Analiza genetyczna szczepów Candida albicans za pomocą techniki RFLP-PCR

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL ARTICLES Mikologia Lekarska 2012, 19 (3): Copyright 2012 Cornetis ISSN X Analiza genetyczna szczepów Candida albicans za pomocą techniki RFLP-PCR Rafał Ogórek 1, Bartosz Kozak 2, Agnieszka Lejman 3, Katarzyna Kalinowska 4, Mariusz Dyląg 5 1 Zakład Fitopatologii i Mikologii, Katedra Ochrony Roślin UP we Wrocławiu 2 Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa UP we Wrocławiu 3 Katedra Kształtowania Agroekosystemów i Terenów Zieleni UP we Wrocławiu 4 Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii UM we Wrocławiu 5 Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski STRESZCZENIE Wprowadzenie: Candida albicans jest komensalem przewodu pokarmowego ssaków, jak również ważnym oportunistycznym patogenem ludzkim powodującym infekcje błon śluzowych, skóry czy paznokci. Nieleczona głęboka kandydoza może doprowadzić do zgonu chorego. Cel pracy: Celem pracy była analiza zróżnicowania genetycznego izolatów Candida albicans uzyskanych od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Materiał i metody: Do analiz wybrano 20 izolatów Candida albicans uzyskanych od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Do określenia zmienności wykorzystano technikę RFLP-PCR. Produkty uzyskane po reakcji PCR trawiono enzymem restrykcyjnym Hae III i rozdzielano je za pomocą elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen). Wyniki: Analiza elektroforogramów uzyskanych po rozdziale produktów amplifikacji oraz trawieniu enzymem Hae III pozwoliła wykryć 4 polimorficzne markery. Utworzona macierz dystansu genetycznego i dendrogram zróżnicowania genetycznego podzieliły badane izolaty na 2 grupy (I i II). W grupie I wyróżniono 6 podgrup (A-F). W grupie II wyróżniono 2 podgrupy (A i B), każda po 2 izolaty. Szczepy C. albicans należące do obu grup (I i II) pojawiły się na tkankach zewnętrznych i wewnętrznych. Wnioski: Technika RFLP-PCR jest skuteczną metodą oceny zróżnicowania genetycznego grzybów w obrębie gatunku Candida albicans. Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida albicans jest słabo powiązane z miejscem ich występowania na ciele pacjenta. Najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała. SŁOWA KLUCZOWE: zróżnicowanie genetyczne, Candida albicans, markery ITS, RFLP-PCR ABSTRACT Introduction: Candida albicans is the commensals of the gastrointestinal tract of mammalian, as well as very important opportunistic human pathogen causing mucous membrane infections, skin infections or nail infections. Untreated deep candidiasis can lead to a fatal outcome. Aim of the study: The aim of the study was genetic diversity of Candida albicans isolates, which were obtained from patients with different pathological changes. Material and methods: 20 isolates selected for analysis, which were obtained from patients with different pathological changes. To determine the diversity used RFLP-PCR technique. The product obtained after PCR, digested with the restriction enzyme Hae III and then were separated by capillary electrophoresis on a Qiaxel (Qiagen) system. Results: Electropherogram analysis obtained after divided amplification products and enzyme digestion with Hae III, allowed to detect the four polymorphic markers. Obtained matrix of genetic distance and dendrogram of genetic diversity, divided tested isolates on two groups (I and II). In group I distinguished six subgroups (A-F). In group II, distinguished two groups (A and B), each of two isolates. Strains of C. albicans belonging to both groups (I and II) and appered on the external and internal tissues. Conclusions: RFLP-PCR technique is an effective method for assessing the genetic diversity within the fungi Candida albicans. Genetic diversity of isolates of Candida albicans is weakly related with the place of their occurrence on the patient s body. The weakest genetically diverse isolates are isolates, which were obtained from modified surface parts of the body. KEY WORDS: genetic diversity, Candida albicans, ITS markers, RFLP-PCR 109

