Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoœci, Uniwersytet Przyrodniczy, Poznañ Analysis of physiological state of single bacterial cell using fluorescent staining methods Summary The paper reviews fluorescent staining techniques allowing to diagnose the physiological state of bacterial cells. Different staining probes and a manner of their use for analysis of cell viability, membrane potential, membrane integrity, intracellular ph, respiratory activity, amount of nucleic acids, and activity of chosen intracellular enzymes are described. Range of examples of fluorescent staining for monitoring of physiological state of bacteria in natural environment and in biotechnological processes are presented. Key words: fluorescent staining, bacteria, fluorescein, viability, internal ph, esterase, dehydrogenase, flow cytometry, membrane integrity, DNA staining. Adres do korespondencji Justyna Sadowska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoœci, Uniwersytet Przyrodniczy, ul. Wojska Polskiego 48, Poznañ; justynasad@gazeta.pl 4 (87) Wstêp W ostatnich latach nast¹pi³ intensywny wzrost zainteresowania szybkimi i precyzyjnymi technikami pozwalaj¹cymi na monitorowanie zmian morfologicznych i fizjologicznych komórek mikroorganizmów. Skracaj¹ one czas badañ i pozwalaj¹ na obróbkê komputerow¹ obrazów mikroskopowych. Wœród wielu ró - nych zastosowañ badawczych, techniki wybarwiania fluorescencyjnego s¹ wykorzystywane tak e do oceny funkcjonalnej mikroorganizmów bior¹cych udzia³ w procesach biotechnologicznych

2 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego prowadzonych w skali przemys³owej. W czasie prowadzenia procesu w du ej skali pojawiaj¹ siê czêsto czynniki stresowe, które zaburzaj¹ warunki hodowli i tym samym hamuj¹ wzrost komórek i ich prawid³owy metabolizm. Czêsto ju niewielkie zmiany w sk³adzie po ywki czy w warunkach fizykochemicznych procesu powoduj¹ zdecydowany spadek ywotnoœci stosowanych drobnoustrojów i zahamowanie g³ównych szlaków metabolicznych. W konsekwencji dochodzi do za³amania procesu produkcyjnego i powa nych strat ekonomicznych. Metodom monitorowania stanu fizjologicznego komórek jest poœwiêcona bogata literatura naukowa oraz wiele konferencji naukowych. Ogromny potencja³ maj¹ metody oparte na wybarwianiu komórek barwnikami fluorescencyjnymi. Wiêkszoœæ z nich pozwala na ocenê ywotnoœci i stanu fizjologicznego ca³ych populacji komórek, a czêœæ w pojedynczych komórkach. Tradycyjne techniki oceny prze ywalnoœci populacji mikroorganizmów wykorzystuj¹ g³ównie zdolnoœæ komórek do namna ania siê na powierzchni po ywek sta- ³ych, co wi¹ e siê z d³ugim czasem oczekiwania na pojawienie siê kolonii i zale ¹ od szybkoœci wzrostu drobnoustrojów, rodzaju zastosowanego pod³o a oraz warunków inkubacji (1). Ponadto liczenie komórek mo e byæ nieprecyzyjne lub wrêcz niemo liwe. Dotyczy to mikroorganizmów o silnych w³aœciwoœciach adhezyjnych tworz¹cych konglomeraty, co powoduje, e agregaty komórek mog¹ byæ przypadkowo liczone jako jedna jednostka tworz¹ca kolonie (CFU, ang. Colony Forming Unit). Tradycyjne metody nie nadaj¹ siê do liczenia komórek drobnoustrojów, których nie potrafimy hodowaæ w warunkach laboratoryjnych (VBNC, VNC, ang. Viable But Non-Cultivable). Czêœæ komórek mo e byæ tak e nieaktywnych, co prowadzi do b³êdnej interpretacji wyników (2,3). Tymczasem metody barwienia fluorescencyjnego umo liwiaj¹ diagnostykê wszystkich komórek bakteryjnych, ³¹cznie z tymi, które nie rosn¹, ale wykazuj¹ cechy ywych komórek, gdy utrzymuj¹ okreœlon¹ strukturê komórkow¹ i wykazuj¹ aktywnoœæ metaboliczn¹ (4). Zastosowanie barwienia komórek pozwala na ich badanie on-line. Dziêki szybkiej informacji jest mo liwa skuteczna interwencja w przebieg procesu biotechnologicznego. Barwniki fluorescencyjne zawieraj¹ g³ównie wielopierœcieniowe zwi¹zki aromatyczne, mog¹ce absorbowaæ falê o okreœlonej d³ugoœci, w szczególnoœci w zakresie promieniowania ultrafioletowego (wzbudzenie, absorbancja) oraz emitowaæ œwiat³o o mniejszej energii w zakresie widma widzialnego (emisja) (5). Energie emisji fluorochromów maj¹ ró n¹ wartoœæ i dlatego widoczne promieniowanie ma barwê od ciemnoczerwonej, po zielon¹ i niebiesk¹. Dziêki wysokiej selektywnoœci substancje te umo liwiaj¹ zbadanie wewn¹trz pojedynczej komórki takich parametrów, jak (4-6): potencja³ b³ony, integralnoœæ b³ony, aktywnoœæ oddechow¹, zawartoœæ enzymów wewn¹trzkomórkowych, zawartoœæ kwasów nukleinowych, BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

