ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW CANDIDA ALBICANS ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS GENETIC DIVERSITY OF CANDIDA ALBICANS ISOLATES USING ITS MARKERS

Transkrypt

1 Rafał Ogórek Katarzyna Kalinowska Bartosz Kozak EPISTEME 14/2012 s ISSN ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW CANDIDA ALBICANS ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS GENETIC DIVERSITY OF CANDIDA ALBICANS ISOLATES USING ITS MARKERS Abstrakt. Candida albicans jest wszechobecnym komensalem, jak również bardzo ważnym, oportunistycznym patogenem ludzkim, powodującym infekcje skóry, błon śluzowych czy paznokci. Mikroorganizm ten może wywołać ostre i przewlekłe grzybice inwazyjne. Są one bardzo groźne dla pacjentów z grup ryzyka np. osób z chorobami nowotworowymi lub osób po zabiegach chirurgicznych z cukrzycą bądź gruźlicą. Grupą pacjentów szczególnie predysponowaną do rozwinięcia zakażenia grzybiczego są chorzy na AIDS. W przypadku nie leczonych kandydoz głębokich może dojść do zgonu chorego. Przeprowadzone badania miały na celu określenie genetycznego zróżnicowania izolatów C. albicans. Do analiz wybrano 22 izolaty uzyskane od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Do określenia zmienności wykorzystano markery ITS. Produkty uzyskane po reakcji PCR, trawiono enzymem restrykcyjnym Hinf I i rozdzielano je elektroforetycznie. Z przeprowadzonych badań wynika, że analizowane izolaty wykazały zróżnicowanie profilu genetycznego. Słowa kluczowe: zróżnicowanie genetyczne, Candida albicans, markery ITS Summary. Candida albicans is both an ubiquitous commensal, as well as very important opportunistic human pathogen causing skin infections, mucous membrane infections or nail infections. This microorganism may cause acute and chronic invasive fungal infections. It is very dangerous for patients from risk gropus, e.g. people with cancer, people after surgeries, who suffer from diabetes or tuberculosis. Group of patients particularly predisposed to the development of fungal infection are patients with AIDS. The prognosis is poor and untreated, deep candidiasis may cause death. The research was aimed to determine the genetic diversity of C. albicans isolates. 22 isolates selected for analysis, which were obtained from patients with different pathological changes. To determine the diversity used ITS markers. The product obtained after PCR, digested with the restriction enzyme Hinf I and them were separated by electrophoresis. The research showed that the analyzed isolates showed high genetic diversity. Key words: genetic diversity, Candida albicans, ITS markers 365

2 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak WSTĘP Grzyby drożdżakowe z rodzaju Candida należą do typu workowców (Ascomycota). Są pospolitymi saprotrofami, które zasiedlają organizm człowieka [Kasperska-Zając i Rogala 2002]. Szacuje się, że grzyby drożdakowe w tym Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, występują u 10 do 40 % ludzi zdrowych. Zasiedlają one cały ich przewód pokarmowy, począwszy od jamy ustnej, aż do odbytnicy [Szczepaniak i in. 2004]. Obecnie znanych jest około 196 gatunków Candida spp., z tego 15 ma właściwości chorobotwórcze [Kostecka 2011]. Są one główną przyczyną kandydoz błon śluzowych, układu moczowego, płciowego i dróg oddechowych u pacjentów z naturalnym lub wywołanym farmakologiczne niedoborem odporności [Krzyściak i in. 2011]. Spośród gatunków drożdżaków z tego rodzaju, najczęściej izolowanym i najbardziej patogenicznym dla człowieka jest C. albicans, który może być przyczyną infekcji i alergii u ludzi oraz zwierząt [Kasperska-Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009]. Szacuje się, że jest on przyczyną 80% kandydoz przewodu pokarmowego [Szczepaniak i in. 2004]. Natomiast pod względem uczuleniowym ustępuje grzybom strzępkowym z rodzaju Cladosporium, Alternaria i Aspergillus [Kasperska- -Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009]. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat obserwuje się stały wzrost zakażeń grzybiczych powierzchownych i głębokich, które prowadzą często do zgonu [Gustem 1994, Pfaller 1996, Batura-Gabryel i Młynarczyk 1998]. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym w grzybicach są drożdżaki z rodzaju Candida, a w szczególności gatunek C. albicans. Ryzyko rozwoju zakażeń grzybiczych jest powiązane z kondycją fizjologiczną organizmu gospodarza, czyli jego stanem zdrowia, wiekiem i sposobem odżywiania. Do innych czynników zwiększających ryzyko kandydoz należą zabiegi inwazyjne, antybiotykoterapie oraz pierwotne i wtórne niedobory immunologiczne (AIDS, cukrzyca) [Nawrot i Karpiewska 2002]. W ostatnich latach, istotny jest szczególnie problem zwiększenia ilości spożywanych antybiotyków. ESAC (European Surveillance of Antibiotic Consumption) donosi, że Polska znajduje się w pierwszej dziesiątce krajów europejskich pod względem ilości spożywanych antybiotyków na jednego mieszkańca. W Polsce na 1000 osób, 25 zażywa antybiotyki codziennie, a w okresie jesienno-zimowym nawet 100 [Kostecka 2011]. Powszechne stosowanie antybiotykoterapii zabija bakterie pasożytnicze oraz masowo niszczy pożyteczną florę bakteryjną przewodu pokarmowego. Zmiany te prowadzą także do wtórnych niedoborów witaminowych, które mają również wpływ na odporność przed zakażeniami grzybiczymi [Isenberg i in. 1960, Pappas i in. 2003]. Potwierdzają to doniesienia Campbell i Saslaw [1949], których wyniki badań klinicznych wykazały rozwój grzybic pod wpływem stosowanej streptomycyny. 366

