Część III: Poszukiwanie chemoterapeutyków

Transkrypt

1 5. MECHANIZM DZIAŁANIA LEKÓW NA POZIOMIE MOLEKULARNYM Chociaż każda grupa leków posiada swój indywidualny mechanizm działania, to jednak możliwe jest znalezienie elementów wspólnych występujących we wszystkich lub wielu grupach leków. Takim właśnie ogólnym prawidłowościom poświęcona będzie niniejsza Część Dotarcie do miejsca działania Problem dotarcia związku biologicznie czynnego do jego miejsca działania rozpatrywać można na kilku różnych poziomach. Jednym z nich jest p o z i o m fizjologiczny. Jedynie wyjątkowo, przy podaniu domiejscowym, np. na otwartą ranę lub oczyszczone chirurgicznie miejsce infekcji, chemoterapeutyk działa bezpośrednio w miejscu podania. W większości przypadków jest on podawany z dala od miejsca działania, np. w formie: zastrzyku domięśniowego drogą pokarmową zastrzyku lub wlewu dożylnego. Związek biologicznie czynny musi być resorbowany z miejsca podania (w przypadku drogi pokarmowej lub domięśniowej), a następnie rozprowadzony wraz z prądem krwi lub innych płynów ustrojowych. Nawet po dotarciu do zainfekowanego narządu musi on jeszcze dotrzeć w pobliże komórki patogena. Po drodze musi chociaż raz (przy podaniu dożylnym) lub wielokrotnie przeniknąć przez ściany naczyń krwionośnych. Odbywa się to najczęściej dzięki wniknięciu ze światła naczynia do komórek ściany, a następnie z wnętrza komórki do płynów lub komórek po drugiej stronie ściany naczynia. Kolejnym poziomem jest p o z i o m komórkowy. Nawet jeśli analizujemy sytuację występującą w teście in vitro to i tak cel molekularny z którym związek biologicznie czynny ma oddziaływać znajduje się zwykle wewnątrz komórki 1 Tak więc czy to na poziomie fizjologicznym czy to komórkowym problem sprowadza się do przejścia związku przez lipidową, hydrofobową ze swej natury, błonę komórkową, Rys.5.1. Zdecydowana większość leków, w tym również większość chemoterapeutyków, przenika przez błony komórkowe na drodze b i e r n e j d y f u z j i. Do wyjątków należą związki transportowane poprzez mechanizmy d y f u z j i u ł a t w i o n e j. Chemoterapeutyki transportowane mechanizmem dyfuzji ułatwionej narażone są na łatwe pojawienie się szczepów opornych w stosunku do nich poprzez zanik odpowiedniej permeazy. Dotychczas nie stwierdzono ani jednego przypadku by chemoterapeutyk transportowany był do komórki mechanizmem t r a n s p o r t u a k t y w n e g o, czyli z jednoczesnym wydatkiem energetycznym. Zrąb błony komórkowej stanowi biwarstwa lipidowa zbudowana z fosfolipidów, a w przypadku komórek eukaryotycznych również steroli. Bierna dyfuzja przez błonę odbywa się właśnie poprzez biwarstwę lipidową. W strukturze tej zakotwiczone są różnorodne białka błonowe. Niektóre z nich przebijają biwarstwę i mogą odgrywać rolę przenośników białkowych lub tworzyć selektywne struktury kanałowe. Przenośniki białkowe i pory (kanały) odpowiedzialne są za dyfuzję ułatwioną. Dyfuzja bierna przez błonę komórkową stawia transportowanemu związkowi pewne specyficzne wymagania. Powinien to być związek małocząsteczkowy. W przypadku chemoterapeutyków ograniczenie to sprowadza się do wymogu, aby związek tworzył roztwory rzeczywiste (monomolekularne) lub, co najwyżej kilkucząsteczkowe asocjaty. Związki wielkocząsteczkowe lub związki tworzące wielocząsteczkowe micelle wykazują bardzo słabe zdolności do dyfuzji biernej poprzez błonę lipidową. Większość rozpuszczalnych w wodzie chemoterapeutyków spełnia ten wymóg, nie jest to więc istotne ograniczenie. błona