2 Ogórek R., Kozak B., Lejman A., et al. Mikologia Lekarska 2012, 19 (3) 110 Wprowadzenie Około 200 drożdżaków zalicza się do rodzaju Candida, ale tylko nieliczne z nich to gatunki patogeniczne dla ludzi [1]. Są one główną przyczyną kandydoz błon śluzowych, układu moczowego, płciowego i dróg oddechowych u pacjentów z naturalnym lub wywołanym farmakologiczne niedoborem odporności. W ostatnich latach obserwuje się zwiększenie udziału w kandydozach gatunków innych niż C. albicans, zwanych jako Candida nonalbicans. Przypuszcza się, że zaistniały stan rzeczy spowodowany jest stosowaniem na szeroką skalę antybiotyków oraz wzrostem odsetka pacjentów z immunosupresją [2]. Drożdże z rodzaju Candida należą do typu workowców (Ascomycota). Są pospolitymi saprotrofami, które zasiedlają organizm człowieka [3]. Szacuje się, że grzyby drożdżakowe, w tym Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, występują u 10-40% ludzi zdrowych. Zasiedlają one cały ich przewód pokarmowy, począwszy od jamy ustnej, aż do odbytnicy [4]. Candida spp. mogą zatem jako komensale zasiedlać organizm człowieka (przewód pokarmowy) [4], jednakże w sprzyjających warunkach stają się szczepami patogennymi [5]. Na podstawie wcześniejszych doniesień wiadomo, że związane jest to z interakcją grzyb gospodarz. Jednym z elementów tej interakcji może być zmienność fenotypowa i genotypowa Candida spp. [6]. Może się ona objawić m.in. różną zdolnością adhezji komórek drożdżaka do komórek nabłonka i śródbłonka gospodarza oraz różną produkcją pozakomórkowych enzymów [6, 7]. Spośród różnych gatunków drożdżaków należących do tego rodzaju najczęściej izolowanym gatunkiem jest C. albicans, który może być przyczyną infekcji i alergii u ludzi i zwierząt. Jednakże znacznie rzadziej jest czynnikiem etiologicznych alergii niż grzyby pleśniowe z rodzaju Cladosporium, Alternaria czy Aspergillus [3]. Gatunek C. albicans jest najbardziej patogeniczny dla człowieka spośród wszystkich gatunków z rodzaju Candida [8]. Jest on przyczyną m.in. 80% kandydoz przewodu pokarmowego. W pozostałych procentach mieszczą się gatunki, takie jak np. Candida tropicalis, C. glabrata, C. krusei lub C. lusitaniae. Do kandydoz, m.in. przewodu pokarmowego, dochodzi zazwyczaj na drodze endogennej. Komórki drożdżaków mogą przedostawać się m.in. przez uszkodzone błony śluzowe u chorych na chorobę wrzodową żołądka lub dwunastnicy [4]. Candida albicans jest głównym patogenem grzybiczym u pacjentów z obniżoną odpornością [9]. Może jednak kolonizować skórę i powierzchnie błon śluzowych zdrowych ludzi [10]. Drożdżaki z gatunku C. albicans mogą dostawać się także do krwiobiegu przez bezpośrednią penetrację z nabłonka po uszkodzeniu tkanki lub rozpowszechnianie z biofilmu utworzonego na wyrobach medycznych wprowadzanych do organizmu pacjenta, np. cewniki, implanty lub endoprotezy [10, 11]. Następnie rozprzestrzeniają się wraz z krwią i infekują niemal wszystkie organy wewnętrzne (płuca, nerki, serce, wątroba, śledziona i mózg), powodując posocznicę grzybową i stwarzając zagrożenie dla życia pacjentów [12]. Do oceny zróżnicowania genetycznego grzybów można wykorzystać różne technik PCR w szczególności PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) [13]. W metodzie tej wykorzystuje się zwykle startery długości nukleotydów do amplifikacji jądrowego lub mitochondrialnego DNA (mtdna). Produkt PCR jest następnie trawiony za pomocą enzymów restrykcyjnych, co prowadzi do powstania wielu fragmentów różniących się wielkością i sekwencją nukleotydową, a tym samym wzorem restrykcyjnym. Otrzymane produkty można użyć jako markerów zarówno do identyfikacji gatunkowej, jak i do badań różnorodności wewnątrzgatunkowej [14, 15]. Najczęściej wykorzystywanym regionem do PCR jest rybosomalne DNA (rdna), kodujące elementy strukturalne rybosomów w obrębie, którego