3 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... Trudności związane z patogenicznością C. albicans mogą być spowodowane zmiennością fenotypową i genotypową tego patogena, która objawiają się m.in. różną zdolnością adhezji komórek drożdżaka do komórek nabłonka i śródbłonka gospodarza oraz różną produkcją pozakomórkowych enzymów [Odds i in. 1983, Nawrot i Karpiewska 2002]. Do oceny zróżnicowania genetycznego grzybów można wykorzystać technikę PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction -Restriction Fragment Length Polymorphism) [Godoy i in. 2004]. Jest to metoda w której produkty uzyskane w reakcji amplifikacji (PCR) poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Celem badań było określenie zróżnicowania genetycznego izolatów C. albicans, wyizolowanych z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów z wykorzystaniem techniki PCR-RFLP. MATERIAŁ I METODY Do badań użyto 22 izolaty Candida albicans, które pochodziły z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów Tab. 1. Pochodziły one z kolekcji Katedry i Kliniki Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Akademii Medycznej we Wrocławiu. DNA do analiz molekularnych wyizolowano z koloni wyrosłych na podłożu Sabourauda. Kolonie zbierano ezą do 1,5 ml probówek Eppendorf i izolowano według metody Doyle i Doyle [1987], zmodyfikowanej przez Kozaka i in.. Ilość i jakość wyizolowanego materiału sprawdzano spektrofotometrycznie (długości fali: 260, 280, 230 nm). Do dalszych analiz przygotowano roztwory robocze o stężeniu DNA 30 ng x ml -1. Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze firmy Biometria. Mieszanina reakcyjna miała skład: 5,9 ml H 2 O, 1,5 ml buforu x 10 (Fermentas), 2,5 ml MgCl 2 (25 mm, Fermentas), 1 ml dntp (10 mm każdy, mix, Fermentas), 1,1 ml startera Forward (F) i Reverse (R), 0,2 ml polimerazy (5u x ml -1, Fermentas), genomowe DNA (30 ng x ml -1 ). Do analiz użyto dwóch kombinacji starterów ITS1: F 5 -GGAAG- TAAAAGTCGTAACAAGG-3, R 5 -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 oraz ITS2: F 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3, R 5 -GCTGCGTTCTT- CATCGATGC-3. Reakcję PCR przeprowadzono w 40 cyklach i składała się z następujących etapów: wstępna denaturacja 95 C przez 5 min, denaturacja 95 C przez 1 min, przyłączanie starterów 55 C przez 30 sek., amplifikacja 72 C przez 30 sek., końcowa amplifikacja 72 C przez 10 min. Produkty po PCR trawione były przy użyciu enzymu Hinf I w roztworze o składzie: 9 ml H 2 O, 1 ml bufor R (Fermentas), 1 ml Hinf I (Fermentas), 5 ml produkt po amplifikacji. Trawienie prowadzone było przez 16 godzin w 37 C, po tym czasie enzym był dezaktywowany przez 5 min inkubację w 75 C. 367

