubikwityny bia³ka SUMO maj¹ zdolnoœæ wi¹zania siê do jednej z reszt lizyny p53, która to modyfikacja prowadzi do zwiêkszenia aktywnoœci transkrypcyjnej tego bia³ka [44,20,23,58,66]. Funkcjê regulatorów p53 mog¹ ponadto pe³niæ inne bia³ka, z którymi wchodzi ono w interakcje. Wczeœniej opisano liczne czynniki bia³kowe reguluj¹ce aktywnoœæ p53 w procesie apoptozy. Interakcje z Ref-1 i HMG-1 prowadz¹ do aktywacji p53, nie wymagaj¹cej prawdopodobnie dodatkowych modyfikacji bia³ka, zaœ supresory nowotworzenia WT1, BRCA1 WRN, E2F1 i prb wzmacniaj¹ jego dzia³anie poprzez jego stabilizacjê lub uruchomienie aktywnoœci transkrypcyjnej [66,20,55]. Regulacja tak istotnego dla prawid³owego funkcjonowania komórki sk³adnika jak p53 jest z³o ona, wieloetapowa i anga uje wiele czynników, które b¹dÿ wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ w jego regulacji b¹dÿ oddzia³uj¹ z bia³kiem bezpoœrednio. Dok³adne mechanizmy ich dzia³ania s¹ wci¹ przedmiotem badañ i jak dot¹d nie zosta³y opisane. 4. BIA KO P53 I ZAKA ENIE WIRUSOWE W komórce zaka onej wirusem dochodzi do pewnego rodzaju walki o przesuniêcie istniej¹cej równowagi si³ na jedn¹ ze stron. Komórka d¹ y do uniemo liwienia wirusowi ekspresji genów i replikacji uruchamiaj¹c szlak apoptozy, gdy jej œmieræ mo e przynieœæ korzyœæ organizmowi. W interesie wirusa le y jak najszybsze powielenie swojego genomu i w tym celu stara siê maksymalnie odroczyæ apoptozê, d¹ y równie do aktywacji cyklu komórkowego. Ró ne wirusy w toku koewolucji ze swoim gospodarzem wykszta³ci³y szereg zaskakuj¹co z³o onych mechanizmów modyfikacji komórkowych szlaków biochemicznych zmierzaj¹cych ku autodestrukcji [2,19,50]. Niniejszy podrozdzia³ koncentruje siê na omówieniu tych z nich, w których podstawowym celem wirusa jest bia³ko p53.

574 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS OpóŸnianie procesu apoptozy Po wnikniêciu do komórki wirus nie tylko zagra a stabilnoœci jej genomu, ale równie prawid³owemu przebiegowi metabolizmu, stwarzaj¹c ryzyko transformacji nowotworowej. Wiêkszoœæ wirusów aktywuje bia³ko p53 w dwojaki sposób: indukuj¹c jego odpowiedÿ na uszkodzenie DNA spowodowan¹ replikacj¹ wirusowego genomu oraz za poœrednictwem kodowanych przez siebie bia³ek, modyfikuj¹cych wewn¹trzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne [19,39,21,28]. Zatrzymanie cyklu komórkowego b¹dÿ indukcja apoptozy przez aktywowane p53 mo e uniemo liwiæ powielanie genomu wirusa. Z tego te powodu wirusy wykszta³ci³y szereg strategii inaktywacji lub obejœcia mechanizmów dzia³ania bia³ka p53. Wirus Epsteina-Barr (EBV), nale ¹cy do DNA wirusów z podrodziny g-herpeswirusów, jest zdolny do zaka ania i transformacji ludzkich limfocytów B, przyczyniaj¹c siê do powstawania m.in. ch³oniaka Burkitta. Jak wskazuj¹ dane z eksperymentów in vitro, w zaka onych komórkach dochodzi do zatrzymania apoptozy, aktywacji cyklu komórkowego na etapie faz G 0 /G 1 oraz G 2 /M oraz mutacji w genie p53 [49,37,38,24,64]. Jednym z kodowanych przez EBV onkogenów jest póÿne bia³ko LMP1, uznawane za g³ówn¹ przyczynê obserwowanego wzrostu poziomu p53 w komórce, do którego dochodzi na skutek aktywacji przez LMP1 j¹drowego czynnika transkrypcyjnego NF-kB. EBV, w przeciwieñstwie do innych onkogennych wirusów DNA, nie powoduje bezpoœredniej degradacji p53. Aktywacja NF-kB przez LMP1 prowadzi do indukcji bia³ka A20, zapobiegaj¹cego indukcji apoptozy przez TNF-a, dzia³aj¹c supresyjnie na apoptozê przebiegaj¹c¹ drog¹ p53-zale n¹. Ponadto LMP1 aktywuje sygna³y wzrostowe drog¹ TNFR-zale n¹, a jego najbardziej wyraÿn¹ rol¹ w supresji apoptozy jest zaœ wzrost ekspresji Bcl-2 bia³ka o dzia³aniu antyapoptotycznym, jak równie innego bia³ka o podobnym dzia³aniu Mcl-1 [49,64]. Supresjê indukowanej przez p53 apoptozy powoduje równie kodowane przez EBV bia³ko BHRF-1 bêd¹ce homologiem funkcjonalnym Bcl-2 [29,21]. Ludzki wirus cytomegalii (HCMV) wkrótce po wnikniêciu do komórki powoduje wzrost iloœci aktywnych cyklin E i B, bia³ka prb w stanie hiperfosforylacji oraz bia³ka p53. Zaka enia HCMV w okresie embriogenezy s¹ g³ówn¹ przyczyn¹ powstawania wrodzonych defektów, takich jak: g³uchota, œlepota, upoœledzenie umys³owe i mikroencefalia. Coraz czêœciej podkreœla siê równie rolê tego wirusa w procesie powstawania nowotworów, ze szczególnym uwzglêdnieniem raka prostaty i raka jelita grubego [8]. Wirus cytomegalii koduje dwa bia³ka wczesne, przyczyniaj¹ce siê do zahamowania procesu apoptozy IE1 i IE2, dzia³aj¹ce jak czynniki transkrypcyjne. IE2 ³¹czy siê z bia³kami wi¹ ¹cymi siê z TATA-box (czyli z prb i p53) i hamuje aktywnoœæ transkrypcyjn¹ p53. Bia³ko IE2 uniemo liwia p53 transaktywacjê m.in. p21, jednego z g³ównych docelowych bia³ek [8,57]. Zaobserwowano ponadto, i pod wp³ywem HCMV i EBV nastêpuje gromadzenie siê bia³ka p53 w okreœlonych miejscach cytoplazmy mo e byæ to jednym ze sposobów jego inaktywacji [8,57,42].

