BREFELDYNA A WGL D W FUNKCJONOWANIE SYSTEMU B ON KOMÓREK ROŒLINNYCH*

Transkrypt

1 19 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 1 (19 33) BREFELDYNA A WGL D W FUNKCJONOWANIE SYSTEMU B ON KOMÓREK ROŒLINNYCH* BREFELDIN A AN INSIGHT INTO THE FUNCTIONING OF THE MEMBRANE SYSTEM OF PLANT CELLS Paulina M YNKOWIAK*, Przemys³aw WOJTASZEK Zak³ad Biologii Molekularnej i Komórkowej UAM, Poznañ Streszczenie: Prawid³owe funkcjonowanie komórek eukariotycznych jest œciœle zale ne od sprawnego przemieszczania b³on. Brefeldyna A toksyna pochodzenia grzybowego, zak³óca to przemieszczanie umo liwiaj¹c eksperymentalny wgl¹d w organizacjê i wspó³dzia³anie ró nych przedzia³ów systemu b³onowego. Niedawno zidentyfikowano bia³ka docelowe i miejsca dzia³ania BFA. W pracy analizujemy mechanizm dzia³ania brefeldyny A i wskazujemy szczególne cechy systemu b³on wewnêtrznych komórek roœlinnych, które przes¹dzaj¹ o swoistych reakcjach roœlin na tê toksynê. Pokazujemy równie, jak badania jednej z takich reakcji na BFA wytwarzania przedzia³ów BFA, doprowadzi³y do odkrycia nowych aspektów procesu endocytozy u roœlin. Wskazujemy wreszcie na implikacje, jakie niesie za sob¹ poznanie mechanizmów dzia³ania BFA dla najnowszych koncepcji dotycz¹cych molekularnych i komórkowych mechanizmów polarnego transportu auksyn. S³owa kluczowe: brefeldyna A (BFA), czynnik wymiany nukleotydów (GEF), endocytoza, polarny transport auksyn, system b³on wewnêtrznych. Summary: The functioning of eukaryotic cells is strictly dependent on the proper vesicular traffic within the cell s membrane system. Brefeldin A a fungal toxin, disturbs this traffic, enabling an experimental insight into the organisation and co-operation of various elements of the system. Recently, BFA target proteins and sites of action have been identified. In this paper, we analyse the mechanism of BFA functioning and indicate those particular properties of the membrane system of plant cells that determine some of the reactions to BFA that are specific to plants. We demonstrate also, how the research into one of such reactions the formation of BFA compartments has led to the discovery of novel aspects of endocytosis in plants. Finally, we identify implications, born from the recognition of the mechanisms of BFA action, for the modern concepts of molecular and cellular mechanisms of polar auxin transport. Key words: brefeldin A, endocytosis, guanine nucleotide exchange factor, polar auxin transport, membrane system. *Autorka jest studentk¹ II roku studiów magisterskich biotechnologii. Autorzy dziêkuj¹ Ministerstwu Edukacji i Nauki za wsparcie finansowe w ramach projektu badawczego 6 P04C

2 20 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK Wykaz skrótów: AG aparat Golgiego; ARF czynnik ADP-rybozylacji; BFA brefeldyna A; COP kompleks bia³ek op³aszczaj¹cych pêcherzyki transportuj¹ce; ER retikulum endoplazmatyczne; ERGIC (ang. ER-Golgi Intermediate Compartment) przedzia³ poœredni; VTC (ang. Vesicular- Tubular Cluster) struktura pêcherzykowo-rurkowa; GEF czynnik wymiany nukleotydów; PAT polarny transport auksyn; PIN mutant Arabidopsis PIN-FORMED; SNARE (ang. Soluble N- ethylmaleimide sensitive factor Adaptor protein REceptor) bia³ka poœrednicz¹ce w fuzji b³on; TGN (ang. trans-golgi network) sieæ trans aparatu Golgiego. RYCINA 1. Wzór strukturalny brefeldyny A Wyodrêbnienie, przez b³ony biologiczne, okreœlonych przedzia³ów o swoistych w³aœciwoœciach i funkcjach jest cech¹ charakterystyczn¹ komórek eukariotycznych. Komunikacja pomiêdzy ró nymi elementami systemu b³on wewnêtrznych jest jednym z kluczowych warunków prawid³owego funkcjonowania komórki. Brefeldyna A (BFA) zak³óca przemieszczanie b³on przez aparat Golgiego i transport pêcherzykowy [19]. Ta lipofilna toksyna pochodzenia grzybowego, o strukturze makrocyklicznego pierœcienia laktonowego (ryc.1), wyizolowana zosta³a po raz pierwszy z Penicillium brefeldianum. Dziêki swym w³aœciwoœciom brefeldyna A sta³a siê znakomitym narzêdziem badawczym umo liwiaj¹c poznanie wielu szczegó³ów organizacji i dzia³ania systemu b³on wewnêtrznych. Choæ BFA wykorzystywana jest do badañ od oko³o 40 lat, dopiero w 1992 r. zidentyfikowano bia³ka docelowe [20, 36], a w 2003 r. ustalono mechanizm jej dzia³ania [61]. Tu chcemy wskazaæ na niektóre implikacje, jakie odkrycia te maj¹ dla poznania mechanizmów polarnego transportu auksyn oraz endocytozy u roœlin. SYSTEM B ON WEWNÊTRZNYCH I JEGO CECHY SZCZEGÓLNE U ROŒLIN System b³on wewnêtrznych, jego organizacja i elementy sk³adowe s¹ podobne we wszystkich komórkach eukariotycznych. Organelle systemu: retikulum endoplazmatyczne (ER), aparat Golgiego (AG), wakuole/lizosomy, endosomy, otoczka j¹drowa i b³ona komórkowa, w³¹czana weñ coraz czêœciej, komunikuj¹ siê nieustannie ze sob¹ przede wszystkim za pomoc¹ transportu pêcherzykowego [40] (przegl¹d literatury w jêzyku polskim w [64, 65]). Wyró nia siê zwykle dwie g³ówne drogi transportu w obrêbie systemu: szlak sekrecyjny, prowadz¹cy od ER poprzez AG i sieæ trans aparatu Golgiego (TGN) do b³ony komórkowej oraz szlak endocytozy, wiod¹cy od b³ony komórkowej poprzez ró ne formy endosomów do lizosomów/wakuol. Analizuj¹c dok³adniej funkcjonowanie systemu b³on wewnêtrznych zauwa yæ mo na pewne cechy szczególne, charakterystyczne dla ró nych grup organizmów eukariotycznych. Przypuszcza siê, e wynikaj¹ one z przyjêcia odmiennej strategii utrzymania wewnêtrznej homeostazy