3 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek ph wewn¹trzkomórkowe, aktywnoœæ metaboliczn¹. Wyznaczenie tych parametrów w odpowiednio du ej liczbie komórek pozwala zdiagnozowaæ stan, w jakim znajduje siê dana populacja mikroorganizmów w czasie trwania procesu biotechnologicznego. Zaznaczyæ nale y, e za pomoc¹ jednego barwnika fluorescencyjnego mo na wyznaczyæ kilka z wymienionych parametrów. Przyk³adowo utrudniona przenikalnoœæ estrowych pochodnych fluoresceiny jest dobr¹ miar¹ integralnoœci b³on z jednej strony, a z drugiej, e obecnoœæ ugrupowania estrowego umo liwia oznaczenie enzymów oddechowych. Kolejnymi przyk³adami s¹ niektóre barwniki kwasów nukleinowych pozwalaj¹ce oceniæ zarówno integralnoœæ b³on komórkowych, jak i aktywnoœæ oddechow¹. Celem przegl¹du literaturowego jest przedstawienie stanu wiedzy na temat zastosowania barwienia fluorescencyjnego w ocenie ywotnoœci i aktywnoœci fizjologicznej pojedynczych komórek bakteryjnych i w konsekwencji stanu danej populacji mikroorganizmów. 2. Barwniki fluorescencyjne stosowane do oceny integralnoœci b³on komórkowych Pierwsz¹ powierzchni¹ kontaktu komórki bakteryjnej ze œrodowiskiem zewnêtrznym (z wyj¹tkiem Mycoplasmatales) jest le ¹ca na zewn¹trz od b³ony komórkowej sztywna œciana komórkowa, pe³ni¹ca funkcje ochronne protoplastu przed liz¹ osmotyczn¹ i uszkodzeniami. U wielu bakterii, w tym archebakterii, licznych bakterii gramujemnych (Caulobacter crescentus, Aquaspirillum serpent, Aeromonas salmonicida) i niektórych eubakterii gramdodatnich (np. Corynebacterium, Bacillus) poza œcian¹ komórkow¹ i b³on¹ komórkow¹ wystêpuje dodatkowa warstwa S, zbudowana zwykle z charakterystycznego dla danej bakterii bia³ka (1,7,8). Jedn¹ z g³ównych funkcji b³on biologicznych jest transport sk³adników od ywczych oraz wydalanie wytwarzanych metabolitów. Zachwianie p³ynnoœci b³on w komórce bakteryjnej (w szczególnoœci b³ony komórkowej) wi¹ e siê z powa nymi uszkodzeniami komórki, takimi jak utrata selektywnej przepuszczalnoœci, zahamowany transport czy aktywnoœæ oddechowa, co bardzo czêsto doprowadza do jej œmierci (4). U podstawy analizy integralnoœci membranowej le y zdolnoœæ barwników fluorescencyjnych do przenikania przez os³ony do wnêtrza komórki i wybarwiania w³aœciwych dla siebie struktur. Metody pozwalaj¹ce oznaczyæ integralnoœæ b³ony opieraj¹ siê na z³o onych mechanizmach wnikania zwi¹zków barwi¹cych do wnêtrza komórki, zatrzymania ich w komórce, b¹dÿ wydalenia ich poza komórkê bakterii (6). Ze wzglêdu na wysokie stê enie DNA w komórce bakteryjnej, do wiêkszoœci oznaczeñ p³ynnoœci b³on stosuje siê barwniki kwasów nukleinowych. Barwniki DNA, takie jak jodek propidyny (PI, ang. Propidium Iodide), bromek etydyny (EB, ang. Ethidium Bromide), 104 PRACE PRZEGL DOWE

4 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego PO- PRO- 3 oraz SYTOX Green, wybarwiaj¹ komórki charakteryzuj¹ce siê uszkodzeniami w strukturze dwuwarstwowej b³ony fosfolipidowej, wybarwiaj¹c kwasy nukleinowe na charakterystyczny dla siebie, zale ny od d³ugoœci fali, kolor (5,6). Do najczêœciej u ywanych barwników fluorescencyjnych nale ¹ jodek propidyny i bromek etydyny. Charakteryzuj¹ siê one podobn¹ budow¹ chemiczn¹, zdolnoœci¹ do barwienia uszkodzonych komórek na kolor czerwony oraz brakiem mo liwoœci wybarwienia komórek ywych, prowadz¹cych niezachwiany metabolizm. W nienaruszonych mikroorganizmach zostaj¹ one wydalone z wnêtrza komórki jeszcze przed po³¹czeniem z cz¹steczkami kwasów nukleinowych (5). W bie ¹cej literaturze naukowej mo na znaleÿæ bardzo wiele publikacji, w których autorzy donosz¹ o stosowaniu jodku propidyny jako barwnika pozwalaj¹cego oznaczyæ p³ynnoœæ b³on drobnoustrojów lub/i ywotnoœæ ca³ej populacji bakterii. Znalaz³ on zastosowanie m.in. w badaniach nad prze ywalnoœci¹ bakterii Lactobacillus rhamnosus hodowanych w warunkach podwy szonego ciœnienia, oraz poddanych stresowi osmotycznemu (9,10), w oznaczaniu prze ywalnoœci bakterii mlekowych po mro eniu i w trakcie przechowywania (11), podczas kontroli mikrobiologicznej win (12), w badaniach wp³ywu stresu oksydacyjnego na bakterie Ralstonia metallidurans, Escherichia coli, Shewanella oneidensis i Deinococcus radiodurans (13), w barwieniu komórek Trichomonas vaginalis, Pasteurella piscicida w wodzie rzecznej (14,15), rozró - nieniu komórek ywych od komórek martwych Escherichia coli, Bacillus subtilis i Pseudomonas sp. (16) oraz barwieniu komórek bakterii Lactococcus lactis hodowanych w warunkach stresowych (17). Niektórzy autorzy podwa aj¹ jednak dok³adnoœæ metod wybarwiania fluorescencyjnego opartego na przepuszczalnoœci b³on jako wskaÿnika prze ywalnoœci i ywotnoœci bakterii. Dowiedziono, e pomimo œmierci spowodowanej wysok¹ temperatur¹, komórki bakterii Escherichia coli nie akumulowa³y jodku propidyny (18). Niven i Mulholland (19) wykazali, e du a populacja niezdolnych do ycia komórek Lactococcus lactis nie barwi³a siê jodkiem propidyny. Podobne zjawisko obserwowali Bunthof i in. (17), którzy wykazali, e 69% komórek Lactococcus lactis inkubowanych w temperaturze 60 C przez 90 sekund nie wybarwi³o siê po dodaniu barwnika, pomimo e utraci³y zdolnoœæ do wzrostu na powierzchni p³ytki. Ograniczone mo liwoœci zastosowania PI wynikaj¹ z niskiego wspó³czynnika ekstynkcji i stosunkowo niskiej fluorescencji tej sondy. Nowe barwniki DNA, takie jak SYTOX-Green, charakteryzuj¹cy siê wysok¹ fluorescencj¹ po przy³¹czeniu do cz¹steczki kwasu nukleinowego, mog¹ stanowiæ alternatywne rozwi¹zanie (20). Barwnik ten znalaz³ zastosowanie w ocenie ywotnoœci wielu gatunków bakterii m. in. Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas spp. i Salmonella typhimurium (21-23). W celu jednoczesnej identyfikacji ywych i martwych komórek firma Molecular Probes stworzy³a zestaw barwników Live/Dead BacLight zawieraj¹cy dwa barwniki PI oraz SYTO 9, reaguj¹ce z kwasami nukleinowymi, lecz ró ni¹ce siê zdolnoœci¹ do przenikania przez nieuszkodzone b³ony bakteryjne. Równoczesne zastosowanie obu barwników oraz systemu komputerowej analizy obrazu umo liwia wizualne rozró - BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

5 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek nienie komórek ywych od komórek martwych (5). Barwnik SYTO 9 znaczy komórki bakterii gramujemnych i gramdodatnich niezale nie od kondycji, w jakiej znajduj¹ siê ich b³ony komórkowe, tworz¹c barwne kompleksy koloru zielonego, podczas gdy jodek propidyny wnika wy³¹cznie do bakterii z uszkodzonymi b³onami i barwi je na kolor czerwony. Wed³ug producenta barwnik SYTO-9 powinien przenikaæ przez b³ony bakterii i byæ zatrzymywany wewn¹trz komórek jednak e Langsrud i Sundheim (24) wykazali, e 30% testowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa nie zatrzymuje barwnika. Aby przezwyciê yæ ten problem, rozpoczêto równoczesne stosowanie PI wraz z innymi barwnikami przenikaj¹cymi przez b³ony np. SYTO-13 (25,26). Dla oszacowania liczby komórek bakteryjnych w œrodowisku wodnym, wielu autorów wykorzystywa³o zestaw Live/Dead Bac Light w po³¹czeniu z mikroskopi¹ fluorescencyjn¹ i komputerow¹ analiz¹ obrazu lub cytometri¹ przep³ywow¹ (25,27, 28). Jednak e po zastosowaniu wymienionego zestawu barwników pewna czêœæ komórek bakteryjnych wykazywa³a kolor poœredni pomiêdzy zielon¹ a czerwon¹ fluorescencj¹. Aby uzyskaæ lepsze rozró nienie barw Gasol i in. (29) zastosowali metodê polegaj¹c¹ na przep³ukaniu filtra z wybarwionymi bakteriami alkoholem izopropylowym, uzyskuj¹c tym samym wiêksze zró nicowanie barw. 3. Barwniki wybarwiaj¹ce kwasy nukleinowe Wykrywanie uszkodzeñ w ³añcuchach kwasów nukleinowych z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych jest czêsto stosowane przy charakterystyce apoptozy komórek eukariotycznych (4). Zastosowanie tych metod w komórkach bakteryjnych w celu oznaczenia ywotnoœci mikroorganizmów mo e wydawaæ siê niew³aœciwe ze wzglêdu na utrzymywanie siê nieuszkodzonej cz¹steczki DNA jeszcze przez pewien czas po œmierci komórek. Ponadto u mikroorganizmów hodowanych w warunkach stresowych mog¹ wystêpowaæ zmiany w topologii cz¹steczki DNA, charakterystyczne dla komórek martwych (30,31). Mimo to, wielu autorów wskazuje na du ¹ przydatnoœæ barwników kwasów nukleinowych jako narzêdzi pozwalaj¹cych na oznaczanie prze ywalnoœci komórek bakteryjnych (5,6,32). Aktualnie oferowanych jest komercyjnie wiele barwników fluorescencyjnych reaguj¹cych z kwasami nukleinowymi, jednak tylko nieliczne wi¹ ¹ siê specyficznie tylko z DNA, a wiêkszoœæ z nich jest wra liwa na sk³ad chemiczny zasad (stosunek A-T/G-C). Barwniki, takie jak DAPI i Hoechst nr i 33342, wykazuj¹ w przybli eniu stukrotnie wy sz¹, jasnoniebiesk¹ fluorescencjê po zwi¹zaniu siê z tripletami A-T w cz¹steczce DNA. Chromomycyna A3 i podobna do niej mitramycyna wykazuj¹ podwy szon¹ fluorescencjê po przy³¹czeniu siê do sekwencji bogatych w pary G-C. Oba barwniki s¹ pobudzane przez promieniowanie fioletowe i niebieskofioletowe, zaœ emituj¹ œwiat³o koloru zielonego. Kombinacja barwników Chromomycyny A oraz Hoechst znalaz³a zastosowanie w diagnostyce sk³adu chemicznego ró PRACE PRZEGL DOWE

6 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego nych szczepów bakterii Bacillus cereus, Enterococcus faecalis i Staphylococcus aureus poddanych dzia³aniu czynników stresowych (33). Barwniki, takie jak bromek etydyny i jodek propidyny, tworz¹ barwne kompleksy z dwuniciowym DNA, b¹dÿ RNA. Takie same w³aœciwoœci ma du a grupa asymetrycznych cyjanobarwników kwasów nukleinowych (serie TO-PRO-, TOTO- i SYTO) oraz Pico Green oferowanych przez Molecular Probes. Barwniki te znalaz³y zastosowanie w oznaczaniu ca³kowitej liczby kwasów nukleinowych w Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida KT2442, w czynnych biologicznie mikroorganizmach œciekowych oraz w badaniach nad jakoœci¹ mikrobiologiczn¹ mleka (34-37). Zgodnie z wytycznymi producenta wykorzystanie tych barwników do oznaczenia wy³¹cznie DNA wymaga wczeœniejszego u ycia RNAzy. Ze wzglêdu na fakt, e bakterie prowadz¹ce niezak³ócony metabolizm w swoim sk³adzie chemicznym maj¹ oko³o piêæ razy wiêcej podwójnoniciowego rrna ni DNA, zastosowanie tych metod jest wci¹ problematyczne (38). Inn¹ technik¹ pozwalaj¹c¹ wybarwiæ i oznaczyæ dwuniciowy rybosomowy RNA jest zastosowanie preparatu pironiny. Kombinacja tego barwnika z DAPI lub Hoechst umo liwia jednoczesne obserwowanie obu kwasów nukleinowych, pod warunkiem zastosowania podwójnego filtra (38). Selektywnym barwnikiem fluorescencyjnym tworz¹cym barwne kompleksy koloru zielonego po przy³¹czeniu do DNA i czerwonego po przy³¹czeniu do RNA jest oran akrydyny. Intensywnoœæ jego zabarwienia zale y od koncentracji kwasów nukleinowych. Ten barwnik kationowy przy³¹cza siê do cz¹steczki DNA w formie monomeru, zaœ z cz¹steczkami RNA tworzy kompleks z³o ony z polimerów barwnika oraz RNA. Znalaz³ on zastosowanie w badaniach nad bakteriami Escherichia coli, Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum oraz Clostridium perfringens (5,39,40). Jednym z barwników kwasów nukleinowych stosowanych do okreœlania prze ywalnoœci mikroorganizmów lub oznaczenia liczby DNA jest DAPI. Zmiany wartoœci fluorescencji po wybarwieniu komórek przez DAPI zosta³y u yte do oceny wydajnoœci dezynfekcji wody pitnej podchlorynem sodu. Barwnik ten znalaz³ zastosowanie w ocenie prze ywalnoœci bakterii Helicobacter pylori podczas przechowywania w œrodowisku wodnym (41) i w badaniach wp³ywu zwiêkszonego ciœnienia atmosferycznego i temperatury na szybkoœæ wzrostu Lactococcus lactis i Lactobacillus sanfranciscensis (42). Nale y jednak odnotowaæ, e zastosowanie tego barwnika nie zawsze pozwala na wykrycie wszystkich martwych komórek (43). 4. Barwniki pozwalaj¹ce okreœliæ potencja³ b³onowy Podczas procesów oddychania i hydrolizy ATP zostaje wytworzony elektrochemiczny potencja³ b³on komórkowych. Dziêki wybiórczej przepuszczalnoœci b³on dla jonów wodoru, sodu, potasu i chloru tworzy siê gradient ³adunków (³adunek wewn¹trz komórki ma ujemn¹ wartoœæ, zaœ po zewnêtrznej stronie b³ony war- BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

7 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek toœæ dodatni¹) bior¹cy udzia³ w podstawowych procesach metabolizmu komórkowego, jak synteza ATP, transport aktywny, regulacja wewn¹trzkomórkowego ph i inne (4). Do pomiaru potencja³u b³onowego stosuje siê barwniki fluorescencyjne, które w zale noœci od swojego ³adunku gromadz¹ siê po spolaryzowanej (barwniki kationowe) lub po depolaryzowanej stronie (barwniki anionowe) b³on. Do barwników kationowych zaliczamy m.in. rodaminê i karbocyjany, takie jak: DiOC6(3), DiOC2(3) czy DiSC3(5). Wœród barwników anionowych wymieniæ nale y DiBAC4(3) (5). Jednym z czêœciej stosowanych barwników pozwalaj¹cych okreœliæ potencja³ b³onowy u bakterii jest Rodamina 123 charakteryzuj¹ca siê zielon¹ fluorescencj¹. Pierwsze doniesienia dotycz¹ce stosowania rodaminy jako lipofilnego barwnika kationowego u bakterii datowane s¹ na rok 1984 (44). Stosowanie rodaminy do oznaczania potencja³u b³onowego bakterii gramujemnych wymaga kilkukrotnego przemywania prób oraz obróbki wstêpnej mikroorganizmu, zazwyczaj przez dodatek EDTA, w celu zwiêkszenia przepuszczalnoœci b³ony zewnêtrznej. Ponadto warunki hodowli, np. zasolenie po ywki, bezpoœrednio wp³ywaj¹ na etap obróbki wstêpnej (45). Mimo to Kaprelyants i Kell (46) zastosowali rodaminê do podzia³u populacji Micrococcus luteus na komórki ywe, martwe i ywe, lecz nie daj¹ce siê hodowaæ. McFeters i in. (47) wykorzystali ten barwnik do oceny w³aœciwoœci fizjologicznych bakterii tworz¹cych biofilmy (47-49), zaœ Pacheco i in. (50) zastosowali rodaminê do badania ywotnoœci mikroorganizmów biodegraduj¹cych 4-chlorofenol. Innymi kationowymi barwnikami fluorescencyjnymi, u ywanymi do oznaczania potencja³u b³on, s¹ karboksycyjany, np. DiOC6(3), których stosowanie nie wymaga obróbki wstêpnej próbek. Diaper i in. (45) donosz¹ o niespecyficznym wi¹zaniu siê karbocyjanów do regionów hydrofobowych w komórce, co przek³ada siê na fa³szywie pozytywne wartoœci fluorescencji wewn¹trz komórki. Potencja³ b³onowy w komórce bakteryjnej mo e zostaæ zdefiniowany za pomoc¹ anionowych oksonoli gromadz¹cych siê wewn¹trz komórki w rejonach bogatych w zwi¹zki lipidowe. Koniugacji tej sprzyja niska wartoœæ napiêcia b³onowego, lub jego chwilowe zani enie, pozwalaj¹ca cz¹steczkom barwnika przenikn¹æ barierê b³onow¹ (5). Przyk³adowym barwnikiem anionowym jest DiBAC4(3), który znalaz³ zastosowanie w diagnostyce potencja³u b³onowego u takich bakterii jak Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus licheniformis CCMI 1034 (51) i Bifidobacterium animalis (18,52-55), jak równie u licznych mikroorganizmów termofilnych (56). W ostatnich latach wzros³o zainteresowanie barwnikami fluorescencyjnymi pozwalaj¹cymi oznaczyæ potencja³ b³onowy, pomimo e oznaczenia te s¹ czêsto obarczone b³êdami wynikaj¹cymi z etapu obróbki wstêpnej (38). 108 PRACE PRZEGL DOWE