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 575 Ludzki herpeswirus 6 (HHV-6), nale ¹cy do podrodziny b-herpeswirusów atakuje g³ównie limfocyty B, mo e równie pozostawaæ w stanie utajonym w monocytach. HHV-6 koduje bia³ka wchodz¹ce w interakcje z p53 w celu uruchomienia cyklu komórkowego lub zahamowania apoptozy. Dane uzyskane z obserwacji prowadzonych in vitro wskazuj¹, e wirus ten koduje bia³ko otwartej ramki odczytu ORF-1 (U14), potencjalnie zdolne do supresji aktywnoœci transkrypcyjnej p53 przez jego zwi¹zanie [40,53]. U14 nie tylko wi¹ e p53 i uniemo liwia jego przedostanie siê do j¹dra komórkowego, ale obserwowano tak e obecnoœæ zwi¹zanego w ten sposób p53 w obrêbie nowopowsta³ych cz¹stek wirusowych. Nie uzyskano jak dot¹d jednoznacznego potwierdzenia supresyjnego wp³ywu kompleksu z U14 na aktywnoœæ p53, st¹d mo liwy jest udzia³ jeszcze innego, nie wykrytego dotychczas czynnika wirusowego [53]. Adenowirusy (Ad) nale ¹ do onkogennych DNA wirusów i choæ nie s¹ wi¹zane z procesem nowotworzenia u ludzi, ich ludzkie serotypy wywo³uj¹ powstawanie guzów u szczurów i chomików, zaœ wszystkie serotypy adenowirusów powoduj¹ transformacjê nowotworow¹ komórek gryzoni [48,39]. Genom tych wirusów ma z³o on¹ budowê i tworzy go kilka regionów koduj¹cych bia³ka wczesne, wœród których wyró niæ nale y E1A, E1B, E2A, E2B, E3 i E4orf6 [42]. Miêdzy bia³kami kodowanymi przez te geny dochodzi do z³o onych interakcji, przekierowuj¹cych wewn¹trzkomórkowe procesy biochemiczne w stronê jej œmierci lub prze ycia. Zdolnoœæ do unieœmiertelniania i transformacji wywo³ywana przez bia³ka regionu E1 wyra a siê tylko wtedy, gdy zablokuj¹ one œmieræ komórki. Jeœli geny kodowane w tym regionie nie ulegn¹ ekspresji, transformowane komórki bardzo szybko gin¹. Ekspresja genu E1A prowadzi do aktywacji apoptozy, ale dzieje siê tak jedynie w przypadku równoleg³ej ekspresji genu p53, którego produkt stabilizowany jest przez obecnoœæ bia³ek kodowanych przez E1A. Apoptoza wywo³ana przez bia³ka E1A za poœrednictwem p53 mo e byæ zablokowana przez produkty wirusowych genów z regionu E1B bia³ka E1B-19K i E1B-55K, które w kooperacji z bia³kiem E1A mog¹ doprowadziæ do stanu transformacji komórkowej. Bia³ko E1B o masie 19 kda hamuje apoptozê podobnie jak Bcl-2 powoduj¹c zablokowanie oligomeryzacji proapoptotycznych bia³ek Bak i Bax i uwolnienie cytochromu c z mitochondrium; E1B-55K bezpoœrednio wi¹ e siê z p53 od N-koñca, nie blokuj¹c jego wi¹zania E4orf6 z DNA, oraz ma zdolnoœæ tworzenia kompleksów z bia³kiem E4orf6 oba te bia³ka blokuj¹ aktywnoœæ transkrypcyjn¹ p53. E4orf6 to bia³ko kodowane przez region E4 genomu adenowirusów, które blokuje apoptozê indukowan¹ przez p53 przez bezpoœrednie zwi¹zanie z nim od strony C-koñca, co zapobiega gromadzeniu siê na terenie komórki bia³ka p53 [56,1,16,14,48,47,42,51,21]. Powy sze mechanizmy wskazuj¹, e w komórce zaka onej przez adenowirusy mog¹ dzia³aæ ró ne sposoby stabilizowania i utrzymywania na niskim poziomie bia³ka p53. Wi¹zanie i degradacja p53 W toku rozwa añ nad bia³kiem p53 i jego rol¹ w funkcjonowaniu zarówno prawid³owej, jak i zaka onej komórki warto przybli yæ odkrycie na pocz¹tku lat 60.