komórkowa białko transbłonowe biwarstwa lipidowa ściana naczynia Rys.5.1: Schemat budowy ściany naczynia krwionośnego i błony komórkowej. Związek powinien charakteryzować się odpowiednim współczynnikiem podziału pomiędzy fazę wodną i lipidową. Dla związków polarnych, a szczególnie niosących wypadkowy ładunek elektryczny nie zawierająca białek transbłonowych biwarstwa fosfolipidowa jest praktycznie nieprzepuszczalna (dotyczy to również wody). Z drugiej strony związki lipofilowe będą bardzo łatwo wnikać do błony, ale będą się w niej kumulowały. Jest to korzystne tylko dla związków, których miejscem działania jest błona komórkowa lub zlokalizowane w niej enzymy. Kumulacja związków niepolarnych w biwarstwie może być tak znaczna, że zmianie ulega struktura lub właściwości błony 2. Dla związków, których cel molekularny znajduje się w cytoplazmie lub organellach komórkowych nadmierna lipofilowość zmniejsza szansę dotarcia do miejsca przeznaczenia Oddziaływanie związku biologicznie czynnego z celem molekularnym Jest to najistotniejszy etap działania leku. Wydaje się, że na tym etapie możliwy jest ciągle jeszcze duży postęp. Należy pamiętać, że celem molekularnym mogą być: makromolekuły (enzymy) struktury złożone z makromolekuł struktury złożonymi z cząsteczek średniej wielkości, ale wykazującymi organizację wyższego rzędu (błona biologiczna). 1 Wyjątek wśród chemoterapeutyków stanowią antybiotyki z grupy penicylin i cefalosporyn dla których cel molekularny znajduje się w ścianie komórkowej. Celem tym jest enzym hydrolizujący wiązanie peptydowe D-Ala-D-Ala w peptydoglikanie. 2 Na tej zasadzie działają klasyczne anestetyki: chloroform, eter etylowy, alkohol: zmiana właściwości błony prowadzi do zaburzenia funkcji transportu jonów w komórkach kory mózgowej i zaniku świadomości. 1

2 Rola struktury trójwymiarowej związku biologicznie czynnego Cel molekularny charakteryzuje się pewną trójwymiarową strukturą, a w ramach tej struktury przestrzennym rozkładem miejsc aktywnych (miejsc wiązania, centrów reakcji enzymatycznych) oraz pól elektrycznych. Aby związek biologicznie czynny mógł oddziaływać z celem molekularnym musi posiadać odpowiednią trójwymiarową strukturę oraz odpowiedni rozkład własnego pola elektrycznego. Należy podkreślić, że pod pojęciem "struktura" czy to celu czy związku biologicznie czynnego powinno się w tym wypadku rozumieć nie tyle układ wiązań chemicznych, ile raczej kształt zewnętrzny cząsteczki. Takie traktowanie "struktury" związku biologicznie czynnego pozwala zrozumieć, dlaczego często związki o zdecydowanie różnej budowie chemicznej są traktowane przez cel komórkowy jako bardzo podobne 3,4. W wielu przypadkach struktura "naturalna" jest peptydem, a jej analogi znajdujące zastosowanie farmakologiczne należą do zupełnie innego typu związków chemicznych. Nieprzypadkowo są to często wielopierścieniowe związki heterocykliczne (niekoniecznie aromatyczne) o utrwalonej, sztywnej konformacji. Taka sztywna konformacja zapewnia dobre naśladowanie aktywnej konformacji peptydu. Oprócz struktury duże znaczenie ma rozkład pola elektrycznego wokół cząsteczki. Oddziaływanie pól elektrycznych związku małocząsteczkowego i biopolimeru zapewnia rozpoznanie się partnerów i prawidłowe ich wzajemne ustawienie w przestrzeni. Tak więc można z pewną, choć niezbyt wielką, przesadą powiedzieć, że budowa chemiczna (układ wiązań chemicznych) potrzebna jest tylko po to, aby zapewnić powstanie odpowiedniego pola elektrycznego w odpowiednich punktach