Nowe oblicze RNA Józef Dulak DMB Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński biotka.mol.uj.edu.pl/~hemeoxygenase 9 grudnia 2006
Regulacja ekspresji genów
RNA komórek eukariotycznych
Indukcja ekspresji genów w eukariotycznych
Wiele poziomów regulacji ekspresji
Regulacja ekspresji genów w związanych zanych z pobieraniem i magazynowaniem żelaza
Sposoby hamowania ekspresji genów - Pułapki oligonukleotydowe - Nukleotydy antysensowe - Rybozymy
Pułapki oligonukleotydowe (decoys)
Hybrydyzacja kwasów naukleinowych jako sposób hamowania ekspresji genów DNA hybrydyzuje z DNA DNA hybrydyzuje z RNA RNA hybrydyzuje z RNA U U U U U U U U
Rybozymy katalityczne cząsteczki RNA H- A, C lub U
Oligonukleotydy antysensowe
Wszystkie wyżej wymienione sposoby sąs jednak mało o wydajne i w znacznym stopniu sztuczne, czyli wymyślone przez człowieka
Zastosowanie jednoniciowego, antysensowego RNA do hamowania ekspresji genów 1991 Fire et al. C. elegans
Dwuniciowe RNA bardziej efektywne aniżeli jednoniciowe... - Interferencja RNA była a przekazywana potomstwu -Do hamowania ekspresji genów w potrzebne było o niewiele cząsteczek RNA, co sugerowało o mechanizm katalityczny (amplifikację)
Fire at al., 1998 Dwuniciowe RNA hamuje ekspresję genów w bardziej efektywnie niż jednoniciowe Zarodek kontrolny Zarodek z uwidocznionym mrna genu mex-3 Zarodek nastrzyknięty ty jednoniciowym antysensowym RNA Zarodek nastrzyknięty ty dwuniciowym RNA Nicień po podaniu niespecyficznego dsrna Nicień po podaniu specyficznego dsrna Dwuniciowe RNA o długod ugości kilkuset nukleotydów
Nobel 2007 w dziedzinie fizjologii lub medycyny Andrew Fire Craig Mello
Patent na interferencję RNA Genetic inhibition by double-stranded RNA Abstract A process is provided of introducing an RNA into a living cell to inhibit gene expression of a target gene in that cell. The process may be practiced ex vivo or in vivo. The RNA has a region with doublestranded structure. Inhibition is sequence-specific in that the nucleotide sequences of the duplex region of the RNA and of a portion of the target gene are identical. The present invention is distinguished from prior art interference in gene expression by antisense or triple-strand methods Inventors: Fire; Andrew (Baltimore, MD), Kostas; Stephen (Chicago, IL), Montgomery; Mary (St. Paul, MN), Timmons; Lisa (Lawrence, KS), Xu; SiQun (Ballwin, MO), Tabara; Hiroaki (Shizuoka, JP), Driver; Samuel E. (Providence, RI), Mello; Craig C. (Shrewsbury, MA) Assignee: Carnegie Institute of Washington (Washington, DC) Appl. No. 09/215,257 Filed: December 18, 1998 This application claims the benefit of U.S. Provisional Appln. No. 60/068,562, filed Dec. 23, 1997.