3 21 sk³adu chemicznego [57, 77, 78] przez otoczone œcian¹ komórki roœlin i grzybów oraz nagie komórki zwierzêce, co prowadzi do odmiennych sposobów wzrostu komórek [6]. Du e znaczenie ma równie rodzaj makrocz¹steczek transportowanych w obrêbie systemu. O ile bowiem w komórkach zwierzêcych dominuj¹cym sk³adnikiem pêcherzyków przemieszczaj¹cych siê w obrêbie np. szlaku sekrecyjnego s¹ bia³ka, o tyle w przypadku roœlin szlakiem tym transportowane s¹ przede wszystkim polisacharydy buduj¹ce œciany komórkowe, z grupy pektyn i hemiceluloz. Do cech wyró niaj¹cych system b³on wewnêtrznych komórek roœlinnych zaliczyæ nale y [14, 27, 34, 40, 56, 63, 74]: 1) organizacjê aparatu Golgiego w postaci du ej liczby ruchliwych stosów (diktiosomów) w odró nieniu od pojedynczego, statycznego i ulokowanego centralnie aparatu Golgiego w komórce zwierzêcej; 2) wystêpowanie co najmniej dwóch funkcjonalnych typów wakuol: litycznych i gromadz¹cych bia³ka; 3) prawdopodobny brak przedzia³u poœredniego, podobnego do zwierzêcego ERGIC, pomiêdzy ER i AG; 4) wystêpowanie ruchliwych miejsc eksportu bia³ek z ER do diktiosomów; 5) wykorzystanie filamentów aktynowych, a nie mikrotubul do pozycjonowania i przemieszczania organelli i pêcherzyków transportowych; 6) utrzymanie integralnoœci organelli, zw³aszcza stosów AG, w trakcie cytokinezy. TRANSPORT PÊCHERZYKOWY G ÓWNY SZLAK KOMUNIKACYJNY SYSTEMU B ON WEWNÊTRZNYCH Transport pêcherzykowy polega na formowaniu pêcherzyków z b³ony przedzia³u donorowego, które przemieszczaj¹ siê, by zlaæ siê z b³on¹ przedzia³u akceptorowego [51]. Formowane pêcherzyki pobieraj¹ cargo (³adunek), które uwalniane jest do œwiat³a przedzia³u docelowego. Kszta³towanie pêcherzyków zachodzi z udzia³em cytozolowych bia³ek op³aszczaj¹cych, których typ wyznacza w pewnym stopniu szlak wêdrówki okrytych nimi pêcherzyków. Bia³ka te konieczne s¹ do uformowania pêcherzyków i po ich oddzieleniu od b³ony donorowej zwykle oddysocjowuj¹ ods³aniaj¹c transb³onowe bia³ka SNARE.Wzajemne oddzia³ywania bia³ek v-snare w b³onie pêcherzyka z bia³kami t-snare w b³onie akceptorowej umo liwiaj¹ fuzjê b³on obu przedzia³ów. W transporcie postêpowym (anterogradowym), w którym makrocz¹steczki s¹ eksportowane z ER, poœrednicz¹ pêcherzyki op³aszczone bia³kami COPII. Przy³¹czenie bia³ek COPII po stronie cytozolowej b³ony ER wymaga obecnoœci bia³ka Sar1 o aktywnoœci GTPazowej oraz w³aœciwego czynnika wymiany nukleotydów, w tym przypadku Sec12 (przegl¹d w [65]). Bia³ka te zidentyfikowano pocz¹tkowo u dro d y, a ich odpowiedniki wykryto u wszystkich grup organizmów, w tym roœlin [40, 51]. U ssaków odp¹czkowuj¹ce z ER pêcherzyki ulegaj¹ fuzji tworz¹c polimorficzn¹ strukturê pêcherzykowo-rurkow¹ ulokowan¹ pomiêdzy ER i AG, okreœlan¹ jako VTC lub ERGIC. U roœlin poszczególne diktiosomy AG przemieszczaj¹ siê przy udziale systemu aktynomiozynowego wzd³u struktur ER [11, 52], wymieniaj¹c siê materia³em [13], w tym

4 22 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK bezpoœrednio odbieraj¹c w cysternach cis diktiosomów cargo niesione przez pêcherzyki oddysocjowuj¹ce z ER. W obecnoœci brefeldyny A markery cystern cis przemieszczaj¹ siê do ER [68]. Doœwiadczenia z wykorzystaniem techniki FRAP wykaza³y natomiast, e powstawanie nowych cystern cis zwi¹zane jest z fuzj¹ wychodz¹cych z ER pêcherzyków op³aszczonych COPII z pêcherzykami COPI wychodz¹cymi z AG (przegl¹d w [75]). Bia³ka op³aszczaj¹ce typu COPI zwi¹zane s¹ z transportem wstecznym (retrogradowym) pêcherzyków z AG do ER oraz w obrêbie AG. Asocjacjê podjednostek kompleksu op³aszczaj¹cego COPI indukuje czynnik ARF ma³e bia³ko o aktywnoœci GTPazowej, który bierze równie udzia³ w formowaniu pêcherzyków okrytych klatryn¹ [82]. Aktywacji ARF dokonuj¹ bia³ka ARF-GEF czynniki wymiany nukleotydów guaninowych. U ssaków znanych jest przynajmniej szeœæ bia³ek ARF oraz kilka podobnych strukturalnie bia³ek o zró nicowanej lokalizacji tkankowej. W komórkach dro d y znaleziono tylko trzy, a u Arabidopsis 9 do 12 genów ARF [41]. Równie bia³ka ARF-GEF s¹ doœæ zró nicowane. Dotychczas u ssaków opisano piêæ odrêbnych rodzin ARF-GEF [21], natomiast 8 czynników ARF-GEF Arabidopsis zaliczono jedynie do dwóch rodzin: klasy GNOM/Gea1/2p/GBF1 i klasy BIG/Sec7p [41]. W odró nieniu od czynników ssaczych, wszystkie ARF-GEF Arabidopsis nale ¹ do tzw. du ych bia³ek ARF-GEF i s¹ przewa nie wra liwe na BFA. MECHANIZM DZIA ANIA BREFELDYNY A Jak wspomniano, na pocz¹tku lat 90. XX w. stwierdzono, e bia³kami docelowymi dla BFA s¹ bia³ka GEF. Ustalenie, dlaczego nie wszystkie bia³ka AFR-GEF s¹ wra liwe na BFA i jaki jest w³aœciwie mechanizm dzia³ania toksyny, zajê³o kolejne 10 lat. Ró ne bia³ka ARF dzia³aj¹ w ró nych etapach sekrecji i endocytozy, a ka de z nich wymaga wspó³pracy swoistego czynnika wymiany nukleotydów. Zdolnoœæ wymiany nukleotydów zwi¹zana jest z obecnoœci¹ w bia³kach GEF domeny Sec7 (lub struktury homologicznej do Sec7) [39]. Jej struktura zosta³a okreœlona [15, 49], jak równie struktury kompleksu bia³kowego ARF-domena Sec7 [31] i kompleksu nios¹cego nukleotyd ARF:GDP-domena Sec7 [8]. Proponowany mechanizm dzia³ania GEF jest nastêpuj¹cy (ryc. 2): bia³ko GEF rozpoznaje kompleks ARF:GDP i wi¹ ¹c siê z nim obni a powinowactwo ARF do GDP. Po uwolnieniu GDP wolne miejsce zajmuje GTP. Prowadzi to do zmiany konformacji bia³ka ARF i od³¹czenia bia³ka GEF, które mo e oddzia³ywaæ z kolejnym bia³kiem G [58]. Ten ostatni etap jest kluczowy, kontroluje wymianê nukleotydów i uwolnienie aktywnej formy ARF:GTP. Je eli GTP nie mo e przy³¹czyæ siê do bia³ka G, mo e dojœæ do utworzenia nieprawid³owego kompleksu ARF-GEF. Poniewa poziom ekspresji bia³ek GEF w komórce jest ni szy ni odpowiadaj¹cych im ARF, ju ma³a iloœæ wolnego bia³ka G jest wystarczaj¹ca do zwi¹zania ca³ej endogennej puli bia³ek GEF. W efekcie prowadzi to do poœredniego zahamowania endogennej aktywacji bia³ek G. Porównuj¹c ró ne bia³ka GEF stwierdzono, e na BFA wra liwe s¹ bia³ka zaliczane do klas tzw. du ych bia³ek GEF, natomiast ma³e bia³ka GEF, takie jak np. ludzki czynnik ARNO, s¹ najczêœciej niewra liwe [15]. Szczegó³owa analiza porównawcza du ych