4 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Po trawieniu otrzymane produkty rozdzielono z użyciem elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen). Po analizie elektroforogramów utworzona została binarna macierz przy użyciu oprogramowania urządzenia Qiaxel, którą analizowano w programie NTSYSpc [Rohlf 1990]. Do stworzenia macierzy dystansu genetycznego wykorzystano algorytm Nei [1972]. Dendrogram utworzono przy wykorzystaniu metody UPGMA. WYNIKI Analiza matrycy binarnej, utworzonej na podstawie elektoforogramów uzyskanych w rozdziale produktów trawienia enzymem Hinf I, pozwoliła na wykrycie 6 polimorficznych prążków. Na tej podstawie utworzono macierz dystansu genetycznego oraz dendrogram zróżnicowania genetycznego w badanym materiale (Rys. 1). Rys. 1. Dendrogram UPGMA obrazujący dystans genetyczne pomiędzy badanymi izolatami C. albicans Utworzona macierz dystansu genetycznego i dendrogram zróżnicowania genetycznego, podzieliły badane izolaty na dwie grupy (I i II) i w każdej z nich wyróżniona trzy podgrupy (A, B i C) obrazują to Tab. 1 i Rys. 1. Izolaty C. albicans z grupy I można uznać za plejotropowe, pojawiają się one na tkankach zewnętrznych i wewnętrznych, natomiast izolaty z grupy II występują tylko w tkankach wewnętrznych. Jednakże izolaty należące do obu grup, występowały na narządach rozrodczych Tab

5 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... L.p. Nazwa szczepu Symbol Miejsce izolacji Grupa 1 AM 1418 / 2011 A 1 I A paznokcie rąk 2 AM 1481 / 2011 A 2 I A 3 AM 1285 / 2011 A 3 I A przestrzeń międzypalcowa stóp 4 AM 1235 / 2011 A 4 I A 5 AM 1548 / 2011 A 5 I A paznokcie rąk 6 AM 1185 / 2011 A 6 I B 7 AM 900 / 2011 A 7 jama ustna II A 8 AM / 2011 A 8 I A paznokcie rąk 9 AM 09 / 2011 A 9 I A 10 AM 96 / 2011 A 10 żołądź I A 11 AM / 2011 A 11 II A jama ustna 12 AM 08 / 2011 B 1 II A 13 AM 53 / 2011 B 2 pachwiny I C 14 AM 73 / 2011 B 3 paznokcie stóp I A 15 AM 70 / 2011 B 4 pochwa II B 16 AM 1066 / 2011 B 5 jama ustna I A 17 AM 103 / 2011 B 6 paznokcie stóp I A 18 AM 325 / 2011 B 7 jama ustna II C 19 AM 1444 / 2011 B 8 I C pochwa 20 AM 1768 / 2011 B 9 I C 21 AM 06 / 2011 B 10 I C jama ustna 22 AM 02 / 2011 B 11 I C Tab. 3. Zestawienie badanych izolatów C. albicans z podziałem na grupy uzyskane po analizie zmienności genetycznej DYSKUSJA We współczesnej medycynie metody identyfikacji grzybów izolowanych z chorobowo zmienionych miejsc do gatunku oraz ocena ich zmienności genetycznej, stały się bardzo ważnym elementem prowadzącym do skutecznej terapii. Za jedną z najlepszych metod uważana jest analiza sekwencji reprezentatywnych fragmentów genomu drobnoustroju, ale stosowanie tej metody ogranicza się głównie do laboratoriów referencyjnych. Znacznie tańszą i prostszą metodą jest analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) produktów reakcji PCR [Chen i in. 2001, Iwen i in. 2002, Mecler i Nawrot 2008]. 369