8 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego 5. Barwniki stosowane do oznaczania aktywnoœci wybranych enzymów 5.1. Aktywnoœæ dehydrogenaz W badaniach aktywnoœci oddechowej wewn¹trz komórki bakteryjnej wykorzystuje siê sole tetrazolinowe bêd¹ce akceptorami elektronów. W konsekwencji dzia- ³alnoœci dehydrogenaz zwi¹zanych z oddychaniem komórkowym, barwniki tetrazolinowe zostaj¹ zredukowane z bezbarwnych kompleksów do jasno œwiec¹cych zwi¹zków formazanu. Dziêki temu redukcja soli tetrazolinowych oraz iloœæ nierozpuszczalnych form formazanu jest bezpoœrednim wskaÿnikiem aktywnoœci systemu transportu elektronów u mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych (57,58). Jednym z bardziej znanych barwników fluorescencyjnych, pozwalaj¹cym oznaczyæ enzymatyczn¹ aktywnoœæ dehydrogenazy, jest chlorek 5-cyjano-2,3 ditolylotetrazolowy (CTC), który w komórkach bakteryjnych jest przekszta³cany do zwi¹zków œwiec¹cych na czerwono (CTF). Ogólnie rzecz bior¹c komórki, w których nie zachodzi proces redukcji CTC do CTF, s¹ uwa ane za komórki martwe. CTC znalaz³ liczne zastosowania w okreœlaniu liczby oddychaj¹cych bakterii z rodzaju Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes i Pseudomonas fluorescens w czystych kulturach (59,60), w drobnoustrojach yj¹cych w œrodowisku wodnym (61-63), w glebie (64) oraz w produktach spo ywczych (65). Procedura redukcji soli tetrazolowych polega na inkubacji komórek bakteryjnych (od 20 min do kilku godzin) w obecnoœci barwnika fluorescencyjnego oraz formaldehydu, paraformaldehydu lub formaliny, a nastêpnie szybkiego wykonania pomiaru z zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego lub cytometru przep³ywowego, ze wzglêdu na zanikanie sygna³u fluorescencyjnego (66). Istnieje mo liwoœæ redukcji zwi¹zków formazanu poprzez zastosowanie glukozy, b¹dÿ poœrednich transporterów elektronów, takich jak siarczan fenazyny (67,68), b¹dÿ aktywacji tego zwi¹zku przez pozakomórkowy fosforan nieorganiczny (68). Niektóre zwi¹zki formazanu mog¹ wydostawaæ siê z wnêtrza komórek bakteryjnych tworz¹c fosforyzuj¹ce osady pozakomórkowe. Zastosowanie jonów kobaltu tworz¹cych kompleksy z pozakomórkowymi osadami umo liwia wyt³umienie b³êdnego sygna³u (69). Stosowanie CTC ma toksyczny wp³yw na bakterie pochodz¹ce z próbek wody pitnej, co doprowadza do b³êdnego oznaczenia ca³kowitej liczby komórek ywych (57,62,70,71) Aktywnoœæ esteraz Dioctan fluoresceiny (FDA), nie wykazuj¹cy w³asnej fluorescencji, jest zatrzymywany wewn¹trz komórek ssaczych i za pomoc¹ esteraz wewn¹trzkomórkowych jest przekszta³cany we fluoresceinê (72). Enzymatyczna aktywnoœæ esteraz jest mierzona BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

9 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek za pomoc¹ lipofilnych, nie na³adowanych i nie wykazuj¹cych fluorescencji substratów, które wewn¹trz aktywnych, nieuszkodzonych komórek ulegaj¹ przekszta³ceniu do polarnych, fluorescencyjnych produktów, w tym g³ównie do fluoresceiny i jej pochodnych. Esterazy wystêpuj¹ we wszystkich ywych organizmach i mog¹ dostarczyæ informacji o stanie metabolicznym komórki. Jednak e martwe komórki lub komórki z uszkodzonymi b³onami po wybarwieniu bardzo szybko pozbywaj¹ siê barwnika, mimo e wystêpuje w nich szcz¹tkowa aktywnoœæ esteraz. W konsekwencji fluorogeniczne substraty esterazowe czêsto znajduj¹ zastosowanie zarówno w ocenie aktywnoœci enzymatycznej, charakterystyce integralnoœci b³onowej, jaki iwpomiarach ywotnoœci mikroorganizmów (73). Poœród substratów pozwalaj¹cych oznaczyæ enzymatyczn¹ aktywnoœæ esteraz najs³absz¹ fluorescencjê wykazuje FDA, co jest spowodowane s³ab¹ retencj¹ zwi¹zku wewn¹trz komórki (74,75). W przeciwieñstwie do FDA pochodne tego zwi¹zku s¹ przekszta³cane w hydrofilne, mocno fluoryzuj¹ce, silnie zwi¹zane wewn¹trz komórek produkty (76). FDA znalaz³ zastosowanie w oznaczaniu aktywnoœci esterazowej w poddanych dzia³aniu antybiotyków bakteriach Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Psedomonas aeruginosa (76). Inn¹, czêsto stosowan¹ substancj¹ pozwalaj¹ca oznaczyæ aktywnoœæ enzymów wewn¹trzkomórkowych jest CFDA-AM. Pomimo doniesieñ o zmniejszonej rozpuszczalnoœci tego zwi¹zku zosta³ on wykorzystany w badaniach nad Staphylococcus aureus (77). W badaniach porównawczych oznaczania aktywnoœci esteraz wykazano, e najwiêksz¹ skutecznoœci¹ odznacza siê dioctan karboskyfluoresceiny (CFDA) (78). W porównaniu z tym zwi¹zkiem, FDA i CFDA-AM