576 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS XX wieku ma³ego DNA wirusa, znanego jako Simian Virus 40 (SV40). Obecnie uwa a siê go za czynnik indukuj¹cy u zwierz¹t laboratoryjnych nowotwory o typie zale nym od drogi inokulacji (bia³aczki, miêsaki, ch³oniaki) [13]. Jednym z produktów kodowanych przez wczesne geny SV40 jest du y antygen T (Tag, inaczej LT) bia³ko uwa ane za g³ówny i najbardziej wszechstronny onkogen tego wirusa. Tag odpowiedzialny jest za zainicjowanie replikacji i transkrypcji genomu wirusa, zaœ dziêki aktywnoœci zale nej od ATP helikazy umo liwia utworzenie wide³ek replikacyjnych. Ze wzglêdu na swoje kompetencje Tag przy³¹cza siê do komórkowych czynników transkrypcyjnych oraz koaktywatorów transkrypcji, w tym tak e do p53 to w³aœnie w kompleksie z bia³kiem wirusowym Tag pierwszy raz zidentyfikowano je w komórce [13,39,21]. Wkrótce po zwi¹zaniu z p53 Tag inaktywuje jego zdolnoœæ do ³¹czenia siê z DNA i funkcjonowania w charakterze czynnika transkrypcyjnego [13,27,31,39,63]. Bez wzglêdu na mechanizm dzia³ania Tag, nie ma obecnie w¹tpliwoœci odnoœnie jego zdolnoœci wi¹zania p53 i inicjowania procesu transformacji nowotworowej zainfekowanych przez SV40 komórek [13]. Dzia³anie adenowirusów w zaka onych komórkach zosta³o opisane wczeœniej, w tym miejscu nale y jednak przypomnieæ kodowane przez ró ne regiony genomu tych wirusów bia³ka E1B-55K oraz E4orf6, z których ka de z osobna lub oba razem wi¹ ¹ p53, unieczynniaj¹c je w charakterze czynnika transkrypcyjnego. Bia³ka te tworz¹ kompleks i razem z komórkowymi bia³kami bior¹cymi udzia³ w ubikwitynacji wi¹ ¹ i degraduj¹ p53 [56,16,1,25,31,24,53]. Ludzkie wirusy brodawczaków, HPV, to 16 serotypów DNA wirusów, z których niemal wszystkie s¹ odpowiedzialne za powstawanie nowotworów u ludzi. Na czo³o wysuwa siê z tej grupy niew¹tpliwie HPV-16, odpowiedzialny za ok. 50% wszystkich raków szyjki macicy [27,52]. W procesie nowotworzenia indukowanym przewlek³ym zaka eniem jednym z wirusów HPV nadrzêdn¹ rolê przypisuje siê dwóm produktom wczesnych genów wirusowych bia³kom E6 i E7, zaanga owanym w proces regulacji transkrypcji genów. Podlegaj¹ one wspólnej ekspresji, a w zaka onej komórce wykazuj¹ funkcjonaln¹ wspó³pracê. E7 wi¹ e prb i uruchamia wstrzymany cykl komórkowy, E6 zaœ utrzymuje ten proces w czasie zapobiegaj¹c apoptozie poprzez zwi¹zanie p53 i poœredniczenie w jego ubikwitynacji i degradacji w proteasomie. Ze wzglêdu na fakt, i obecnoœæ E6 w komórce wi¹ e siê z niskim poziomem aktywnego p53, dochodzi do nagromadzenia w genomie komórki mutacji i b³êdów, prowadz¹cych do dalszych zmian zwi¹zanych z transformacj¹. W procesie ca³kowitej degradacji p53, oprócz E6, bierze udzia³ jeszcze bia³ko komórkowe E6AP, które w po³¹czeniu z aktywn¹ ubikwityn¹ dzia³a wraz z E6 jako ligaza ubikwityny (E3). E6 ³¹czy siê z E6AP i wspólnie przy³¹czaj¹ ubikwitynê do p53, które w³¹czone do tego kompleksu ulega degradacji. E6 przy³¹cza siê równie do p53 samodzielnie, wtedy jednak jego oddzia³ywanie na to bia³ko jest mniej skuteczne ni w obecnoœci E6AP [24,4,32,27,53]. Herpeswirus 4 (HHV 4) koduje dwa bia³ka wi¹ ¹ce p53. S¹ nimi BZLF1 i EBNA-5. W ten sposób powoduje zablokowanie apoptozy w komórkach, a EBNA-5 dodatkowo wzmacnia ten efekt wi¹ ¹c prb i zatrzymuj¹c cykl komórkowy [42]. Wirus hepatitis typu

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 577 C (HCV) nale y do wirusów o genomie ssrna(+), zaka a ponad 170 milionów ludzi rocznie i jest g³ówn¹ przyczyn¹ zapalenia w¹troby oraz nowotworów tego narz¹du. Interakcjê z bia³kiem p53 wykazuj¹ dwa kodowane przez niego bia³ka NS3 i NS5A, jednak udzia³ p53 w procesie zaka enia komórki przez HCV nie zosta³ w pe³ni poznany. Najprawdopodobniej jest g³ównym regulatorem replikacji genomu wirusa, pe³ni równie najpewniej funkcjê w procesie obrony komórki przed zaka eniem poœrednicz¹c w odpowiedzi przeciwwirusowej regulowanej przez interferony (IFN). Wykazano zaanga owanie p53 w zapobiegaj¹ce proliferacji procesy odpowiedzi na IFN, mechanizmy jego aktywnoœci nie s¹ jednak jasne. Zaobserwowano powstawanie kompleksów z³o onych z p53 i czynnika regulacji interferonów 9 (IRF9) w zaka onych komórkach, co pozwala przypuszczaæ, e