6 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Wyniki uzyskane za pomocą technika PCR-RFLP są specyficzne gatunkowo dla grzybów oraz pozwala jednocześnie na ocenę ich zmienności genetycznej [Nawrot i in. 2011]. Przydatność tej metody do oceny zmienności genetycznej grzybów, potwierdziły wyniki przeprowadzonych badań z izolatami C. albicans. Metoda ta pozwoliła na ocenę zmienności genetycznej w obrębie badanych izolatów, poprzez utworzenie macierzy dystansu genetycznego oraz dendrogramu zróżnicowania genetycznego w badanym materiale. Polimorfizm uzyskany przy wykorzystaniu metody RFLP-PCR nie odbiegał od tego uzyskanego przez innych autorów za pomocą technik RAPD oraz RFLP [Boerlin i in. 1996, Espinel-Ingroff i in. 1999]. WNIOSKI Technika RFLP-PCR jest skuteczną metodą oceny zróżnicowania genetycznego grzybów w obrębie gatunku C. albicans. Wyniki badań genetycznych wykazały zróżnicowanie izalotów C. albicans w zależności od miejsca ich izolacji. Najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała. LITERATURA Batura-Gabryel H., Młynarczyk W Uwaga grzybice narządowe atakują. Mikologia Lekarska, 5(1): Boerlin P., Boerlin-Petzold F., Goudet J., Durussel C., Pagani J.L., Chave J.P., Bille J Typing Candida albicans oral isolates from human immunodeficiency virusinfected patients by multilocus enzyme electrophoresis and DNA fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, 34: Campbell C.C., Saslaw S Enhancement of growth of certain fungi by streptomycin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 70: Chen Y., Eisner J.D., Kattar M.M., Rassoulian-Barrett S.L., Lafe K., Bui U., Limaye A.P., Cookson B.T Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts. Journal of Clinical Microbiology, 39: Doyle J.J., Doyle J.L A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19(1):

7 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... Espinel-Ingroff A., Vazquez J.A., Boikov D., Pfaller M. A Evaluation of DNAbased typing procedures for strain categorization of Candida spp. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 33: Godoy P., Cano J., Gené J., Guarro J., Höfling-Lima A.L.,Colombo A.L Genotyping of 44 Isolates of Fusarium solani, the Main Agent of Fungal Keratitis in Brazil. Journal of Clinical Microbiology, 42(10): Gustem J.V Prophylaxis of Candida and Aspergillus infection with oral administration of itraconazole. Mycoses, 37: Isenberg H.D., Pisano M.A., Carito S Factors leading to overt monilial disease. Preliminary studies of the ecological relationship between Candida albicans and intestinal bacterial. Antibiotics&Chemotherapy, 10: Iwen P.C., Hinrichs S.H., Rupp M.E Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens. Medical Mycology, 40: Karkowska-Kuleta J., Rapala-Kozik M., Kozik A Fungi pathogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus. Acta Biochimica Polonica, 56 (2): Kasperska-Zając A., Rogala E Candida albicans czynnik przyczynowy chorób allergicznych. Alergia Astma Immunologia, 7(4): Kostecka M Kandydoza przewodu pokarmowego u osób leczonych antybiotykami profilaktyczne stosowanie suplementów diety. Mikologia Lekarska, 18(1): Krzyściak P., Skóra M., Macura A.B.: Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka. MedPharm Polska, Mecler I., Nawrot U Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Mikologia Lekarska, 15: Nawrot U., Czmajduch N., Gościniak G Identyfikacja grzybów z rodzaju Candida na podstawie analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych rybosomalnego DNA. Mikologia Lekarska, 18(4): Nawrot U., Karpiewska A Patogeneza zakażeń wywołanych przez Candida albicans. Mikologia Lekarska, 9(3): Nei M Genetic distance between populations. The American Naturalist, 106(28): Odds F.C., Abbot A.B., Stiller R.L., Scholer H.J., Polak A., Stevens D.A Analysis of Candida albicans phenotypes from different geographical and anatomical sources. Journal of Clinical Microbiology, 18:

8 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Pappas P.G., Rex J.H., Lee J Mycoses Study Group. A prospective observational study of candidemia: epidemiology, therapy and influences on mortality in hospitalized adult and pediatric patients. Clinical Infectious Diseases, 37: Pfaller M Nosocomial candidiasis: emerging species, reservois and modes transmission. Clinical Infectious Diseases, 22(2): Rohlf F. J NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. ver Exeter software, Setauket, New York. Szczepaniak W., Zawirska A., Adamski Z., Rola grzybów drożdżopodobnych rodzaju Candida w etiopatogenezie wybranych schorzeń przewodu pokarmowego. Nowiny Lekarskie, 73(6): Adres do korespondencji: mgr inż. Bartosz Kozak Zakład Genetyki i Biotechnologii Roślin Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, Wrocław bartosz.kozak@up.wroc.pl mgr inż. Rafał Ogórek Zakład Fitopatologii i Mikologii Katedra Ochrony Roślin Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, Wrocław rafal.ogorek@up.wroc.pl mgr inż. Katarzyna Kalinowska Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii Akademia Medyczna we Wrocławiu Wybrzeże L. Pasteura 1, Wrocław kkalinowska@derm.am.wroc.pl Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Sawicka - Sienkiewicz, dr hab. Elżbieta Pląskowska, prof. dr hab. Eugeniusz Baran 372