5 23 RYCINA 2. Mechanizm dzia³ania czynnika wymiany nukleotydów (GEF) bia³ek Gea1/2 z bia³kami ARNO wykaza³a, e pozycje aminokwasów odpowiadaj¹ce za wra liwoœæ na toksynê skupiaj¹ siê w rejonie domeny Sec7 zachodz¹cym na nie lub znajduj¹cym siê bardzo blisko miejsca wi¹zania ARF1 [58]. Dok³adny obszar dzia³ania brefeldyny A okreœlono niedawno, dziêki rozszyfrowaniu struktury kompleksu ARF: GDP-BFA-domena Sec7 [61]. Powsta³o wobec tego pytanie, czy mechanizm inhibicyjnego dzia³ania BFA mo e polegaæ na wspó³zawodnictwie BFA i ARF o miejsce wi¹zania w domenie Sec7? Je eli by tak by³o, mielibyœmy do czynienia z sytuacj¹, w której ma³a cz¹steczka (taka jak BFA) mo e skutecznie blokowaæ oddzia³ywania bia³ko:bia³ko. Czy jednak ma³a cz¹steczka mo e wi¹zaæ siê z bia³kiem docelowym w sposób kompetycyjny z takim samym powinowactwem jak bia³kowy partner tego bia³ka? Dok³adniejsze analizy wykaza³y, e o wiele skuteczniejsze mo e byæ hamowanie niekompetycyjne, w którym ma³a cz¹steczka wi¹ e siê odwracalnie z ju utworzonym kompleksem bia³kowym w okreœlonym miejscu, innym od tego, gdzie przy³¹czy³ siê bia³kowy partner. Daje to dwojakie korzyœci: wspó³zawodnictwo miêdzy bia³kiem a ma³¹ cz¹steczk¹ jest o wiele bardziej efektywnym mechanizmem regulatorowym, a stê enie inhibitora niekompetycyjnego wymagane do jego w³¹czenia siê w utworzony kompleks bia³kowy jest ni sze ni stê enie inhibitora kompetycyjnego wymagane do nasycenia bia³ka maj¹cego utworzyæ kompleks. I rzeczywiœcie, dalsze doœwiadczenia wykaza³y, e BFA raczej stabilizuje kompleks ARF:GDP-Sec7 ni przeciwdzia³a jego formowaniu [58]. BFA jest wiêc inhibitorem niekompetycyjnym: wi¹ ¹c siê odwracalnie z kompleksem utworzonym pomiêdzy

6 24 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK ARF:GDP i domen¹ Sec7 (ARF:GDP-BFA-domena Sec7) uniemo liwia dysocjacjê nukleotydu. Powstaje endogenna pula ARF:GDP-GEF, która funkcjonuje jako negatywny dominant unieruchamiaj¹c bia³ko GEF w kompleksie, a to z kolei uniemo liwia aktywacjê innych cz¹steczek ARF przez ten czynnik. ZMIANY MORFOLOGICZNE INDUKOWANE DZIA ANIEM BFA Jednymi z pierwszych obserwacji komórek zwierzêcych, które wzbudzi³y zainteresowanie wykorzystaniem BFA w biologii komórki, by³y dane pokazuj¹ce zahamowanie wydzielania bia³ek we wczesnych etapach szlaku sekrecyjnego. Potwierdzi³y to dane mikroskopowe, wskazuj¹ce, e w komórkach traktowanych BFA bia³ka wydzielane i bia³ka b³onowe s¹ zatrzymywane w ER. Co wiêcej, po pewnym czasie bia³ka te zaczynaj¹ wykazywaæ cechy bia³ek poddanych modyfikacjom potranslacyjnym typowym dla aparatu Golgiego (przegl¹d w [43]). St¹d te wywnioskowano, e BFA zmienia organizacjê i przemieszczanie b³on w AG, a w dalszej konsekwencji równie w ER. W komórkach zwierzêcych traktowanych BFA cysterny AG pocz¹tkowo pêczniej¹, a nastêpnie pojawiaj¹ siê d³ugie, rurkowate wypustki, które z czasem, po rozpadzie na drobniejsze pêcherzyki, ³¹cz¹ siê z ER; zanika równie przedzia³ VTC. W wiêkszoœci przypadków markery sieci TGN nie przemieszczaj¹ siê do ER, jednak e struktura TGN, endosomów i lizosomów ulega pewnym zmianom. Ta reakcja na BFA sugeruje, e for-ma organelli jest wynikiem subtelnej równowagi utrzymywanej dziêki bia³kom cyto-zolowym gromadz¹cym siê na powierzchniach b³on. BFA zak³óca tê równowagê hamuj¹c gromadzenie siê bia³ek op³aszczaj¹cych. Proces zaczyna siê od dysocjacji podjednostek β kompleksu COPI ju 20 sekund po dodaniu BFA w temperaturze 37 o C i jest zakoñczony po up³ywie 1 2 minut [16, 69]. Wówczas organelle przekszta³caj¹ siê w dynamiczny system rurek wystêpuj¹cych w mniejszej lub wiêkszej rozci¹g³oœci w ca³ej komórce. Poniewa bia³ka COP wi¹ ¹ siê odwracalnie z b³onami, nieop³aszczone rurki s¹ prawdopodobnie trwa³¹ form¹ struktur b³onowych. Ka da organella ma nie tylko charakterystyczny zestaw bia³ek op³aszczaj¹cych, ale równie swoisty sygna³ przy³¹czenia/od³¹czenia tych e bia³ek. Sygna³ ten mo e siê zmieniaæ, gdy rozpoczyna siê przekszta³canie struktury organelli. Op³aszczenie b³on lub jego brak to jeden z elementów, który ró nicuje dwa typy przemieszczania b³on w komórce: homotypowy i heterotypowy (tab. 1) [43]. Mechanizm poœrednicz¹cy w transporcie pêcherzykowym jest podobny u wszystkich eukariontów [52]. St¹d BFA dzia³a tak samo, w podobnych miejscach i wywiera podobny efekt podstawowy w postaci zmiany organizacji przemieszczania b³on u zwierz¹t, grzybów i roœlin. Jednak e, ze wzglêdu na odmienn¹ organizacjê systemu b³on wewnêtrznych (patrz wy ej), reakcje komórek roœlinnych wykazuj¹ pewne cechy swoiste. W komórkach roœlin najwczeœniej obserwowane s¹ zaburzenia w wydzielaniu bia³ek, przy czym efekt ten jest wyraÿnie swoisty dla ró nych gatunków roœlin i zale y od stê enia i czasu dzia³ania BFA. Zmiany morfologiczne w systemie b³on wewnêtrznych obserwuje siê przy stê eniach rzêdu dziesi¹tek µg/ml, podczas gdy zaburzenia transportu bia³ek na szlaku sekrecyjnym pojawiaj¹ siê ju przy stê eniach 0,3 µg/ml [34, 59]. W