bia³ko to bierze udzia³ w regulacji IFN w trakcie zaka enia. W œwietle powy szych informacji nie dziwi kodowanie przez HCV bia³ek wi¹ ¹cych p53, jest to strategia obronna wirusa maj¹ca na celu mo liwie jak najd³u sze przetrwanie w komórce [11]. Wirus hepatitis B (HBV) jest wirusem DNA wykorzystuj¹cym odwrotn¹ transkryptazê i uwa a siê go za jedn¹ z g³ównych przyczyn nowotworów w¹troby. HBV koduje wielofunkcyjne bia³ko HBx, bior¹ce udzia³ w regulacji transkrypcji, odpowiedzi komórki na stresy, degradacji bia³ek oraz regulacji wewn¹trzkomórkowych szlaków sygna³owych, a co za tym idzie ma swój wp³yw tak e na przebieg i procesy kontroli cyklu komórkowego, œmieræ komórki i jej transformacjê. Jako czynnik transkrypcyjny HBx reguluje aktywnoœæ szeregu genów komórkowych, w tym p53, ekspresja tego bia³ka jest blokowana przez HBx za poœrednictwem regulatorowego elementu jego promotora okreœlanego jako E-box. Wirusowy onkogen wi¹ e p53 blokuj¹c jego funkcjê transaktywacyjn¹, w tworzonym kompleksie zyskuje mo liwoœæ modyfikacji jego wp³ywu na procesy biochemiczne zachodz¹ce w komórce. Co wiêcej, HBx reguluje równie poziom ekspresji p53, bia³ko to jest nie tylko inhibitorem p53 dzia³aj¹cym w bezpoœredniej interakcji, ale ma tak e zdolnoœæ blokowania ekspresji jego genu [33]. Mutacje w genie p53 Mutacje punktowe w obrêbie genu p53 s¹ zjawiskiem powszechnym w wiêkszoœci nowotworów [24,5,34,39]. Unieczynnione w ten sposób bia³ko traci swoj¹ aktywnoœæ, umo liwiaj¹c modyfikacjê wewn¹trzkomórkowych szlaków regulacyjnych w kierunku transformacji. Do podobnych mutacji mo e równie dochodziæ wskutek obecnoœci w komórce wirusa, mutacje w p53 w komórkach zaka onych EBV s¹ regu³¹, a interakcja pomiêdzy p53 a adenowirusowym bia³kiem E1B-55Kd mo e powodowaæ ekspresjê zmutowanej, nieaktywnej transkrypcyjnie postaci p53 [24,1,23]. Nie wszystkie wirusy powoduj¹ce powstawanie nowotworów stosuj¹ ten sposób inaktywacji bia³ka, w komórkach zaka onych HPV zmutowana postaæ p53 nale y do rzadkoœci. Wynika to z faktu stosowania przez wirus alternatywnej strategii supresji, polegaj¹cej na wi¹zaniu p53 i kierowaniu na drogê szybkiej proteolitycznej degradacji. Zawartoœæ bia³ek kodowanych przez HPV w zaka onych komórkach koreluje ujemnie z zawartoœci¹ aktywnego p53, dziêki czemu wirus ma otwart¹ drogê do transformacji komórki [24,5,43].

578 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS Zmiany regulacji p53 Wirusy koduj¹ bia³ka wp³ywaj¹ce na wewn¹trzkomórkowe szlaki regulacyjne, umo liwiaj¹c w ten sposób replikacjê genomu wirusa. Modyfikacja szlaków regulacyjnych p53 jest jednym ze skutecznych mechanizmów obrony cz¹stek wirusowych przed supresyjnym dzia³aniem tego bia³ka. Wirus Polioma (Py), nale ¹cy do ma³ych wirusów DNA, powoduje ró ne nowotwory u myszy, szczurów, chomików i królików. Jego genom koduje 3 wczesne bia³ka, du y antygen T (PyLT), œredni antygen T (PyMT) i ma³y antygen T (PyST), z których koekspresja PyMT i PyST wp³ywa hamuj¹co na indukowane przez p53 zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozê na szlaku ARF-p53. ARF jest czynnikiem wi¹ ¹cym MDM2 i hamuj¹cym jego aktywnoœæ ligazy, co zapobiega skierowaniu p53 na drogê proteolitycznej degradacji. Wykazano, e wp³yw PyMT i PyST na ARF jest przeciwstawny, podczas gdy PyMT stymuluje aktywnoœæ ARF przyczyniaj¹c siê tym samym do zwiêkszenia stê enia p53 w komórce, PyST dzia³a na ARF hamuj¹co. PyMT dzia³a poœrednio moduluj¹c aktywnoœæ i przy³¹czaj¹c siê do ró nych bia³ek komórkowych o istotnym udziale w procesie regulacji szlaków wzrostowych aktywuje m.in. kinazê PI3 oraz kinazy Ras-Raf-MAP rozpoczynaj¹c transformacjê komórki. Nieprawid- ³owoœci szlaków sygnalizacyjnych prowadz¹ do aktywacji ARF i w konsekwencji do zwiêkszenia stê enia aktywnego p53 w komórce. Pomimo i PyMT dzia³a zapobiegawczo wobec procesu transformacji, wspólnie z PyST mog¹ do niej doprowadziæ, gdy bia³ko to zapobiega nagromadzeniu p53 w komórce za poœrednictwem ARF za pomoc¹ niewyjaœnionego jak dot¹d mechanizmu, w którym wa n¹ rolê odgrywa domena PP2A ma³ego antygenu T [39,24,20]. Infekcja komórek ludzkim wirusem opryszczki HSV (Herpes Simplex Virus) prowadzi do apoptozy. Proces ten przebiega jednak