przestrzeni. Budowa chemiczna jest czymś w rodzaju konstrukcji nośnej, na której dopiero rozpięta jest właściwa powłoka pól elektrycznych. I tak jak można zbudować różne konstrukcje nośne dla podtrzymywania takiej samej powłoki, tak samo różne układy wiązań chemicznych mogą tworzyć bardzo podobne rozkłady pól elektrycznych rodzaje oddziaływań z celem molekularnym Oddziaływanie związku biologicznie czynnego z jego celem polega bardzo często na utworzeniu z nim szeregu odpowiednich wiązań. Natura tych wiązań może być różnoraka. Poczynając od słabych oddziaływań Van der Waalsa, poprzez oddziaływania pól elektrycznych (wiązania dipol-dipol, dipol-jon, wiązania jonowe jon-jon) aż do silnych wiązań kowalencyjnych. Te ostatnie powstają najczęściej dopiero w drugim etapie po odpowiednim zorientowaniu cząsteczki przez utworzenie innych, słabszych wiązań. W zależności od konkretnego celu molekularnego i mechanizmu działania związku biologicznie czynnego, jego połączenie z biopolimerem (receptorem) może mieć różny charakter i powodować różne skutki: efekt allosteryczny: oddziaływanie opiera się na wielu stosunkowo słabych wiązaniach. Wymagana jest duża zgodność strukturalna. Efektem oddziaływania jest zmiana struktury biopolimeru prowadząca do zahamowania lub uruchomienia jego funkcji. 3 Klasyczny przykład takiej sytuacji, choć nie dotyczy on chemoterapii, mamy w przypadku alkaloidów opium i enkefalin. 4 Najbardziej znanym przykładem na polu chemoterapii jest analogia strukturalna układu β-laktamowego w penicylinach i cefalosporynach do fragmentu dipeptydowego D-Ala-D-Ala. inhibicja kompetytywna: wymagana tu jest większa moc połączeń, lecz zgodność strukturalna może być mniejsza. W efekcie dochodzi do mechanicznego zajęcia miejsca przeznaczonego na jeden z substratów i w ten sposób zahamowania funkcji enzymatycznej. inhibicja nieodwracalna (inaktywacja): proces przebiega zwykle w dwóch etapach: i) wymagane są słabe lub średnie połączenia przy lokalnie bardzo dużej zgodności strukturalnej; ii) utworzenie silnego, kowalencyjnego wiązania z enzymem. Efektem jest nieodwracalne unieczynnienie enzymu (inaktywacja) Farmakofor Przez analogię do znanego w chemii organicznej od ponad 100 lat pojęcia "chromofor" wprowadzono niedawno w farmakologii molekularnej pojęcie "farmakofor". W myśl akceptowanej przez większość zainteresowanych, nieścisłej jeszcze definicji, jest to minimalny fragment cząsteczki związku biologicznie czynnego odpowiedzialny za wystąpienie danego efektu biologicznego. Pomimo krótkiej historii tego pojęcia (ok. 40 lat) w chwili obecnej konkurują z sobą dwa podejścia (punkty widzenia) do pojęcia farmakoforu: podejście tradycyjne, chemiczne: farmakoforem jest układ atomów połączony konkretnymi wiązaniami chemicznymi podejście elektronowe (teoretyczne): farmakoforem jest odpowiedni rozkład pola elektrycznego niezależnie od wytwarzającego go układu atomów i ich wiązań. Wg wersji tradycyjnej może być wiele farmakoforów (czytaj struktur chemicznych) oddziałujących z tym samym biopolimerem docelowym. W wersji elektronowej dla danego celu molekularnego istnieje tylko jeden farmakofor (twór wyidealizowany - rozkład pola elektrycznego), ale może on być realizowany na wiele sposobów (struktury chemiczne). Z punktu widzenia poszukiwania i projektowania nowych leków dużo bardziej obiecujące wydaje się być podejście teoretyczne: poznanie struktury pola elektrycznego i wymogów strukturalnych farmakoforu stanowić może podstawę do poszukiwania (doświadczalnie lub na drodze obliczeń) nowych struktur chemicznych spełniających niezbędne wymogi. 