Interferencja RNA Specyficzne hamowanie ekspresji genów w przez dwuniciowe RNA na drodze: 1. indukcji specyficznej degradacji komplementarnego mrna 2. hamowania translacji 3. modyfikacji chromatyny
Wyjaśnienie mechanizmu działania ania interferencyjnego RNA Enzym Dicer tnie dsrna na krótkie, 21-23 23 nukleotydowe fragmenty
Mechanizm działania ania sirna
Zastosowanie sirna u ssaków
Zastosowanie sirna u ssaków
Wprowadzenie sirna kodowanego w wektorze
Sposoby dostarczania sirna do komórek Chemicznie syntetyzowane sirna krótkotrwałe wyłączenie sirna kodowane w wektorze długotrwałe wyłączenie
Ekspresja sirna wprowadzonego w wektorze
Rózne rodzaje regulatorowych cząsteczek RNA Figure 12.48 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Celem mirna jest często niekodujący fragment 3 3 mrna Figure 12.49 Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Biogeneza i mechanizm działania ania mirna Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006
Interferencja RNA u różnych r organizmów drożdże rzodkiewnik muszka owocowa C. elegans/ssaki Meister & Tuschl, Nature 2004
Mechanizm działania ania różnych r cząsteczek interferującego RNA jest podobny
Fizjologiczne znaczenie mirna C. elegans geny lin-4 4 & let-7 kodują mirna Mutacja w tych genach zaburzenia w rozwoju C. elegans Udział w: programowanej śmierci komórki (apoptoza( apoptoza) specyfikacji charakteru neuronów kontroli gromadzenia tłuszczu t zapobieganiu proliferacji genetycznych pasożyt ytów
Transpozony (skaczące ce geny) Fragmenty DNA kodujące enzymy umożliwiaj liwiające transpozycję (przeniesienie z jednego miejsca genomu do innego miejsca skaczące ce geny ). Mogą prowadzić do poziomego przekazywania genów, czyli przenoszenia się genu z genomu jednego gatunku na inny. Czerwony kolor nasion spowodowany jest transpozonami
Funkcje mirna Większo kszość zwierząt t ma od 100-200 różnych r mirna (ocenia się, że e u ludzi ok.1000 i mogą stanowić 1-4% wszystkich genów w ulegających ekspresji) Lokalizacja w genomie: większo kszość w obrębie bie intronów w genów w kodujących białka Ocenia się, że mirna kontrolują około o 30% ludzkich genów! Ok. 30% genów mirna wykazuje homologię między C. elegans, Drosophila i człowiekiem
mirna a choroby człowieka owieka -Zaburzenia w ekspresji mirna w nowotworach (rak nerki, piersi, chłoniaki oniaki,, inne) -mirna mogą zarówno odgrywać rolę hamująca jak i stymulująca powstawnie nowotworów w (czyli mogą być supresorami jak i onkogenami) oncomirs
Rola mirna w rozwoju nowotworów Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006
Zastosowanie interferencji RNA - odwrotna genetyka ( (reverse genetics) Praktycznie wszystkie 19 000 genów C. elegans zostało wyłą łączonych za pomoca sirna!
Terapia genowa wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków Gen terapeutyczny Wektor Pacjent Ekspresja genu terapeutycznego Efekt leczniczy Białko lecznicze
Terapia genowa Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów Nowotwory Choroby układu krążenia np. Nowotwory choroby układu krążenia Choroby dziedziczne (wrodzone błędy metaboliczne, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa )
Terapeutyczne kwasy nukleinowe DNA RNA Geny Wektory DNA) Sekwencje niekodujące Geny (wektory RNA) Sekwencje niekodujące Oligonukleotydy Antysensowe Pułapki oligonukleotydwe rybozymy sirna
Rózne sposoby hamowania ekspresji genów
Próby kliniczne terapii z zastosowaniem sirna w zapobieganiu degeneracji plamki żółtej
DMB Degeneracja plamki
sirna przeciw mrna VEGF Acuity Pharmaceuticals Normal Macula Dry AMD:Drusen formation under the Macula Wet AMD:Macula with abnormal blood vessels + sirna
sirna-027 hamuje patologiczną angiogenezę Kontrola sirna-027
Możliwe zastosowania sirna - leczenie zakażeń wirusowych (HCV, HIV) - hamowanie angiogenezy AMD, łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory - choroby neurodegeneracyjne pląsawica Huntingtona - Astma hamowanie produkcji cytokin prozapalnych
sirna w terapii
Różnorodny świat RNA
Wnioski -Zrozumienie mechanizmów w ekspresji genów w jest równie ważne jak próby wykorzystania tych zjawisk -Skuteczne zastosowanie biotechnologii wymaga dogłę łębnej wiedzy nt.. mechanizmów w regulacji ekspresji genów -Badania o charakterze bardzo podstawowym stworzyły mozliwości pracy dla wielu osób
Nobel Prize Award Ceremony The Nobel Prize Award Ceremony at the Stockholm Concert Hall, Sweden. December 10, 4:30 p.m. - 6:00 p.m. (CET).