7 25 TABELA 1. Porównanie dwóch typów transportu b³on w komórce Transport homotypowy Nie wymaga op³aszczenia bia³kowego Powstaj¹ce rurki umo liwiaj¹ bezpo- œrednie po³¹czenie pomiêdzy b³on¹ donorow¹ i docelow¹ Niewra liwy na dzia³anie BFA Transport heterotypow y Wymaga przy³¹czenia bia³ek ARF bia³ek COP do b³on oraz obecnoœci Powstaje system odrêbnych pêcherzyków przenosz¹cych ³adunek pomiêdzy b³on¹ donorow¹ i docelow¹ nie dochodzi do bezpoœredniego po³¹czenia obu b³on Wra liwy na dzia³anie BFA komórkach ssaków bia³ka ARF-GEF z rodzin wra liwych na BFA wykazuj¹ swoistoœæ dzia³ania zale n¹ od miejsca lokalizacji [80]. Na przyk³ad, GBF1 ulokowane s¹ w cysternach cis AG, podczas gdy BIG1 i BIG2 gromadz¹ siê g³ównie w TGN. Dzia³anie BFA w komórkach nadprodukuj¹cych bia³ka BIG2 prowadzi do stabilizacji procesu gromadzenia bia³ek AP1 na b³onach TGN, podczas gdy rekrutacja bia³ek COPI na b³onach cystern cis AG jest zak³ócona [71]. Podobn¹ sytuacjê obserwuje siê w komórkach roœlinnych, st¹d s¹dzi siê, e BFA mo e, bezpoœrednio lub poœrednio, wp³ywaæ na funkcjonowanie innych szlaków transportowych, prowadz¹c do ca³kowitego zahamowania wêdrówki bia³ek [22, 72]. Funkcjonowanie szlaku sekrecyjnego opiera siê na transporcie postêpowym pêcherzyków op³aszczonych bia³kami COPII. Tymczasem, analizuj¹c efekty dzia³ania BFA na wewn¹trzkomórkow¹ lokalizacjê bia³ek COPI w komórkach BY-2 tytoniu (Nicotiana tabacum) wykazano, e, podobnie jak w komórkach zwierzêcych [44], najwczeœniej obserwowanym procesem jest utrata cytozolowych bia³ek op³aszczaj¹cych COPI z AG [62]. Jak wiêc pogodziæ te pozornie sprzeczne fakty? Wydaje siê, e decyduj¹ce znaczenie ma tutaj równowaga pomiêdzy szlakami transportowymi przebiegaj¹cymi w przeciwnych kierunkach. Bior¹c pod uwagê cargo niesione przez pêcherzyki transportowe mo na zauwa yæ, e cech¹ szczególn¹ komórek roœlinnych jest znacz¹ce przesuniêcie równowagi na korzyœæ szlaku sekrecyjnego, którym wêdruj¹ na zewn¹trz sk³adniki œcian komórkowych, przede wszystkim polisacharydy [34, 77, 78]. St¹d te mo na przypuszczaæ, e znacznie intensywniejszy obrót bia³kami op³aszczaj¹cymi, jak i lipidami b³on sprzyja zwiêkszonej wra liwoœci tego szlaku na dzia³anie BFA. Co wiêcej, mo na równie s¹dziæ, e ta nierównowaga szlaków transportowych, jak równie zró nicowana wra liwoœæ bia³ek GEF na BFA s¹ Ÿród³em odmiennych reakcji morfologicznych na BFA, obserwowanych wy³¹cznie w komórkach roœlinnych, u których dzia³anie BFA prowadzi do powstania jednej lub dwóch charakterystycznych struktur: przedzia³u hybrydowego ER-Golgi oraz tzw. przedzia³ów BFA (ang. BFA compartments). Hybryda ER-Golgi W komórkach ssaków utrata bia³ek op³aszczaj¹cych COPI prowadzi do wzmo onego formowania nieop³aszczonych rurek b³onowych wzd³u mikrotubul [38, 69]. Po 10

8 26 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK minutach dzia³ania toksyny rurki s¹ ju niewidoczne. Ulegaj¹ fuzji z ER. W komórkach roœlinnych BFA nie prowadzi do gwa³townej zmiany struktury AG. Diktiosomy s¹ wstêpnie utrzymywane w normalnym u³o eniu i kszta³cie, oprócz widocznego ubytku cystern po stronie cis [62]. Stopniowo jednak cysterny AG ³¹cz¹ siê z ER, formuj¹c hybrydê ER-Golgi. W niektórych przypadkach pozosta³oœci cystern mog¹ siê ³¹czyæ bocznie z innymi diktiosomami, tworz¹c przeroœniête kompleksy AG, które dopiero póÿniej zlewaj¹ siê w hybrydê z ER [62]. Z kolei w niektórych typach komórek powstawanie hybrydy ER-Golgi nastêpuje przez zlewanie siê indywidualnych cystern AG z ER i przez pewien czas mo na obserwowaæ diktiosomy z przy³¹czonymi cysternami hybrydowymi [51]. Przypuszcza siê, e zmiany te odzwierciedlaj¹ wysok¹ stabilnoœæ strukturaln¹ indywidualnych diktiosomów, która jest konieczna w warunkach czêstego i szybkiego ich przemieszczania w obrêbie komórki [11, 52]. Co ciekawe, w odró nieniu od zwierz¹t, w komórkach roœlinnych proces zlewania siê b³on ER i aparatu Golgiego jest niezale ny od obecnoœci funkcjonalnego cytoszkieletu [13]. Przedzia³ BFA Znacznie wczeœniejsze s¹ opisy drugiej ze struktur, pokazuj¹ce proces dezintegracji diktiosomów w zlepek rurek i pêcherzyków, okreœlany jako przedzia³ BFA. Analiza wêdrówki bia³ek przez system b³on wewnêtrznych w komórkach poddanych dzia³aniu BFA wykaza³a, e bia³ka uwalniane z aparatu Golgiego gromadz¹ siê w du ych skupiskach b³onowych zlokalizowanych w okolicach j¹dra komórkowego. Owe skupiska rozmieszczone s¹ w jak najwiêkszych odleg³oœciach od siebie, po przeciwnych stronach j¹dra i zgodnie z osi¹ symetrii komórki [67]. Obecnie interpretuje siê te wczesne wyniki jako proces horyzontalnego rozszczepienia diktiosomów w reakcji na BFA. Wiêkszoœæ cystern zostaje zaabsorbowana przez ER z przejœciowym uformowaniem hybrydy ER-Golgi. Natomiast cysterny trans diktiosomów oraz pêcherzyki TGN zlewaj¹ siê formuj¹c przedzia³ BFA. Pozycja rozszczepienia stosów Golgiego jest wyznaczana przez cysterny niezaanga owane w p¹czkowanie pêcherzyków op³aszczonych bia³kami COPI. W minimalnej, trudnej do zaobserwowania, formie przedzia³ BFA zawiera tylko TGN i jedn¹ lub dwie cysterny trans-golgiego. Jego formowanie zaczyna siê znacznie szybciej od innych zmian wywo³anych BFA, gdy obecnoœæ przedzia³ów BFA mo na odnotowaæ równolegle z pozornie nienaruszonymi stosami AG [29, 62]. Elementy ER nie bior¹ udzia³u w tworzeniu tej struktury [37]. Obserwacje te sugeruj¹, e musi istnieæ jakieœ dodatkowe Ÿród³o b³on zasilaj¹ce tworzenie przedzia³u BFA. Ostatnie badania wskazuj¹, e tworzenie przedzia³u BFA zasila szlak endocytozy [2, 53] (patrz równie ni ej). Przedzia³ BFA jest wiêc hybryd¹ cysterny trans AG:TGN:endosomy, zwykle o okreœlonej organizacji przestrzennej: w centrum znajduj¹ siê pêcherzyki szlaku endocytozy, a na peryferiach zlokalizowane s¹ pozosta³oœci stosów AG rozmieszczone w sposób spolaryzowany z cysternami trans zwróconymi w stronê przedzia³u BFA (przegl¹d w [66]). W komórkach roœlin formowanie du ych przedzia³ów BFA jest unikatow¹ cech¹ jedynie pewnych typów komórek. Struktury te s¹ formowane w komórkach merystematycznych korzenia, natomiast brak ich w komórkach sekrecyjnych czapeczki korzenia, komórkach metaksylemu i w innych komórkach korzenia