6. Nowe chemoterapeutyki Chemoterapia jest swego rodzaju wojną pomiędzy walczącym o przeżycie patogenem, dla którego organizm chorego jest środowiskiem niezbędnym do życia lub rozmnażania, a wysiłkami lekarzy, farmakologów i chemików zmierzających do zlikwidowania patogenu w organizmie chorego. Podobnie jak w rzeczywistej wojnie obie strony stosują wszelkie możliwe sposoby, aby zapewnić sobie zwycięstwo. Obecny stan chemoterapii nie jest zadawalający. Główne problemy związane są z: brakiem skutecznych chemoterapeutyków w stosunku do niektórych patogenów (wirusy, nowotwory) w przypadku wielu chemoterapeutyków ze względu na ich niską selektywną toksyczność występują liczne niepożądane efekty uboczne rozwój szczepów opornych wymuszający np. w grupie chemoterapeutyków przeciwbakteryjnych wprowadzanie co 5 7 lat nowych leków o odmiennym mechanizmie działania. W tej sytuacji istnieje potrzeba ciągłego poszukiwania nowych, lepszych chemoterapeutyków Strategie poszukiwania chemoterapeutyków 2

3 Poszukiwanie nowych chemoterapeutyków prowadzić można wieloma różnorodnymi metodami. Praktycznie każdy zespół badawczy wypracowuje z czasem swoją własną strategię poszukiwań. Strategia taka jest zwykle stosowanym w określonym porządku zespołem kilku standardowych technik. Poszczególne strategie różnią się przede wszystkim naciskiem kładzionym na poszczególne techniki. Dlatego też poniżej omówimy najważniejsze techniki stanowiące składniki strategii poszukiwania nowych chemoterapeutyków metoda przesiewowa Najprostsza i najstarsza technika poszukiwania związków biologicznie czynnych, w tym również chemoterapeutyków, polega na badaniu możliwie szerokiego zestawu potencjalnie aktywnych substancji. Substancje te mogą być: preparatami (mieszaninami indywidualnych związków chemicznych) izolowanymi ze źródeł naturalnych: zwierząt, roślin, drobnoustrojów, kopalin itp. indywidualnymi związkami syntetyzowanymi w laboratoriach chemicznych. W historii poszukiwania nowych chemoterapeutyków wykorzystywano różnorodne źródła substancji potencjalnie aktywnych. Duże nadzieje wiązano swego czasu z preparatami medycyny ludowej w tym również medycyny ludów pierwotnych. Najłatwiejsze do wykorzystania źródła nowych chemoterapeutyków zostały już jednak praktycznie wyeksploatowane. Niezależnie od sposobu pozyskiwania potencjalnych chemoterapeutyków wszystkie one wymagają przetestowania aktywności. Testowanie to polega przede wszystkim na eliminacji substancji nieaktywnych. Stąd nazwa tej techniki: badania przesiewowe (ang. screening). Stosowanie badań przesiewowych jest stosunkowo mało wydajna. Zaledwie jedna substancja na kilka tysięcy przebadanych dociera do poziomu badań klinicznych i ma szansę zostać lekiem. Tak niska wydajność metody przesiewowej wymaga zorganizowania placówek badawczych zdolnych do testowania ogromnej liczby substancji. Najsłynniejsza placówka tego typu jest prowadzona przez Narodowy Instytut Rakowy USA (National Cancer Institute) w Bethesda w stanie Maryland. W ramach tych badań przesiewowych finansowanych przez rząd Stanów Zjednoczonych testuje się rocznie wiele tysięcy preparatów o potencjalnej aktywności przeciwnowotworowej i przeciwwirusowej zależności struktura - aktywność Aby zachować i być może nawet umocnić pozycję chemoterapii w "wojnie" z patogenami należy wdrożyć bardziej wydajne metody poszukiwania nowych chemoterapeutyków. Jedną z technik bardziej efektywnych