nieco odmiennie ni w zdrowych komórkach ze wzglêdu na fakt, i zaanga owane s¹ bia³ka wirusowe maj¹ce na celu zahamowanie œmierci komórkowej. Wiele genów wczesnych, œrednich i póÿnych genomu HSV-1 w³¹cza siê czynnie w modulacjê przebiegu procesu apoptozy w zaka onej komórce, w du ej mierze jest to jednak proces niezale ny od p53 [36,3]. Jedno z kodowanych przez wirus bia³ek ICP0 wykazuje jednak zdolnoœæ interakcji z p53 i modyfikacji jego regulacji. Zaobserwowano, e ³¹czy siê ono z p53 stymuluj¹c jego ubikwitynacjê i degradacjê, chroni¹c komórki przed apoptoz¹ indukowan¹ promieniowaniem UV. ICP0 reguluje ekspresjê i szlaki dzia³ania p53 za poœrednictwem ligazy E3 oraz interakcji z USP7, istniej¹ równie niejednoznaczne dane wskazuj¹ce, i wp³ywa bezpoœrednio na stabilizacjê tego bia³ka [3]. Kodowane przez wirus Epsteina-Barr (EBV) bia³ko BZLF-1, wi¹ ¹ce siê z DNA komórki gospodarza i warunkuj¹ce ekspresjê genów wirusowych, mo e wp³ywaæ bezpoœrednio na modyfikacje posttranslacyjne p53, w tym fosforylacjê N-koñca i acetylacjê C-koñca [3]. Zaobserwowano ponadto, e infekcja EBV wi¹ e siê ze zwiêkszonym stê eniem MDM2 w komórce. Obecnoœci du ej iloœci MDM2 towarzyszy równie podwy szona iloœæ p53 nie ulegaj¹cego zwi¹zaniu i degradacji, co sugeruje, e w tym szczególnym przypadku MDM2 wywiera na nie inny wp³yw. Prawdopodobnym wyt³umaczeniem tego nietypowego zachowania jest zaobserwowana niezdolnoœæ p53 do

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 579 transaktywacji p21 w komórkach zaka onych, a co za tym idzie do indukcji apoptozy w ten sposób zwiêkszona obecnoœæ tego niebezpiecznego dla wirusa bia³ka jest tolerowana, zarazem jednak pozbawione jest ono czêœci swoich kompetencji. Wspomniane ju adenowirusy koduj¹ wiele bia³ek wp³ywaj¹cych na komórkowe p53 w ró ny sposób. E1B-156R, bia³ko podlegaj¹ce ekspresji nieco póÿniej ni E1B- 55K, wykazuje zdolnoœæ wi¹zania bia³ka Daxx, wykazuj¹cego m.in. aktywnoœæ czynnika transkrypcyjnego reguluj¹cego ekspresjê innych czynników transkrypcyjnych oddzia³uj¹cych bezpoœrednio z DNA, w tym p53. Dziêki temu mechanizmowi E1B- 156R potrafi transformowaæ komórkê [51]. Niebezpieczne dla p53 s¹ ponadto bia³ka E1B-55K oraz E4orf6, maj¹ce zdolnoœæ wi¹zania siê kolejno do jego domeny N- i C-koñcowej, co wp³ywa na procesy jego regulacji [1,39,47]. Zaka enie niektórymi RNA wirusami, np. wirusem zapalenia mózgu i miêœnia sercowego (EMCV) i ludzkim wirusem parainfluency 3 (HPIV3), prowadzi do obni enia poziomu p53 w komórce przez zahamowanie jego translacji. Dochodzi do niego za spraw¹ poœredniej formy replikacyjnej dsrna pojawiaj¹cego siê podczas zaka enia. Jego obecnoœæ aktywuje kinazê bia³kow¹ PKR o dzia³aniu przeciwwirusowym, prowadz¹c na dalszych etapach szlaków sygnalizacyjnych do apoptozy. Mechanizm, w którym obni enie poziomu p53 zamiast umo liwienia replikacji genomu wirusa prowadzi do œmierci komórki, jest rezultatem dzia³ania PKR indukowanego pojawieniem siê wirusowego RNA w komórce. Eksperymentalne zablokowanie aktywnoœci kinazy prowadzi do przewlek³ej infekcji wirusowej przy ci¹g³ej ekspresji p53 [27]. PODSUMOWANIE Jako stra nik genomu p53 chroni komórkê przed ró nego typu stresorami komórkowymi, m.in. promieniowaniem gamma, UV, hipoksj¹, niedoborem czynników troficznych, zmianami temperatury i potencja³u oksydoredukcyjnego, delecjami nukleotydów oraz zmianami w budowie mikrotubul. Przyczynia siê do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G 1 oraz do indukcji apoptozy, jako czynnik transkrypcyjny bierze udzia³ w regulacji transkrypcji genów, w procesie ró nicowania siê komórek, jest inhibitorem angiogenezy, uczestniczy w naprawie uszkodzeñ DNA. Niezbêdne w sytuacjach stresu komórkowego p53 ma równie w³aœciwoœci przeciwnowotworowe. W ponad po³owie wszystkich ludzkich chorób nowotworowych wystêpuj¹ mutacje punktowe jego genu prowadz¹ce do utraty funkcji przez to bia³ko. Bior¹c pod uwagê wielofunkcyjnoœæ p53 oraz ogromn¹ rolê, jak¹ pe³ni w zapewnieniu komórce stabilnoœci genetycznej oraz prawid³owego funkcjonowania, nie dziwi fakt, i jest ono jednym z g³ównych celów dzia³añ zaka aj¹cych j¹ wirusów zwierzêcych. Patogeny te, po wnikniêciu do komórki, d¹ ¹ do jak najszybszego powielenia swojego genomu. W przeciwnym wypadku z komórkowego agresora mog¹ staæ siê ofiar¹, g³ównie za spraw¹ p53. Wiêkszoœæ wirusów aktywuje bia³ko p53 w dwojaki sposób: indukuj¹c jego odpowiedÿ na uszkodzenie DNA spowodowane replikacj¹ wirusa oraz za poœrednictwem kodowanych przez siebie bia³ek, mody-