9 27 aktywnych w procesie egzocytozy. Jedynym wyj¹tkiem s¹ komórki epidermalne zaanga owane w formowanie w³oœników korzeniowych [2]. BFA, CZYLI TAM I Z POWROTEM ENDOCYTOZA U ROŒLIN Do niedawna kwestionowano istnienie endocytozy u roœlin [35]. G³ównym argumentem w dyskusjach by³o 1) wystêpowanie œcian komórkowych oraz 2) wzglêdy mechaniczne, a wiêc trudnoœci w formowaniu pêcherzyków transportowych w warunkach ciœnienia turgorowego przyciskaj¹cego b³onê komórkow¹ do œcian. Jednak e wykorzystanie nowych technik obrazowania, a przede wszystkich nowych sond, takich jak: bia³ko GFP lub jego pochodne, asocjuj¹cych z b³on¹ barwników z rodziny FM, steroli roœlinnych znakowanych filipin¹ czy wreszcie BFA, w przekonuj¹cy sposób wykaza³y, e endocytoza jest zjawiskiem powszechnym u roœlin, a mechanizmy endocytozy s¹ doœæ zbli one do tych, jakie znane s¹ w komórkach zwierzêcych (przegl¹d w [1, 66]). Ostatnio wykazano równie, e nawet w komórkach charakteryzuj¹cych siê wysokim turgorem, takich jak komórki szparkowe, endocytoza jest zjawiskiem konstytutywnym i e t¹ drog¹ pobierane s¹ barwniki markerowe oraz wycofywane bia³ka b³ony komórkowej [47]. Zastosowanie BFA w odpowiednich stê eniach umo liwi³o selektywne hamowanie b¹dÿ to procesów wydzielania bia³ek na zewn¹trz komórek roœlinnych, b¹dÿ te pobierania substancji z zewn¹trz czy wycofywania bia³ek b³ony komórkowej. Badania te wykaza³y, e w obecnoœci BFA internalizacji endocytotycznej i gromadzeniu siê w przedzia³ach BFA ulegaj¹ m.in. przenoœniki wyp³ywu auksyn z rodziny PIN (patrz ni ej) [28, 29], H + -ATP-aza b³ony komórkowej [2, 29], a tak e peryferyczne bia³ko ARG1 b³ony komórkowej powi¹zane z odpowiedzi¹ roœlin na bodÿce grawitacyjne [12]. Zjawisko to jest charakterystyczne wy³¹cznie dla roœlin, gdy u zwierz¹t nie obserwuje siê internalizacji markerów b³ony komórkowej pod wp³ywem BFA. Co wiêcej, odmycie BFA w obecnoœci cykloheksimidu [29] prowadzi³o do powrotu niektórych bia³ek do b³on komórkowych, co uznaæ mo na za bezpoœredni¹ wskazówkê na istnienie u roœlin pe³nego systemu umo liwiaj¹cego kr¹ enie bia³ek b³on komórkowych. Podobne obserwacje dotycz¹ steroli roœlinnych b³on komórkowych [32]. Doœwiadczenia na korzeniach Arabidopsis pokazuj¹ równie, e o ile akumulacjê bia³ek b³ony komórkowej w przedzia³ach BFA mo na zaobserwowaæ ju po ok. 30 min dzia³ania toksyny, o tyle nagromadzenie wewn¹trz komórki bia³ek wydzielanych szlakiem sekrecyjnym mo liwe jest dopiero przy d³ugotrwa³ej, bo trwaj¹cej co najmniej 24 godz., obecnoœci BFA [81]. Wydaje siê, e wspomniane wy ej doœwiadczenia jasno dowodz¹, e endocytoza i endosomy przyczyniaj¹ siê do formowania przedzia³ów BFA. Jednym z nieoczekiwanych efektów poœrednich dzia³ania BFA, swoistym, jak siê wydaje, dla komórek roœlinnych jest obecnoœæ w pêcherzykach endocytotycznych i dalej w przedzia³ach BFA pektyn œciany komórkowej, w tym homogalakturonanu o niskim stopniu estryfikacji (do 40%), czy dimerów ramnogalakturonanu II skompleksowanych z jonami

10 28 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK boranowymi [2]. Dotychczas bowiem uwa ano, e makrocz¹steczki wydzielane s¹ do œcian komórkowych nieodwracalnie i e jedynie produkty ich degradacji, takie jak: oligosacharyny lub elicytory, mog¹ powróciæ do protoplastu jako cz¹steczki sygna³owe. Oba wspomniane polimery pektynowe powstaj¹ jedynie w œcianach komórkowych, a nie s¹ syntezowane w szlaku sekrecyjnym. Przyk³adowo, homogalakturonan jest wytwarzany w aparacie Golgiego w postaci polimeru silnie estryfikowanego (zwykle powy ej 80%), a usuwanie grup metylowych nastêpuje w œcianach przy udziale metyloesterazy pektyn [77]. Co wa niejsze, traktowanie protoplastów BFA prowadzi do pojawienia siê przedzia³ów BFA niezawieraj¹cych polimerów pektynowych [2]. W roœlinach pozbawionych boru, gwa³townie wzrasta zawartoœæ pektyn w œcianach komórkowych i nie obserwuje siê internalizacji deestryfikowanego homogalakturonanu czy kompleksów boranowych z ramnogalakturonanem II [79]. Poniewa polimery pektynowe odgrywaj¹ kluczow¹ rolê w determinacji wytrzyma³oœci mechanicznej i porowatoœci œcian, mo na przypuszczaæ, e ich kontrolowana internalizacja jest istotnym czynnikiem regulatorowym wp³ywaj¹cym na wzrost, polarnoœæ i morfogenezê komórek i tkanek roœlinnych. Endocytoza jest procesem zale nym od funkcjonowania cytoszkieletu komórki [60, 66]. W komórkach zwierzêcych, nienaruszony cytoszkielet aktynowy warunkuje prawid³owy przebieg endocytozy [23]. Najnowsze obserwacje sugeruj¹, e podobna sytuacja ma miejsce u roœlin. Depolimeryzacja aktyny przez latrunkulinê B czy cytochalazynê D hamuje formowanie du ych przedzia³ów BFA [2] lub kr¹ enie steroli b³on komórkowych [32]. Podobnie, endocytozê hamuje zastosowanie inhibitora miozyny [3]. Natomiast depolimeryzacja mikrotubul przez oryzalinê nie wp³ywa na endocytozê pektyn [2]. OPOWIEŒÆ O SKRZATACH BFA I POLARNY TRANSPORT AUKSYN Auksyny s¹ uwa ane za integrator wzrostu i rozwoju roœlin dzia³aj¹cy podobnie jak morfogeny u zwierz¹t [9, 24]. Zidentyfikowano je prawie 80 lat temu, ale dopiero w ostatnich latach zaczynamy poznawaæ mechanizmy molekularne dzia³ania tych hormonów [17, 18, 19, 42]. Decyduj¹ce znaczenie dla prawid³owego funkcjonowania auksyn ma ich polarny transport (PAT) w roœlinach. Poniewa zosta³ on wyczerpuj¹co omówiony w wielu pracach przegl¹dowych (np. [24, 45, 50, 55], w literaturze polskiej [7, 76]), tu ograniczymy siê jedynie do przedstawienia zagadnieñ zwi¹zanych bezpoœrednio z BFA lub takich, które ujrza³y œwiat³o dzienne ju po publikacji wymienionych prac. W po³owie lat 80. XX w. pojawi³y siê pierwsze wyniki badañ przesiewowych mutantów A. thaliana o zaburzonych procesach embriogenezy [48]. Jednym z nich by³ mutant GNOM (znany równie jako EMB30) o szerokiej gamie fenotypów, których wspóln¹ cech¹ by³ brak merystemu korzeniowego i, najczêœciej, nieprawid³owo wykszta³cone tkanki wzd³u osi góra-dó³ [46, 70]. W póÿniejszym okresie stwierdzono równie, e GNOM dzia³a tak e w dalszych etapach rozwoju roœlin, wp³ywaj¹c na funkcjonowanie merystemu korzeniowego i organizacjê zawi¹zków korzeni bocznych [30]. Mutacjê zlokalizowano w genie koduj¹cym bia³ko podobne do bia³ka Sec7 z dro d y