niż metoda przesiewowa jest wykorzystanie zależ noś ci struktura - aktywność (SAR od ang. Structure - Activity Relationships) Zestaw zależności pomiędzy budową chemiczną pewnej grupy związków a ich aktywnością biologiczną stanowić może bardzo cenne źródło wiedzy przydatnej przy planowaniu syntez kolejnych związków z tej grupy.. Pierwsze tego typu obserwacje pochodzą z II połowy XIX w. i dotyczą zależności pomiędzy budową chemiczną a toksycznością niektórych grup związków chemicznych (głównie alkaloidów). Do połowy lat '60 XX w. były to prawidłowości opisywane jakościowo: stwierdzano, że dla danego typu aktywności konieczna jest struktura danego typu z takimi to a nie innymi podstawnikami w takich to a takich pozycjach. Np. w Katedrze Technologii Leków i Biochemii PG rozpoczęto w latach '50 pod kierunkiem Prof. Zygmunta Ledóchowskiego poszukiwania pochodnych akrydyny o właściwościach przeciwnowotworowych. Badania te kontynuowane następnie przez Prof. Andrzeja Ledóchowskiego doprowadziły, po zsyntetyzowaniu i przebadaniu kilkuset związków, do konkluzji, że dla wysokiej aktywności cytotoksycznej potrzebne są: grupa nitrowa w pozycji 1 podstawnik aminoalkiloaminowy w pozycji 9. NO CH 3 (CH ) N 2 3 N CH 3 N H Rys.6.1: Struktura chemiczna pierwszego polskiego związku przeciwnowotworowego Ledakrinu otrzymanego w zespole prof. Andrzeja Ledóchowskiego. W tej sytuacji dalsze syntezy ograniczono do pochodnych 1-nitroakrydyny poszukując reguł rządzących łańcuchem bocznym. Po zsyntetyzowaniu dalszych kilkuset związków stwierdzono, że optymalny jest łańcuch n-propylowy i przystąpiono do optymalizacji zestawu podstawników na azocie terminalnym. Metoda taka, choć bardzo pracochłonna, prowadzi jednak do otrzymywania związków średnio coraz aktywniejszych. Wykorzystanie wiedzy o mechanizmie działania związków biologicznie czynnych z danej grupy może również przyczynić się do szybszego projektowania potencjalnych chemoterapeutyków. Np. w zespole kierowanym przez Prof. Edwarda Borowskiego w Katedrze Technologii Leków i Biochemii PG stwierdzono pod koniec lat '70, że pochodne kwasu 3-N-(fumaroilo)diaminopropanowego silnie hamują enzymatyczną syntezę glutaminy - podstawowego składnika ściany komórkowej bakterii i grzybów. Problemem było wprowadzenie tego związku do wnętrza komórki: silnie polarny, zwitter-jonowy charakter cząsteczki wykluczał jej wnikanie poprzez dyfuzję bierną. Postanowiono wykorzystać znaną niską selektywność permeaz dipeptydów w komórkach grzybów. Rozpoczęto syntezy i oznaczanie aktywności przeciwgrzybowej różnych dipeptydów zawierających pochodne kwasu 3-N-(fumaroilo)-L-2,3-diaminopropanowego. Stwierdzono, że najlepszym wnikaniem charakteryzują się dipeptydy zawierające jako fragment N-terminalny aminokwas z długim, alifatycznym łańcuchem bocznym (np. leucynę). Przyspieszyło to poszukiwanie dalszych związków o działaniu przeciwgrzybowym ilościowe zależności struktura - aktywność (QSAR) Omówiona powyżej metoda SAR pozwala zaproponować struktury związków o przypuszczalnej aktywności biologicznej określonego typu. Nie pozwala jednak przewidzieć ilościowo aktywności proponowanych związków. Ponadto wymaga zwykle dużej liczby pochodnych dla ustalenia określonych reguł SAR. Wynika to z faktu, że na danym etapie określa się wpływ tylko jednego elementu struktury, np. optymalnego podstawnika w określonym miejscu pierścienia. Zastosowanie obliczeń statystycznych (regresyjnych) pozwala w pewnych sytuacjach wyeliminować obydwie, omówione powyżej trudności. Szczegółowemu omówieniu tego typu metod znanych w literaturze przedmiotu jako metody QSAR (od ang. Quantitative Structure-Activity Relationships) poświęcone będą Części IV i V. 3