wypad³y o wiele s³abiej, gdy zastosowanie FDA wymaga³o uwzglêdnienia niekontrolowanego wycieku barwnika z komórek, zaœ u ycie CFDA-AM by³o ograniczone jego s³ab¹ rozpuszczalnoœci¹. CFDA znalaz³ zastosowanie w oznaczaniu enzymatycznie aktywnych komórek Klebsiella pneumoniae (75) oraz do oznaczania bakterii w oczyszczonej wodzie stosowanej w przemyœle farmaceutycznym (79). Równoczesne wykorzystanie PI oraz CFDA pozwala na efektywne rozró nienie komórek ywych od komórek martwych, co dowiedziono w badaniach nad Lactococcus lactis (80), oraz w doœwiadczeniach nad bakteriami Escherichia coli O157:H7 (81). Diapir i Edwards (75) prowadzili badania nad równoczesnym barwieniem kilku gatunków bakterii. Dowiedli oni, e ChemChrome B (produkt komercyjny o nieznanej formule) w porównaniu do FDA, CFDA i BCECF-AM, wybarwia najwiêksz¹ liczbê gatunków bakterii zarówno gramdodatnich jak i gramujemnych. G³ówne ograniczenia w stosowaniu estrów fluorogennych wynikaj¹ z utrudnionego wnikania barwnika do komórki i z jego czynnym wydalaniem (17,73) oraz z problemów zwi¹zanych z barwieniem czystych kultur bakterii, takich jak Pseudomonas spp. (82). Wiêkszoœæ z tych ograniczeñ zosta³a prze³amana przez zestaw barwi¹cy ChemChrome V6, w sk³ad którego wchodz¹ barwniki redukuj¹ce niespecyficzn¹ fluorescencjê oraz bufor minimalizuj¹cy wyp³yw barwnika z komórki (83). 110 PRACE PRZEGL DOWE

10 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego Kolejnym estrem fluorogenicznym jest CFDA/SE. Ró ni siê on od CFDA obecnoœci¹ grupy estrowej, silnie wi¹ ¹c¹ siê do wolnych amin. Zwi¹zek ten znalaz³ zastosowanie w oznaczaniu ywotnoœci bakterii (84) oraz jest bardzo czêsto wykorzystywany jako indykator zmian ph wewn¹trz komórek bakteryjnych (85-87). Hoefl i in. (73) prowadzili badania porównawcze nad zastosowaniem CFDA oraz CFDA/SE jako substancji pozwalaj¹cych oznaczyæ ywotnoœæ mikroorganizmów z gatunków Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oraz Staphylococcus epidermidis. Udowodnili oni, e wiêkszym b³êdem obarczone s¹ badania z zastosowaniem CFDA/SE, co zwi¹zane jest z niekontrolowanym wyp³ywem barwnika z nienaruszonych komórek. Podobny wyciek barwnika CFDA z komórek zaobserwowano w badaniach nad bakteriami gramujemnymi Pseudomonas aeruginosa PAO1, Escherichia coli K12 W3110 oraz gramdodatnimi Bacillus subtilis IAM 1069 i Staphylococcus aureus IAM1011. Udowodniono, e zastosowanie aldehydu glutarowego o stê eniu 1g/l przeciwdzia³a ucieczce barwnika z wnêtrza bakterii niezale - nie od budowy œcian komórkowych (88). Czêœæ zwi¹zków pozwalaj¹cych oznaczyæ enzymatyczn¹ aktywnoœæ esteraz w komórkach jest wykorzystywana do oznaczeñ wewn¹trzkomórkowego ph (85-97). 6. Barwniki pozwalaj¹ce oznaczyæ ph wewn¹trzkomórkowe Zakres ph œrodowiska, w którym bakterie mog¹ funkcjonowaæ, nie jest identyczny dla wszystkich gatunków. Wiêkszoœæ bakterii rozwija siê najlepiej na pod³o ach obojêtnych lub s³abo alkalicznych. Mikroorganizmy, zwane bakteriami kwasolubnymi, preferuj¹ pod³o e o odczynie kwaœnym. Do nich nale ¹ m.in. bakterie fermentacji octowej i mlekowej oraz prawie wszystkie drobnoustroje z rodzaju Thiobacillus i Sulfolobus mog¹ce rozwijaæ siê nawet przy ph 0,8 (1). Bakterie z gatunków Bacillus circulans czy Natronobacterium gregoryi nale ¹ do grupy mikroorganizmów zasadolubnych (alkalofili). Wszystkie wymienione grupy drobnoustrojów, niezale nie od ich preferencji w stosunku do ph po ywki, utrzymuj¹ ph wewn¹trzkomórkowe w granicach od 6,5 do 9,5 (89). W standardowych warunkach wzrostu dla bakterii acidofilnych i preferuj¹cych obojêtne œrodowisko, ph wewn¹trzkomórkowe jest z regu³y wy sze ni ph œrodowiska zewnêtrznego. Wytwarzaj¹cy siê gradient ph mo e byæ wykorzystany jako si³a motoryczna dla procesów wymagaj¹cych dostarczenia energii, takich jak asymilacja aminokwasów i cukrów, rotacja wici czy synteza ATP. Wiêkszoœæ barwników pozwalaj¹cych oznaczyæ ph wewn¹trzkomórkowe bazuje na zwi¹zkach fluoresceiny, np. karboksyfluoresceina (cf), BCECF czy CFDA-SE. Wielu autorów sugeruje, e zmiana ph wewn¹trzkomórkowego mikroorganizmów mo e byæ wskaÿnikiem stanu fizjologicznego komórki (85-87). Przyk³adowo wykazano, e stres osmotyczny wywiera bezpoœredni wp³yw na poziom wewn¹trzkomórkowego ph bakterii Listeria monocytogenes i mo e byæ wyznacznikiem ich ywotnoœci (85). BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