11 29 [70], które zidentyfikowano jako bia³ko ARF-GEF [73]. Bia³ko GNOM nale y do klasy GNOM/Gea1/2p/GBF1 [41]. W komórkach Arabidopsis jest ono zwi¹zane z cytoplazmatyczn¹ stron¹ endosomu i jest niezbêdne do utrzymania integralnoœci endosomów [28]. Ró ni siê tym samym od innych bia³ek tej klasy, które u dro d y i zwierz¹t zwi¹zane s¹ z transportem w obrêbie AG i pomiêdzy ER i AG. Fenotyp mutantów GNOM mo na wywo³aæ w warunkach in vitro traktuj¹c zarodki wysokimi stê eniami auksyn lub inhibitorow PAT [33]. To sugeruje, e GNOM mo e w jakiœ sposób braæ udzia³ w transporcie auksyn. I rzeczywiœcie, stwierdzono, e w mutantach gnom zak³ócona jest lokalizacja PIN1 potencjalnych bia³ek wspomagaj¹cych wyp³yw auksyn [29]. W genomie Arabidopsis znajduje siê 8 genów koduj¹cych bia³ka PIN, z czego 5 zosta³o dot¹d w pe³ni scharakteryzowanych. Wszystkie one, a w szczególnoœci PIN1 [26], wp³ywaj¹ na transport auksyn, choæ ich funkcja jako przenoœników auksyn lub regulatorów transportu, jest nadal niejasna [55]. Najbardziej uderzaj¹c¹ cech¹ bia³ek PIN jest ich œcis³a lokalizacja, nie tylko na poziomie tkankowym, ale równie w okreœlonych domenach b³ony komórkowej w zale noœci od po³o enia komórki w ciele roœliny [10, 24, 55]. Sugeruje siê wobec tego, e lokalizacja bia³ek PIN nie jest zale na od struktury tych bia³ek, ale jest okreœlana przez ukierunkowany transport tych bia³ek do wybranych rejonów komórki [55]. Co ciekawsze, najnowsze dane zdaj¹ siê œwiadczyæ, e same auksyny s¹ jednym z czynników reguluj¹cych ekspresjê genów i dystrybucjê bia³ek PIN [10, 54]. U roœlin BFA indukuje powstawanie pêcherzykowych agregatów zwanych przedzia³ami BFA. Gromadz¹ siê w nich zarówno bia³ka PIN1, jak i GNOM [29, 73], co sugeruje, e bia³ka PIN1 kr¹ ¹ pomiêdzy b³on¹ komórkow¹ a przedzia³ami endosomalnymi w pêcherzykach wzd³u cytoszkieletu aktynowego [4, 29, 50]. Tak wiêc uszkodzenie GNOM zak³óca wewn¹trzkomórkowy transport pêcherzykowy, co prowadzi do zaburzeñ w kr¹ eniu PIN1 i w konsekwencji do rozregulowania transportu auksyn. Analiza porównawcza sekwencji bia³ek ARF-GEF opornych i wra liwych na dzia³anie BFA wskaza³a reszty aminokwasowe krytyczne dla odpornoœci bia³ek. Prosta substytucja aminokwasowa (zamiana 696 M na L w obrêbie domeny Sec7) w genie GNOM okaza³a siê wystarczaj¹ca do uzyskania mutantów niewra liwych na toksynê, a tym samym wykazuj¹cych nienaruszony transport auksyn i prawid³owe kr¹ enie bia³ka PIN1 w obecnoœci BFA [28]. PODSUMOWANIE Wykorzystanie brefeldyny A przyczyni³o siê do rozwik³ania wielu zagadek funkcjonowania systemu b³on roœlin. W niniejszej pracy wskazaliœmy jedynie niektóre z nich, wed³ug naszej opinii najciekawsze. Szczególnie ostatnie z omawianych, a zwi¹zane z polarnym transportem auksyn zainspirowa³y niektórych badaczy do sformu³owania bardzo interesuj¹cej, acz doœæ niezwyk³ej hipotezy, zgodnie z któr¹ PAT w wielu aspektach przypomina proces wydzielania neuroprzekaÿników przez synapsy nerwowe zwierz¹t [4, 5]. Wspomniano ju wczeœniej, e auksyny mog¹ spe³niaæ rolê analogiczn¹ do morfogenów zwierz¹t [9, 25]. Mo na mieæ nadziejê, e brefeldyna A oka e siê przydatna równie w badaniach zmierzaj¹cych do wyjaœnienia i rozpoznania tych fascynuj¹cych problemów.