4 6.2. Podstawy projektowania leków Bazą do racjonalnego projektowania leków, w tym również chemoterapeutyków, są z jednej strony informacje o zależnościach struktura - aktywność (SAR i/lub QSAR) uzyskane na wcześniejszych etapach badań, a z drugiej informacje o mechanizmie działania badanej grupy leków i to zarówno na poziomie komórkowym jak i molekularnym. Istnieją bardzo różnorodne metody projektowania leków. Można jednak wyróżnić kilka typowych sytuacji: znana struktura aktywna: na mniej lub bardziej przypadkowej drodze (metody przesiewowe lub przypadek) natrafiono na związek o poszukiwanym typie aktywności. Teraz na drodze modyfikacji chemicznych należy uzyskać pochodne lub analogi o wyższej aktywności. Problem sprowadza się w praktyce do o p t y m a l i z a c j i struktury. Duże usługi oddają tu metody QSAR pozwalające na szybkie znalezienie struktury optymalnej. znane empiryczne reguły aktywności: w oparciu o zbadaną aktywność grupy związków wyprowadzono empiryczne reguły SAR lub lepiej QSAR. Należy teraz z ich pomocą zaprojektować syntezę nowych pochodnych o spodziewanej wysokiej aktywności (selektywnej toksyczności), aby spośród nich wyselekcjonować związki o najkorzystniejszych właściwościach farmakologicznych. W pierwszym etapie badań dążymy przede wszystkim do uzyskania związków o możliwie wysokiej aktywności. Dopiero w etapach następnych, dysponując już związkiem o wysokiej aktywności optymalizujemy pozostałe jego właściwości, np.: toksyczność, wchłanialność czy rozpuszczalność w wodzie. Problem jest o rząd trudniejszy, gdyż poszukujemy struktury optymalnej 0 ze względu na wiele, często wykluczających się parametrów. Pewną pomocą mogą tu być nowoczesne metody chemometryczne omówione w Części V. znana struktura molekularna biopolimeru docelowego: w oparciu o badania nad mechanizmem działania pewnej grupy chemoterapeutyków ustalono ich cel molekularny (np. enzym). Poznana została struktura chemiczna i przestrzenna tego celu (badania rentgenostrukturalne) oraz miejsce wiązania chemoterapeutyków. W takiej sytuacji można się pokusić o zaprojektowanie związku o spodziewanej wysokiej zdolności do oddziaływania z tym biopolimerem. Wymaga to zastosowania zaawansowanych technik modelowania molekularnego z wykorzystaniem współczesnych superszybkich komputerów. Jeśli jednocześnie zaprojektowany związek nie będzie działał na inne cele i będzie w stanie dotrzeć do pożądanego celu ukrytego we wnętrzu komórki, to mamy dużą szansę na nowy lek. 4

5 PRZYKŁADOWE ĆWICZENIA: Zadanie 1 : W oparciu o zamieszczoną poniżej tabelę struktur i aktywności przeciwgrzybowych pochodnych etylobenzenu określ, jaki podstawnik powinien się znajdować w każdej z modyfikowanych pozycji, aby uzyskać pochodną o najwyższej spodziewanej aktywności. Podaj uzasadnienie dla każdego z sugerowanych podstawników. pmic oznacza ujemny logarytm z minimalnego stężenia hamującego wzrost grzybów. R 6 CH 2 CH 2 X R 2 Związek Podstawniki pmic X R 2 R 4 R 6 B1 OH Me Me Me 2,54 B2 NH 2 Me Me Me 1,83 B3 OH Me Me 3,04 B4 OH Cl Cl Cl 1,93 B5 NH 2 Cl OMe Me 2,28 B6 Cl 0,18 B7 OMe Cl 1,27 B8 OH OMe OMe 1,59 B9 OH OMe Me Cl 1,51 B10 OH OMe OMe 2,50 B11 OH Me 0,53 B12 OH Cl Me 0,70 B13 OH Cl 1,49 B14 NH 2 Cl 0,80 B15 NH 2 OMe 1,09 B16 NH 2 Me OMe 2,05 B17 NH 2 Me Cl 1,48 B18 Cl OMe 0,99 B19 OMe OMe 0,57 R 4 5