11 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek Podobne badania nad ywotnoœci¹ bakterii Lactobacillus delbrueckii hodowanych w warunkach stresowych prowadzili Rechinger i Siegumfeldt (87). Oznaczali oni ywotnoœæ organizmów za pomoc¹ mikroskopii fluorescencyjnej z zastosowaniem CFDA-SE oraz standardowej metody p³ytkowej. Na podstawie uzyskanych wyników autorzy wykazali korelacjê miêdzy wartoœci¹ ph œrodowiska, wartoœæ ph wewn¹trzkomórkowego a zmianami ywotnoœci badanych drobnoustrojów. Podobn¹ metodykê doœwiadczeñ wykorzystali Hornbeak i in. (90) w badaniach nad ywotnoœci¹ i stanem fizjologicznym bakterii Bacillus licheniformis, szeroko rozpowszechnionych w przemyœle enzymatycznym. Wskazali oni, e po³¹czenie mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przep³ywowej z zastosowaniem CFDA-SE i barwnika pozwalaj¹cego oznaczyæ ph wewn¹trzkomórkowe umo liwia diagnozê stanu fizjologicznego, w jakim znajduj¹ siê pojedyncze komórki. 7. Podsumowanie W literaturze opisywanych jest wiele technik, których podstaw¹ s¹ barwniki fluorescencyjne pozwalaj¹ce zdiagnozowaæ stan fizjologiczny pojedynczych komórek. Zaletami ich stosowania s¹ szybkoœæ i precyzja pomiaru oraz mo liwoœæ badañ drobnoustrojów nie daj¹cych siê hodowaæ. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych razem z takimi narzêdziami badawczymi jak mikroskopia fluorescencyjna czy cytometria przep³ywowa dostarcza mikrobiologom wielu przydatnych informacji o stanie fizjologicznym, w jakim znajduj¹ siê komórki hodowane w ró nych œrodowiskach. Wielu autorów stosuje barwniki fluorescencyjne w oznaczaniu ywotnoœci komórek rozwijaj¹cych siê w ró nych po ywkach i w ró nych warunkach œrodowiskowych. Dotychczasowy stan wiedzy nie pozwala na jednoznaczne wytypowanie niezawodnego barwnika fluorescencyjnego pozwalaj¹cego oznaczyæ ywotnoœæ dowolnego mikroorganizmu. Wybór i metodyka zastosowania barwnika musi byæ œciœle dopasowana do badanego drobnoustroju i oceniona pod wzglêdem wydajnoœci barwieñ. Rozwój technik barwieñ wielokrotnych, u którego podstaw le y zastosowanie przynajmniej dwóch barwników oznaczaj¹cych ró ne markery ywotnoœci komórek umo liwia bardzo dok³adn¹ analizê, jednak wymaga rzetelnej walidacji metody. Literatura 1. Kunicki-Goldfinger W., (2005), ycie bakterii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 2. Dahm H., Strzelczyk E., (2004), Post.Mikrobiol.,43, Barer M. R., Harwood C. R., (1999), Adv. Microb. Physiol., 41, Shapiro H. M., (2000a), J. Microbiol. Methods., 42, Haugland R. P., (2001), Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 8 th Edition, Molecular Probes, Eugene, OR, USA. 6. Nebe-von-Caron G., Stephens P. J., Hewitt C. J., Powell J. R., Badley R. A., (2000), J. Microbiol. Methods., 42, PRACE PRZEGL DOWE

12 Analiza stanu fizjologicznego pojedynczych komórek bakterii za pomoc¹ barwienia fluorescencyjnego 7. Singleton P., (2000), Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 8. Schegel H. G., (2003), Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 9. Ananta E., Heinz V., Knorr D., (2004), Food Microbiol., 21, Sunny-Roberts E. O., Knorr D., (2008), Food Microbiol., 23, Rault A., Beal C., Ghorbal S., Ogier J., Bouix M., (2007), Cryobiology, 55, Kopke C., Cristavao A., Prata A. M., Silva Periera C., Figueiredo Marques J. J., San Romao M. V., (2000), Food Microbiol., 17., Baatout S., Boever P. de., Mergeay M., (2006), Appl. Biochem. Microbiol., 42, Magarinos B., Romalde J. L., Cid A., Toranzo A. E., (1997), Lett. Appl. Microbiol., 24, Yamaguchi N., Nasu M., (1997), J. Appl. Microbiol., 83, Williams S. C., Hong Y., Danavall D. C. A., Howard-Jones M. H., Gibson D., Frischer M. E., Verity P. G., (1998), J. Microbiol. Methods, 32, Bunthof C. J., van den Braak S., Breeuwer P., Rombouts F. M., Abee T., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, Jepras R. I., Carter J., Pearson S. C., Paul F. E., Wilkinson M. J., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, Niven G. W., Mulholland F., (1998), J. Appl. Microbiol., 84, Roth B. L., Poot M., Yue S. T., Millard P. J., (1997), Appl. Environ. Microbiol., 63, Klauth P., Wilhelm R., Klumpp E., Poschen L., Groeneweg J., (2004), J. Microbiol. Methods, 59, Suller M. T. E., Lloyd D., (1999), Cytometry, 35, Lebaron P., Catala P., Parthuisot N., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, Langsrud S., Sundheim G. J., (1996), Appl. Bacteriol., 81, Biggerstaff J. P., Puil M., Weidow B. L., Prater J., Glass K., Radosevich M., White D. C., (2006), Molec. Cell. Probes, 20, Comas J., Vives-Rego J., (1997), Cytometry, 29, Bonato B., Benedetti D., Canepari P., (2005), FEMS Microbiol. Ecol., 54, Wierzchos J., Sancho L. G., Ascaso C., (2004), FEMS Microbiol. Ecol., 50, Gasol J. M., Zweifel U. L., Peters F., Furhman J. A., Hagström A., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, Joux F., Lebaron P., Troussellier M., (1997a), Appl. Environ. Microbiol., 63, Joux F., Lebaron P., Troussellier M., (1997b) FEMS Microbiol. Ecol., 22, Li Y., Dick W. A., Tuovinen O. H., (2004), Biol. Fertil. Soils, 39, Steen H. B., Harald B., (2000), J. Microbiol. Methods, 42, Takenaka S., Iwaku M., Hoshino E., (2001), J. Infect. Chomother., 