12 30 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK LITERATURA [1] BAHAJI A, CORNEJO MJ, ORTIZ-ZAPATER E, CONTRERAS I, ANIENTO F. Uptake of endocytic markers by rice cells: variations related to the growth phase. Eur J Cell Biol 2001; 80: [2] BALUŠKA F, HLAVACKA A, ŠAMAJ J, PALME K, ROBINSON DG, MATOH T, MCCURDY DW, MENZEL D, VOLKMANN D. F-actin-dependent endocytosis of cell wall pectins in meristematic root cells insights from brefeldin A-induced compartments. Plant Physiol 2002; 130: [3] BALUŠKA F, ŠAMAJ J, HLAVACKA A, KENDRICK-JONES J, VOLKMANN D. Actin-dependent fluidphase endocytosis in inner cortex cells of maize root apices. J Exp Bot 2004; 55: [4] BALUŠKA F, ŠAMAJ J, MENZEL D. Polar transport of auxin: carrier-mediated flux across the plasma membrane or neurotransmitter-like secretion? Trends Cell Biol 2003; 13: [5] BALUŠKA F, VOLKMANN D, MENZEL D. Plant synapses: actin-based domains for cell-to-cell communication. Trends Plant Sci 2005; 10: [6] BALUŠKA F, WOJTASZEK P, VOLKMANN D, BARLOW P. The architecture of polarized cell growth: the unique status of elongating plant cells. BioEssays 2003; 25: [7] BANASIAK AS. Polarny transport auksyny hipotezy i odkrycia. Post Biol Kom 2003; 30: [8] BÉRAUD-DUFOUR S, ROBINEAU S, CHARDIN P, PARIS S, CHABRE M, CHERFILS J, ANTONNY B. A glutamic finger in the guanine exchange factor ARNO displaces Mg 2+ and the β-phosphate to destabilize GDP on ARF1. EMBO J 1998; 17: [9] BHALERAO RP, BENNETT MJ. The case for morphogens in plants. Nat Cell Biol 2003; 5: [10] BLILOU I, WILDWATER M, WILLEMSEN V, PAPONOV I, FRIML J, HEIDSTRA R, AIDA M, PALME K, SCHERES B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature 2005; 433: [11] BOEVINK P, OPARKA K, CRUZ SS, MARTIN B, BETTERIDGE A, HAWES C. Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/er network. Plant J 1998; 15: [12] BOONSIRICHAI K, SEDBROOK JC, CHEN R, GILROY S, MASSON P. Altered response to gravity is a peripheral membrane protein that modulates gravity-induced cytoplasmic alkalinization and lateral auxin transport in plant statocytes. Plant Cell 2003; 15: [13] BRANDIZZI F, SNAPP E, ROBERTS A, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J, HAWES C. Membrane protein transport between the ER and Golgi in tobacco leaves is energy dependent but cytoskeleton independent: evidence from selective photobleaching. Plant Cell 2002; 14: [14] CARTER CJ, BEDNAREK SY, RAIKHEL NV. Membrane trafficking in plants: new discoveries and approaches. Curr Opin Plant Biol 2004; 7: [15] CHERFILS J, MENETREY J, MATHIEU M, LE BRAS G, ROBINEAU S, BËRAUD-DUFOUR S, AN- TONNY B, CHARDIN P. Structure of the Sec7 domain of the Arf exchange factor ARNO. Nature 1998; 392: [16] DASCHER C, BALCH WE. Dominant inhibitory mutants of ARF1 block endoplasmic reticulum to Golgi transport and trigger disassembly of the Golgi apparatus. J Biol Chem 1994; 269: [17] DHARMASIRI N, DHARMASIRI S, ESTELLE M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 2005; 435: [18] DHARMASIRI N, DHARMASIRI S, WEIJERS D, LECHNER E, YAMADA M, HOBBIE L, EHRISMANN JS, JÜRGENS G, ESTELLE M. Plant development is regulated by a family of auxin receptor F box proteins. Dev Cell 2005; 9: [19] DINTER A, BERGER EG. Golgi disturbing agents. Histochem Cell Biol 1998; 109: [20] DONALDSON JG, FINAZZI D, KLAUSNER RD. Brefeldin A inhibits Golgi membrane-catalysed exchange of guanine nucleotide onto ARF protein. Nature 1992; 360: [21] DONALDSON JG, JACKSON CL. Regulators and effectors of the ARF GTPases. Curr Opin Cell Biol 2000; 12: [22] DRIOUICH A, ZHANG GF, STAEHELIN LA. Effect of brefeldin A on the structure of the Golgi apparatus and on the synthesis and secretion of proteins and polysaccharides in sycamore maple (Acer pseudoplatanus). Plant Physiol 1993; 101: [23] ENGQVIST-GOLDSTEIN AEY, DRUBIN DG. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol 2003; 19: [24] FRIML J. Auxin transport shaping the plant. Curr Opin Plant Biol 2003; 6: [25] FRIML J, VIETEN A, SAUER M, WEIJERS D, SCHWARZ H, HAMANN T, OFFRINGA R, JÜRGENS G. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature 2003; 426:

13 31 [26] GÄLWEILER L, GUAN C, MÜLLER A, WISMAN E, MENDGEN K, YEPHREMOV A, PALME K. Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 1998; 282: [27] GELDNER N. The plant endosomal system its structure and role in signal transduction and plant development. Planta 2004; 219: [28] GELDNER N, ANDERS N, WOLTERS H, KEICHER J, KOMBERGER W, MULLER P, DELBARRE A, UEDA T, NAKANO A, JÜRGENS G. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling auxin transport and auxin-dependent plant growth. Cell 2003; 112: [29] GELDNER N, FRIML J, STIERHOF Y-D, JÜRGENS G, PALME K. Auxin transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking. Nature 2001; 413: [30] GELDNER N, RICHTER S, VIETEN A, MARQUARDT S, TORRES-RUIZ RA, MAYER U, JÜRGENS G. Partial loss-of-function alleles reveal a role for GNOM in auxin transport-related, post-embryonic development of Arabidopsis. Development 2004; 131: [31] GOLDBERG J. Structural basis for activation of ARF GTPase: mechanisms of guanine nucleotide exchange and GTP-myristoyl switching. Cell 1998; 95: [32] GREBE M, XU J, MOBIUS W, UEDA T, NAKANO A, GEUZE HJ, ROOK MB, SCHERES B. Arabidopsis sterol endocytosis involves actin-mediated trafficking via ARA6-positive early endosomes. Curr Biol 2003; 13: [33] HADFI K, SPETH V, NAUHAUS G. Auxin-induced developmental patterns in Brassica juncea embryos. Development 1998; 125: [34] HANTON SL, BORTOLOTTI LE, RENNA L, STEFANO G, BRANDIZZI F. Crossing the divide transport between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus in plants. Traffic 2005; 6: [35] HAWES C, CROOKS K, COLEMAN J, SATIAT-JEUNEMAITRE B. Endocytosis in plants: fact or artifact? Plant Cell Environ 1995; 18: [36] HELMS JB, ROTHMAN JE. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature 1992; 360: [37] HENDERSON J, SATIAT-JEUNEMAITRE B, NAPIER R, HAWES C. Brefeldin A-induced disassembly of the Golgi apparatus is followed by disruption of the endoplasmic reticulum in plant cells. J Exp Bot 1994; 45: [38] HESS MW, MÜLLER M, DEBBAGE PL, VETTERLEIN M, PAVELKA M. Cryopreparation provides new insight into the effect of brefeldin A on the structure of the HepG2 Golgi apparatus. J Struct Biol 2000; 130: [39] JACKSON CL, CASANOVA JE. Turning on ARF: the Sec7 family of guanine-nucleotide-exchange factors. Trends Cell Biol 2000; 10: [40] JÜRGENS G. Membrane trafficking in plants. Annu Rev Cell Dev Biol 2004; 20: [41] JÜRGENS G, GELDNER N. Protein secretion in plants: from the trans-golgi network to the outer space. Traffic 2002; 3: [42] KEPINSKI S, LEYSER O. The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 2005; 435: [43] KLAUSNER RD, DONALDSON JG, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J. Brefeldin A: insights into the control of membrane traffic and organelle structure. J Cell Biol 1992; 116: [44] KREIS TE, LOWE M, PEPPERKOK R. COPs regulating membrane traffic. Annu Rev Cell Dev Biol 1995; 11: [45] LEYSER O. Auxin distribution and plant pattern formation: how many angles can dance on the point of PIN? Cell 2005; 121: [46] MAYER U, BÜTTNER G, JÜRGENS G. Apical-basal pattern formation in the Arabidopsis embryo: Studies on the role of the gnom gene. Development 1993; 117: [47] MECKEL T, HURST AC, THIEL G, HOMANN U. Endocytosis against high turgor: intact guard cells of Vicia faba constitutively endocytose fluorescently labelled plasma membrane and GFP-tagged K + -channel KAT1. Plant J 2004; 39: [48] MEINKE DW. Embryo-lethal mutants of Arabidopsis thaliana: Analysis of mutants with a wide range of lethal phenotypes. Theor Appl Genet 1985; 69: [49] MOSSESSOVA E, GULBIS JM, GOLDBERG J. Structure of the guanine nucleotide exchange factor Sec7 domain of human arno and analysis of the interaction with ARF GTPase. Cell 1998; 92:

14 32 P. M YNKOWIAK, P. WOJTASZEK [50] MUDAY GK, PEER WA, MURPHY AS. Vesicular cycling mechanisms that control auxin transport polarity. Trends Plant Sci 2003; 8: [51] NEBENFÜHR A. Vesicle traffic in the endomembrane system: a tale of COPs, Rabs and SNAREs. Curr Opin Plant Biol 2002; 5: [52] NEBENFÜHR A, STAEHELIN LA. Mobile factories: Golgi dynamics in plant cells. Trends Plant Sci 2001; 6: [53] NEBENFÜHR A, RITZENTHALER C, ROBINSON DG. Brefeldin A: deciphering an enigmatic inhibitor of secretion. Plant Physiol 2002; 130: [54] PACIOREK T, ZAŽIMALOVÁ E, RUTHARDT N, PETRÁŠEK J, STIERHOF Y-D, KLEINE-VEHN J, MORRIS DA, EMANS N, JÜRGENS G, GELDNER N, FRIML J. Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells. Nature 2005; 435: [55] PAPONOV IA, TEALE WD, TREBAR M, BLILOU I, PALME K. The PIN auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives. Trends Plant Sci 2005; 10: [56] PAVELKA M, ROBINSON DG. The Golgi apparatus in mammalian and higher plant cells: a comparison. [w] Robinson DG [red.] The Golgi apparatus and the plant secretory pathway. Oxford: Blackwell Publishing Ltd. 2003: [57] PETERS WS, HAGEMANN W, TOMOS DA. What makes plants different? Principles of extracellular matrix function in soft plant tissues. Comp Biochem Physiol Part A 2000; 125: [58] PEYROCHE A, ANNTONY B, ROBINEAU S, ACKER J, CHERFILS J, JACKSON CL. Brefeldin A acts to stabilize an abortive ARF-GDP-Sec7 domain protein complex: involvement of specific residues of the Sec7 domain. Mol Cell 1999; 3: [59] PIMPL P, HANTON SL, TAYLOR JP, PINTO-DA SILVA LL, DENECKE J. The GTPase ARF1 controls the sequence-specific vacuolar sorting route to the lytic vacuole. Plant Cell 2003; 15: [60] QUALMANN B, KESSELS MM, KELLY RB. Molecular links between endocytosis and the actin cytoskeleton. J Cell Biol 2000; 150: F111 F116. [61] RENAULT L, GUIBERT B, CHERFILS J. Structural snapshots of the mechanism and inhibition of a guanine nucleotide exchange factor. Nature 2003; 426: [62] RITZENTHALER C, NEBENFÜHR A, MOVAFEGHI A, STUSSI-GARAUD C, BEHNIA L, PIMPL P, STAEHELIN LA, ROBINSON DG. Reevaluation of the effects of Brefeldin A on plant cells using tobacco Bright Yellow 2 cells expressing Golgi-targeted green fluorescent protein and COPI antisera. Plant Cell 2002; 14: [63] ROBINSON DG, RITZENTHALER C. Perturbation of ER-Golgi vesicle trafficking. [w] Robinson DG [red.] The Golgi apparatus and the plant secretory pathway. Oxford: Blackwell Publishing Ltd. 2003: [64] ROSZEK K, GNIOT-SZUL YCKA J. Wielorakie formy pêcherzyków op³aszczonych klatryn¹ w zale nym od receptorów transporcie i segregacji makromoleku³. Post Biol Kom 2001; 27: [65] ROSZEK K, GNIOT-SZUL YCKA J. Transport makromoleku³ pomiêdzy siateczk¹ œródplazmatyczn¹ a aparatem Golgiego. Rola pêcherzyków COPI i COPII oraz przedzia³u poœredniego. Post Biol Kom 2001; 28: [66] ŠAMAJ J, BALUŠKA F, VOIGT B, SCHLICHT M, VOLKMANN D, MENZEL D. Endocytosis, actin cytoskeleton, and signaling. Plant Physiol 2004; 135: [67] SATIAT-JEUNEMAITRE B, COLE L, BOURET T, HOWARD R, HAWES C. Brefeldin A effects in plant and fungal cells: something new about vesicle trafficking? J Microsc 1996; 181: [68] SAINT-JORE CM, EVINS J, BATOKO H, BRANDIZZI F, MOORE I, HAWES C. Redistribution of membrane proteins between the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum in plants is reversible and not dependent on cytoskeletal networks. Plant J 2002; 29: [69] SCIAKY N, PRESLEY J, SMITH C, ZAAL KJM, COLE N, MOREIRA JE, TERASAKI M, SIGGIA E, LIPPINCOTT-SCHWARTZ J. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol 1997; 139: [70] SHEVELL DE, LEU WM, GILLMOR CS, XIA G, FELDMANN KA, CHUA N-H. EMB30 is essential for normal cell division, cell expansion, and cell adhesion in Arabidopsis and encodes a protein that has similarity to Sec7. Cell 1994; 77: [71] SHINOTSUKA C, YOSHIDA Y, KAWAMOTO K, TAKASTU H, NAKAYAMA K. Overexpression of an ADP-ribosylation factor guanine nucleotide exchange factor, BIG2, uncouples brefeldin A-induced adaptor protein-1 coat dissociation and membrane tubulation. J Biol Chem 2002; 277:

15 33 [72] STAEHELIN LA, DRIOUICH A. Brefeldin A effects in plants: Are different Golgi responses caused by different sites of action? Plant Physiol 1997; 114: [73] STEINMANN T, GELDNER N, GREBE M, MANGOLD S, JACKSON CL, PARIS S, GÄLWEILER L, PALME K, JÜRGENS G. Coordinated polar localization of auxin efflux carrier PIN1 by GNOM ARF GEF. Science 1999; 286: [74] SURPIN M, RAIKHEL N. Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: [75] WARD TH, BRANDIZZI F. Dynamics of proteins in Golgi membranes: comparisons between mammalian and plant cells highlighted by photobleaching techniques. Cell Mol Life Sci 2004; 61: [76] WIŒNIEWSKA J, TYBURSKI J, TRETYN A. Polarny transport auksyny prze³om w badaniach? Post Biol Kom 2004; 31: [77] WOJTASZEK P. Genes and plant cell walls: a difficult relationship. Biol Rev (Cambridge) 2000; 75: [78] WOJTASZEK P. Czym jest komórka roœlinna? Miejsce œcian komórkowych. Post Biol Kom 2000; 27: [79] YU Q, HLAVACKA A, MATOH T, VOLKMANN D, MENZEL D, GOLDBACH HE, BALUŠKA F. Shortterm boron deprivation inhibits endocytosis of cell wall pectins in meristematic cells of maize and wheat root apices. Plant Physiol 2002; 130: [80] ZHAO X, LASELL TK, MELANCON P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell 2002; 13: [81] ZHENG H, KUNST L, HAWES C, MOORE I. A GFP-based assay reveals a role for RHD3 in transport between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Plant J 2004; 37: [82] ZHU Y, TRAUB LM, KORNFELD S. ADP-ribosylation factor 1 transiently activates high-affinity adaptor protein complex AP-1 binding sites on Golgi membranes. Mol Biol Cell 1998; 9: Redaktor prowadz¹cy Maria Olszewska Otrzymano: r. Przyjêto: r. ul. Miêdzychodzka 5, Poznañ przemow@ibch.poznan.pl