580 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS fikuj¹cych wewn¹trzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne. Zatrzymanie cyklu komórkowego b¹dÿ indukcja apoptozy przez aktywowane p53 mog¹ uniemo liwiæ replikacjê wirusa. Wirusy ewoluowa³y równolegle z zaka anymi przez siebie organizmami, jako paso yty wewn¹trzkomórkowe pozna³y mechanizmy funkcjonowania i obrony komórki oraz wykszta³ci³y w³asne, dostosowane do gospodarza sposoby przetrwania. PIŒMIENNICTWO [1] BERK AJ. Recent lessons in gene expression, cell cycle control, and cell biology from adenovirus. Oncogene 2005; 24(52): 7673 7685. [2] BEST SM. Viral subversion of apoptotic enzymes: escape from death row. Annu Rev Microbiol 2008; 62: 171 192. [3] BOUTELL CI, EVERETT RD. Herpes Simplex Virus Type 1 Infection Induces the Stabilization of p53 in a USP7- and ATM-Independent Manner. J Virol 2004; 78(15): 8068 8077. [4] BROOKS CL, GU W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Mol Cell 2006; 21(3): 307 315. [5] BROWN C, KOWALCZYK AM, TAYLOR ER, MORGAN IM, GASTON K. P53 represses human papillomavirus type 16 DNA replication via the viral E2 protein. Virol J 2008; 5: 5. [6] CAO F, ZHOU T, SIMPSON D, ZHOU Y, BOYER J, CHEN B, JIN T, CORDEIRO-STONE MI KAUF- MANN W. p53-dependent but ATM-independent inhibition of DNA synthesis and G 2 arrest in cadmiumtreated fibroblasts. Toxicol Appl Pharmacol 2007; 218: 174 185. [7] CARTER S, BISCHOF O, DEJEAN AI, VOUSDEN KH. C-terminal modifications regulate MDM2 dissociation and nuclear export of p53. Nat Cell Biol 2007; 9(4): 428 435. [8] CASAVANT NC, LUO MH, ROSENKE K, WINEGARDNER T, ZURAWSKA AI, FORTUNADO EA. Potential Role for p53 in the Permissive Life Cycle of Human Cytomegalovirus. J Virol 2006; 80(17): 8390 8401. [9] CLEGG HV, ITAHANA K, ZHANG Y. Unlocking the Mdm2-p53 loop: ubiquitin is the key. Cell Cycle 2008; 7(3): 287 292. [10] CYMERYS J, NIEMIA TOWSKI M. Bia³ka szoku cieplnego molekularne perpetuum mobile. Post Biol Kom 2004; 31(2): 331 352. [11] DHAREL N, KATO N, MUROYAMA R, TANIGUCHI H, OTSUKA M, WANG Y, JAZAG A, SHAO RX, CHANG JH, ADLER MK, KAWABE T, OMATA M. Potential Contribution of Tumor Suppressor p53 in the Host Defense Against Hepatitis C Virus. Hepatol 2008; 47: 1136 1149. [12] DWORAKOWSKA D. Rola bia³ka p53, prb, p21, PCNA, mdm2 oraz cykliny D1 w regulacji cyklu komórkowego oraz apoptozy. Onkologia Polska 2005; 8(4): 223 228. [13] ELIASZ S, CARBONE M, BOCCHETTA M. Simian virus 40 and cancer. Oncol Rev 2007; 1: 131 140. [14] HERSHKO T, CHAUSSEPIED M, OREN M, GINSBERG D. Novel link between E2F and p53: proapoptotic cofactors of p53 are transcriptionally upregulated by E2F. Cell Death Differ 2005; 12(4): 377 383. [15] HILL R, BODZAK E, BLOUDH MD, LEE PW. p53 Binding to the p21 promoter is dependent on the nature of DNA damage. Cell Cycle 2008; 7(16): 2535 2543. [16] HOBOM U, DOBBELSTEIN M. E1B-55-kilodalton protein is not required to block p53-induced transcription during adenovirus infection. J Virol 2004; 78(14): 7685 7697. [17] HSU HL, CHOY CO, KASIAPPAN R, SHIH HJ, SAWYER JR, SHU CL, CHU KL, CHEN YR, HSU HF, GARTENHAUS RB. MGT-1 oncogene downregulates p53 and destabilizes genome structure in the response to DNA double-strand damage. DNA Repair 2007; 6: 1319 1332. [18] IAQUINTA PJ, LEES JA. Life and death decisions by the E2F transcription factors. Curr Opinion Cell Biol 2007; 19: 649 657. [19] KOYAMA AH, FUKUMORI T, FUJITA M, IRIE H, ADACHI A. Physiological significance of apoptosis in animal virus infection. Microbes Infect 2000; 2: 1111 1117. [20] KRUSE JP, GU W. Modes of p53 regulation. Cell 2009; 137(4): 609 622. [21] KRZY OWSKA M, NIEMIA TOWSKI M. Supresja apoptozy w zaka eniach chordopokswirusami. Post Biol Kom 2003; 30(2): 273 291. [22] KURIBAYASHI K, EL-DEIRY WS. Regulation of programmed cell death by the p53 pathway. Adv Exp Med Biol 2008; 615: 201 221.