7, Ziglio G., Andreottola G., Barbesti S., Boschetti G., Bruni L., Foladori P., Villa R., (2002), Water Res., 36, Nancharaiah Y. V., Venugoplalan V. P., Wuertz S., Wilderer P. A., Hausner M., (2005), J. Microbiol. Methods, 60, Gunasekera T. S., Veal D. A., Attfield P. V., (2003), Int. J. Food Microbiol., 85, Shapiro H. M., (2000b), Methods, 21, Homem-de-Mello P., Mennucci B., Tomasi J., Silva A. B. F., (2007), Theor. Chem. Acc., 118, Kumar S., Mittal G. S., (2008), Biosystem Eng., 99, Queralt N., Araujo R., (2007), Microbial Ecol., 54, Molina-Hoppner A., Sato T., Kato C., Ganzle M. G., Vogel R. F., (2003), Extremophiles, 7, Saby S., Sibille I., Mathieu L., Paquin J. L., Block J. C., (1997), Appl. Environ. Microbiol., 63, Matsuyama T., (1984), FEMS Microbiol. Lett., 21, Diaper J. P, Tither K., Edwards C., (1992), Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, Kaprelyants A. S., Kell D. B., (1992), J. Appl. Bacteriol., 72, McFeters G. A., Yu F. P., Pyle B. H., Stewart P. S., (1995), J. Ind. Microbiol., 15, Yu F. P., McFeters G. A., (1994a), J. Microbiol. Methods, 20, BIOTECHNOLOGIA 4 (87)

13 Justyna Sadowska, W³odzimierz Grajek 49. Yu F. P., McFeters G. A., (1994b), Appl. Environ. Microbiol., 60, Pacheco C. C., Alves C. C., Barreiros L., Castro P. M. L., Teixeira P. C. M., (2003), Biotechnol. Lett., 25, Reis A., Lopes de Silva T., Kent C. A., Kosseva M., Roseiro J. C., Hewitt C. J., (2005), J. Biotechnol., 115, Nuding S., Fellermann K., Wehkamp J., Mueller H. A. G., Stange E. F., (2006), J. Microbiol. Methods, 65, Alakomi H.-L., Matto J., Virkajarvi I., Saarela M., (2005), J. Microbiol. Methods, 62, Deere D., Porter J., Edwards C., Pickup R., (1995), FEMS Microbiol. Lett., 130, Suller M. T. E., Lloyd D., (1999), Cytometry, 35, Beck P., Huber R., (1997), FEMS Microbiol. Lett., 14, Hatzinger P. B., Palmer P., Smith R. L., Penarrieta C. T., Yoshinari T., (2003), J. Microbiol. Methods, 52, Bartosch S., Mansch R., Knotzsch K., Bock E., (2003), J. Microbiol. Methods, 52, Bovill R. A., Shallcross J. A., Mackey B. M., (1994), J. Appl. Bacteriol., 77, Jørgensen F., Nybroe O., Knfchel S., (1994), J. Appl. Bacteriol., 77, Ramalho R., Cunha J., Teixeira P., Gibbs P. A., (2001), J. Microbiol. Methods, 44, Bartscht K., Cypionka H., Overmann J., (1999), FEMS Microbiol. Ecol., 28, Lepeuple A., Gilouppe S., Pierlot E., Roubin M., (2004), Int. J. Food Microbiol., 92, Richardson R. E., James C. A., Bhupathiraju V. K., Alvarez-Cohen L., (2002), Biodegradation, 13, Gunasekera T. S., Veal D. A., Attfield P. V., (2003), Int. J. Food Microbiol., 85, Lovejoy C., Legendre L., Klein B., Tremblay J. É., Ingram R. G., Therriault J. C., (1996), Aquat. Microb. Ecol., 10, Gribbon L. T., Barer M. R., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, Smith J. J., McFeters G. A., (1996), J. Appl. Bacteriol., 80, Thom S. M., Horobin R. W., Seidler E., Barer M. R., (1993), J. Appl. Bacteriol., 74, Ullrich S., Karrasch B., Hoppe H. G., Jeskulke K., Mehrens M., (1996), Appl. Environ. Microbiol., 62, Karner M., Furhman J. A., (1997), Appl. Environ. Microbiol., 63, Rotman B., Papermaster B. W., (1966), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, Hoefl D., Warwick L., Grooby L., Monis P. T., Andrews S., Saint C. P., (2003), J. Microbiol. Methods, 52, Diaper J. P., Tither K., Edwards C., (1992), Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, Diaper J. P., Edwards C., (1994), J. Appl. Bacteriol., 77, Wanandy S., Brouwer N., Liu Q., Mahon A., Cork S., Karuso P., Vemulpad S., Jamie J., (2005), J. Microbiol. Methods, 60, Comas J., Vives-Rego J., (1998), J. Microbiol. Methods, 32, Jepras R. I., Carter J., Pearson S. C., Paul F. E., Wilkinson M. J., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, Kawai M.,Yamaguch N., Nasau M., (1999), J. Appl. Microbiol., 86, Bunthof C., VanDen Braak S., Breeuwer P., Rombouts F. M., Abee T., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, Tanaka Y., Yamaguchi N., Nasau M., (2000), J. Appl. Microbiol., 88, Reynolds D. T., Fricker C. R., (1999), J. Appl. Microbiol., 86, Catala P., Parthuisot N., Bernard L., Baudart J., Lemarchand K., Lebaron P., (1999), FEMS Microbiol. Lett., 178, Hornbeak T., Nielsen A. K., Dynesen J., Jakobsen M., (2004), FEMS Microbiol. Lett., 236, Fang W., Siegumfeldt H., Budde B. B., Jakobsen M., (2004), Appl. Environ. Microbiol., 70, Budde B., Jakobsen M., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, Rechinger K. B., Siegumfeldt H., (2002), Int. J. Food Microbiol., 75, Miyanaga K., TakanoS., Morono Y., Hori K., Unno H., Tanami Y., (2007), Biochem. Eng. J., 37, Siegumfeldt H., Rechinger K. B., Jakobsen M., Microbiology, 145, Hornbeak T., Dynesen J., Jakobsen M., (2002), FEMS Microbiol. Lett., 215, PRACE PRZEGL DOWE