Rolnictwo molekularne Dr Anna Góra-Sochacka Patrycja Redkiewicz Prof. dr hab. Agnieszka Sirko
Tradycyjne Żywe zawierają żywe atenuowane (pozbawione zjadliwości) drobnoustroje Inaktywowane - zawierają zabite drobnoustroje (całe lub ich fragmenty) Nowej generacji Rekombinowane (żywy rekombinowany patogen) Rekombinowane podjednostkowe (białka, peptydy) DNA
Szczepienia są najbardziej korzystną z ekonomicznego punktu widzenia metodą ograniczenia zakażeń powodowanych przez choroby infekcyjne Bardzo duże zapotrzebowanie, ponad 30 mln dzieci nie jest szczepionych Tradycyjne szczepionki produkcja skomplikowana, kosztowna przechowywanie i transport w niskiej temperaturze
Idea wykorzystania roślin do produkcji antygenów szczepionkowych zrodziła się na początku lat dziewięćdziesiątych. Uzyskanie powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B w transgenicznym tytoniu pokazało, że organizmy roślinne są zdolne do produkcji antygenów. Pojawił się pomysł jadalnych szczepionek.
1997 rok (Goldstein) Getting vaccinated against diseases could soon be as easy as eating a banana Pierwotna koncepcja, ale brak kontroli dawki konieczność oddzielenia warzyw i owoców przeznaczonych do konsumpcji od tych dla celów terapeutycznych kontaminacje
Wybór antygenu, promotora, rośliny Łatwość transformacji Produkcja rekombinowanego białka w jadalnej (na surowo) części rośliny Wysoka zawartość białka w tkance, bo białko rekombinowane stanowi tylko mały procent Brak toksycznych produktów/metabolitów Zapewnienie odpowiedniej struktury antygenu i modyfikacji potranslacyjnych Rośliny: tytoń, jabłka, banany, pomidory, orzeszki, kukurydza, soja, sałata, kapusta, ziemniaki, szpinak
Wybór antgenu, promotora, rośliny 1. Transformacja roślin (stabilna lub przejściowa) 2. Wybór linii transgenicznej Namnożenie i uprawa w warunkach polowych lub przeskalowanie hodowli komórkowej Zebranie materiału, oczyszczenie rekombinowanego białka, standaryzacja dawki antygenu, forma podania i sposób (wstrzyknięcie lub doustnie). TESTY
Vibrio cholerae (bakteria Gram-ujemna) Antygen - podjednostka B toksyny (CTB) Tytoń chloroplasty 4,1% TSP Promotor CaMV35S, KDEL: 0,02%TSP Pomidor (Jiang et al., (2007) Transgenic res. 16: 169-75 promotor E8; 0,081%TSP, (uzyskano wysoki poziom IgG i IgA u karmionych myszy) Ryż (Nochi et al., (2007) Proc Natl Acad Sci 104:10986-91 Ziarna, promotor GluB-1: 30ug/ziarno (uzyskano przeciwciała po immunizacji doustnej myszy). CTB było stabilne w ziarnach przez 1,5 roku w temp. pokojowej
Antygen - podjednostka B termolabilnej enterotoksyny (LTB) Ziemniak, promotor 35S CaMV Karmione myszy LTB używany jako adiuwant LTB w fuzji z innymi antygenami Tytoń, ziemniak, kukurydza, pomidor, soja, marchewka, Arabidopsis thaliana
System ekspresji stałej
Dostępne szczepionki rekombinowane np. Engerix - rekombinowa szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w postaci zawiesiny do wstrzykiwań zawierająca: - 10µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 0,5ml (dawka dla dzieci) lub - 20µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 1ml (dawka dla dorosłych). Antygen powierzchniowy (HBsAg) wirusa zapalenia wątroby typu B Uzyskano w bardzo wielu roślinach: tytoń, ziemniaki, sałata i inne, zawiesinach komórkowych. Wykazano odp. Immunologiczna po podaniu doustnym u myszy i ludzi.