BIA KO P53 STRA NIK GENOMU W ZAKA ENIU WIRUSOWYM 581 [23] LEVINE AJ, HU WF. The p53 pathway: what questions remain to be explored? Cell Death Differ 2006; 13: 1027 1036. [24] LEVINE AJ. The common mechanisms of transformation by the small DNA tumor viruses: The inactivation of tumor suppressor gene products: p53. Virology 2009; 384(2): 285 293. [25] LIEBERMANN DA, HOFFMAN B, VESELY D. p53 Induced Growth Arrest versus Apoptosis and its Modulation by Survival Cytokines. Cell Cycle 2007; 6(2): 166 170. [26] LOHRUM MAE, LUDWIG RL, KUBBUTAT MHG, HANTON M, VOUSDEN KH. Regulation of HDM2 activity by the ribosomal protein L11. Cancer Cell 2003; 3: 577 587. [27] MARQUES JT, REBOUILLAT D, RAMANA CV, MURAKAMI J, HILL JE, GUDKOV A, SILVERMAN RH, STARK GR, WILLIAMS BR. Down-Regulation of p53 by Double-Stranded RNA Modulates the Antiviral Response. J Virol 2005; 79(17): 11105 11114. [28] MARTIN AG. Molecular biology of cervical cancer. Clinical & Translational Oncol 2007; 9: 347 354. [29] McLEAN JE, RUCK A, SHIRAZIAN A, POOYAEI-MEHR F, ZAKERI ZF. Viral manipulation of cell death. Curr Pharm Des 2008; 14(3): 198 220. [30] MEULMEESTER E, FRENK R, STAD R, de GRAAF P, MARINE JC, VOUSDEN KH, JOCHEMSEN AG. Critical role for a central part of Mdm2 in the ubiquitylation of p53. Mol Cell Biol 2003; 23(14): 4929 4938. [31] MIYATA Y, YAHARA I. p53-independent association between SV40 large T antigen and the major cytosolic heat shock protein, HSP90. Oncogene 2000; 19 (11): 1477 1484. [32] MOLL UM, PETRENKO O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res 2003; 1(14): 1001 1008. [33] MURAKAMI S. Hepatitis B virus X protein: a multifunctional viral regulator. J Gastroenterol 2001; 36: 651 660. [34] NARISAWA-SAITO M, KIYONO T. Basic mechanisms of high-risk human papillomavirus-induced carcinogenesis: roles of E6 and E7 proteins. Cancer Sci 2007; 98: 1505 1511. [35] NAYAK SK, PANESAR PS, KUMAR H. p53-induced Apoptosis and Inhibitors of p53. Curr Med Chem 2009; 16(21): 2627 2640. [36] NGUYEN ML, BLAHO JA. Apoptosis during herpes simplex virus infection. Adv Virus Res 2007; 69: 67 97. [37] O'NIONS J, ALLDAY MJ. Epstein-Barr virus can inhibit genotoxin-induced G1 arrest downstream of p53 by preventing the inactivation of CDK2. Oncogene 2003; 22: 7181 7191. [38] O'NIONS J, TURNER A, CRAIG R, ALLDAY M.J. Epsterin-Barr Virus Selectively Deregulates DNA Damage Responses in Normal B Cells but Has No Detectable Effect on Regulation of the Tumor Suppressor p53. J Virol 2006; 80 (24): 12408 12413. [39] O'SHEA CC, FRIED M. Modulation of ARF-p53 Pathway by the Small DNA Tumor Viruses. Cell Cycle 2005; 4(3): 449 452. [40] OSTER B, KASPERSEN MD, KOFOD-OLSEN E, BUNDGAARD, HOLLSBERG P. Human herpesvirus 6B inhibits cell proliferation by a p53-independent pathway. J Clinical Virol 2006; 37(1): 63 68. [41] PHILLIPS AC, VOUSDEN KH. E2F-1 induced apoptosis. Apoptosis 2001; 7(3): 173 182. [42] PIEKAROWICZ A. Podstawy wirusologii molekularnej. PWN, Warszawa 2004. [43] PIETSCH EC, MURPHY ME. Low risk HPV-E6 traps p53 in the cytoplasm and induced p53-dependent apoptosis. Cancer Biol Ther 2008; 7(12): 1916 1918. [44] PIETSCH EC, SYKES SM, McMAHON SB, MURPHY ME. The p53 family and programmed cell death. Oncogene 2008; 27(50): 6507 6521. [45] QIAN W, WITMAN KG. Polyoma Virus Middle T and Small t Antigens Cooperate to Antagonize p53- induced Cell Cycle Arrest and Apoptosis. Cell Growth Differ 2000; 11: 31 39. [46] ROOS WP, KAINA B. DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends Mol Med 2006; 12(9): 440 450. [47] ROYDS JA, HIBMA M, DIX BR, HANANEIA L, RUSSELL IA, WILES A, WYNFORD-THOMAS D, BRAIHTWAITE AW. p53 promotes adenoviral replication and increases late viral gene expression. Oncogene 2006; 25(10): 1509 1520. [48] SAMUELSON AV, NARITA M, CHAN HM, JIN J, de STANCHINA E, McCURRACH ME, NARITA M, FUCHS M, LIVINGSTON DM, LOWE SW. p400 is required for E1A to promote apoptosis. J Biol Chem 2005; 280(23): 21915 21923. [49] SATO Y, SHIRATA N, KUDOH A, IWAHORI S, NAKAYAMA S, MURATA T, ISOMURA H, NISHIY- AMA Y, TSURUMI T. Exspression of Epstein-Barr virus BZLF1 immediate-early protein induced p53 degradation independent of MDM2, leading to repression of p53-mediated transcription. Virology 2009; 388: 204 211.