VLP virus-like particle
Fig. Anti-HBs secretory IgAs(S-IgAs) in feces extract (a) And total serum antibody response (b) to oral immunization with 100 ng/dose of VLP-assembled S-HBsAg. Mice were immunized with lyophilized plant tissue (ca. 9 mg dry weight/dose) or purified antigen,and delivered at 30- or 60-day timings. Non-transgenic lyophilized tissue or PBS were delivered to control mice at a 60-day timing. Anti-HBs antibody level (miu/ml) responses are expressed as arithmetic means with standard deviations (SD) from results for 10 BALB/c mice at pre-immune (5 days before prime) and 10 days after each immunization, determined twice by a Hepanostika kit (Organon Teknika, Boxtel). Statistically homogenous or significantly distinct responses for S-IgAs Or total serum antibodies aremarked by identical or different letter indexes, respectively (Tukey and Duncan tests, p<0.05, Statistica 6 )
Fig. a, b Plant-based prototype of anti-hbv vaccine specimens. a Preparation of plant-derived materials. Panels: left lettuce plants expressing 10 μg S-HBsAg/g FW; middle powdered lyophilized plant tissue as a semi-finished product for the preparation of various formulas of an oral vaccine; right tablets of 10 3 mm in size and 500 mg in weight, containing a specific dose of S-HBsAg. b The level of total and VLP-assembled S-HBsAg in powdered lyophilized tissue and 1 g and 1 unit of tablets, freshly prepared and stored for one year. S-HBsAg content was calculated in μg/g of dry weight (DW) as an arithmetic mean and standard deviation (SD) from ten polyclonal ELISA or monoclonal Auszyme assays
System ekspresji przejściowej
Są dwa rodzaje dopuszczonych szczepionek do stosowania u ludzi Inaktywowana składająca się z rozszczepionych wirionów grypy. Po namnożeniu odpowiedniego wirusa ulega on inaktywacji chemicznej lub fizycznej Żywa atenuowana, reasortanty wirusów szczepionkowych z wirusem o fenotypie cold adopted namnażające się wyłącznie w temp. do 33 o C, przy zablokowanej replikacji w 37 o C Są trójwalentne (H3N2, H1N1, wirus typu B) Są kosztowne i czasochłonne ( 6 miesięcy) Potrzebna jest szczepionka nowej generacji
NEURAMINIDAZA NA OTOCZKA LIPIDOWA BIAŁKO M 1 M 2 vrna HEMAGLUTYNINA HA NUKLEOKAPSYD
Antygen system wydajność immunizacja challange źródło HA 17-532, PS: PR- 1a tobacco, ER, His-tag H5N1 A/Barheaded Goose/Qinghai & A/Anhui/1/05 Transient; pgreen, N. benthamiana, Agroinfiltracja (vacuum), Cross-protection pomiędzy nimi, ale z 1 lub 2.1 brak Myszy Balb/c (dzień 0, 14, 28, Quil A, SC), dawki: 1-30µg; 2,5-5µg i 1 booster OK), HI +, VN + - Shoji Y, (grupa V. Yusibov z Fraunnhofer USA Center for Molecular BiotechnologyVaccin e 27 (2009) Jw., ale H5N1 A/Indonesia/05/05 HA0 H5N1 NIBRG-14 HA H5N1 A/Indonesia/05/05 HA H1N1 A/New Calzedonia/20/99 H1+M1 A/Puerto Rico/8/34 jw 60mg/kg FW Jw., dawka 90 lub 45µg 10 dni po ostatniej immunizacji, + MagnIcon provector system N. benthamiana, transient, vacuum Plasto promoter VLP Kierowanie do cyt., chloroplasty, apo. Oczyszczone 20-30mg/kg FW 50mg/kg Tabela 1 IM Myszy, IM, 0 i 21 dzien, H5VLP: 0,1, 1, 5 i 12µg zw 2%Alhydrogel K+ rekombinowana HA 5µg (oczyszczone z linii 293) HI +, wyższe niż K+ Kurczaki, Szczepienie, wirusem 96% podobieństwa, 3 tyg. Booster, 3 tyg. Challange + 0,5, 2,5, 7,5µg HA; Dzień 0 i 14, challange (A/Vietnam/1194/04, 75 dni po bosterze, 100% przeżywalności Jw. Kalthoff (ICON Genetics), J. of Vir. 84 (2010) D Aoust (Medicago); PBJ6 (2008)