582 M. ZAPAŒNIK, J. M. CYMERYS [50] SHADAN FF. Circadian model of viral persistence. Medical Hypotheses 2007; 68: 546 553. [51] SIEBER T, DOBNER T. Adenovirus Type 5 Early Region 1B 156R Protein Promotes Cell Transformation Independently of Repression of p53-stimulated Transcription. J Virol 2007; 81(1): 95 105. [52] STANELLE J, PUTZER BM. E2F1-induced apoptosis: turning killers into therapeutics. Trends Mol Med 2006; 12(4): 177 185. [53] TAKEMOTO M, KOIKE M, MORI Y, YONEMOTO S, SASAMOTO Y, KONDO K, UCHIYAMA Y, YAMANISHI K. Human Herpesvirus 6 Open Reading Frame U14 Protein and Cellular p53 Interact with Each Other and Are Contained in the Virion. J Virol 2005; 79 (20): 13037 13046. [54] TOLEDO F, WAHL GM. MDM2 and MDM4: p53 regulators as targets in anticancer therapy. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39(7-8): 1476 1482. [55] TOLEDO F, WAHL GM. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas. Nat Rev Cancer 2006; 6(12): 909 923. [56] TOMITA Y, MARCHENKO N, ERSTER S, NEMAJEROWA A, DEHNER A, KLEIN C. WT p53, but not tumor-derived mutants, bind to Bcl-2 via the DNA binding domain and induce mitochondrial permeabilization. J Biol Chem 2006; 281: 8600 8606. [57] UTAMA B, SHEN YH, MITCHELL BM, MAKAGIANSAR IT, GAN Y, MUTHUSWAMY R, DURAISA- MY S, MARTIN D, WANG X, ZHANG MX, WANG J, VERCELLOTTI GM, GU W, WANG XL. Mechanisms for human cytomegalovirus-induced cytoplasmic p53 sequestration in endothelial cells. J Cell Sci 2006; 119(Pt 12): 2457 2467. [58] VOUSDEN KH, LU X. Live or let die: the cell's response to p53. Nature Rev: Cancer 2002; 2: 594 604. [59] VOUSDEN KH, LANE DP. p53 in health and disease. Nature Rev: Mol Cell Biol 2007; 8: 275 283. [60] VOUSDEN KH, PRIVES C. P53 and Prognosis: New Insights and Further Complexity. Cell 2005; 120: 7 10. [61] VOUSDEN KH. Outcomes of p53 activation spoilt for choice. J Cell Sci 2006; 119: 5015 5020. [62] VOUSDEN KH. P53 and PUMA: A Deadly Duo. Science 2005; 309: 1685 1686. [63] VOUSDEN KH. Switching from life to death: The Miz-ing link between Myc and p53. Cancer Cell 2002: 351 352. [64] WADE M, ALLDAY MJ. Epstein-Barr Virus Suppresses a G 2 /M Checkpoint Activated by Genotoxins. Mol Cell Biol 2000; 20(4): 1344 1360. [65] WATSON IR, IRWIN MS. Ubiquitin and ubiquitin-like modifications of the p53 family. Neoplasia 2006; 8(8): 655 666. [66] WOODS DB, VOUSDEN KH. Regulation of p53 Function. Exp Cell Res 2001; 264: 56 66. [67] YANG Y, LUDWIG RL, JENSEN JP, PIERRE SA, MEDAGLIA MV, DAVYDOV IV, SAFIRAN YJ, OBERAJ P, KENTEN JH, PHILLIPS AC, WEISSMAN AM, VOUSDEN KH. Small molecule inhibitors of HDM2 ubiquitin ligase activity stabilize and activate p53 in cells. Cancer Cell 2005; 7: 547 559. [68] YU J, ZHANG L. The transcriptional targets of p53 in apoptosis control. Biochem Biophys Res Commun 2005; 331(3): 851 858. [69] YU X, HARRISS L, LEVINE AJ. The regulation of exosome secretion: a novel function of the p53 protein. Cancer Res 2006; 66(9): 4795 4801. Redaktor prowadz¹cy Bo ena Kamiñska Kaczmarek Otrzymano: 06.05. 2009 r. Przyjêto: 30.07. 2009 r. Dr Joanna Cymerys Zak³ad Wirusologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej, SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa, E-mail: jcymerys@op.pl