można wyróżnić konserwatywne obszary kodujące 18S, 28S i 5.8S oraz cechujące się wyższym polimorfizmem miejsca niekodujące ITS1 i ITS2 (ITS Internal Transcribed Spacer) [16]. Regiony ITS charakteryzują się dużą zmiennością międzygatunkową i wewnątrzgatunkową, dzięki czemu mogą być z powodzeniem wykorzystywane nie tylko w klasyfikacji taksonomicznej, ale również jako markery molekularne w identyfikacji rodzajowej i wewnątrzgatunkowej. Regiony te w ciągu ostatniej dekady uznaje się za gatunkowo diagnostyczne, ponieważ są one obecne we wszystkich organizmach [17-19]. Cel pracy Celem pracy była analiza zróżnicowania genetycznego izolatów Candida albicans uzyskanych od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Materiał i metody Do badań użyto 20 izolatów Candida albicans, które uzyskano z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów (tab. I). Pochodziły one z kolekcji Katedry i Kliniki Dermatologii, Wenerologii i Alergologii Akademii Medycznej we Wrocławiu oraz z kolekcji Instytutu Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytetu Wrocławskiego. Tabela I: Table I: Numer izolatu Isolate number Zestawienie badanych izolatów Candida albicans List of tested isolates of Candida albicans Nazwa izolatu Name of isolate Miejsce izolacji Isolation place Kolekcja Collection / 11 paznokcie rąk / fingernails AM we / 11 Wrocławiu Wrocław Medical / 11 przestrzeń międzypalcowa stóp University / 11 interdigital space of the foot / 11 paznokcie rąk / fingernails / 11 7 Ca 900 / 07 jama ustna / oral cavity Uniwersytet 8 ATCC krew / blood Wrocławski University of 9 Ca AM / 09 paznokcie rąk / fingernails Wrocław 10 JL 96 żołądź / glans 11 ATCC grzybica oskrzeli mycosis bronchitis 12 Ca Jk 73 paznokcie stóp / toenails 13 Ca sk 70 pochwa / vagina 14 Ca 1066 jama ustna / oral cavity 15 Ca sk 103 paznokcie stóp / toenails 16 Ca 325 / 11 jama ustna / oral cavity 17 Ca 1444 pochwa / vagina 18 Ca MJ 06 jama ustna / oral cavity 20 MJ 02

3 Ogórek R., Kozak B., Lejman A. i wsp. Analiza genetyczna szczepów Candida albicans za pomocą techniki RFLP-PCR Tabela II: Table II: Wyniki RFLP-PCR izolatów Candida albicans, z wykorzystaniem starterów ITS i enzymu Hae III oraz podział na grupy uzyskane po analizie zmienności genetycznej The results of RFLP-PCR isolates of Candida albicans, using the ITS primers and the enzyme Hae III and division into groups obtained after the analysis of genetic diversity Numer izolatu Isolate number Wielkość produktu [pz] / Size of the produkt [bp] ITS5, ITS2 ITS3, ITS4 ITS1, ITS2 Trawienie Digestion Trawienie Digestion Trawienie Digestion , 115 x x 216 x I A , 115 x x , 91 I B , 115 x x 216 x I A x x x 216 x I D x x x , 91 I F x x x 216 x I D , x 216 x I C , x 216 x I C , x , 91 II A , x , 91 II A , 115 x x 216 x I A , 115 x x , 91 I B x 336 x , 91 II B x 336 x , 91 II B , 115 x x 216 x I A x x x 216 x I D x x x x x I E x x x 216 x I D x x x 216 x I D x x x x x I E Grupa Group DNA do analiz molekularnych wyizolowano z kolonii wyrosłych na podłożu Sabourauda. Kolonie zbierano ezą do 1,5 ml probówek Eppendorf i izolowano wg metody Doyle i Doyle [20], zmodyfikowanej przez autorów tej pracy: W porównaniu z metodą Doyle i Doyle [20] zmieniono następujące etapy: brak homogenizacji tkanki w ciekłym azocie, homogenizacja materiału badawczego w buforze lizującym (CTAB 1%, Tris-HCl ph=8,0 50 mm, EDTA ph=8,0 10 mm, NaCl 0,7 M, PVP ,5% β-merkaptoetanol 0,1%, zwiększenie objętości buforu lizującego z 400 μl do 700 μl, powtórzenie dodawania mieszaniny chloroform:izoamyl 24:1 (500 μl). Ilość i jakość wyizolowanego materiału sprawdzano spektrofotometrycznie (długości fali: 260, 280, 230 nm). Do dalszych analiz przygotowano roztwory robocze o stężeniu DNA 30 ng μl -1. Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze firmy Biometria. Mieszanina reakcyjna miała skład: 5,9 μl H 2 O, 1,5 μl buforu 10 (Fermentas), 2,5 μl MgCl 2 (25 mm, Fermentas), 1 μl dntp (10 mm każdy, mix, Fermentas), 1,1 μl startera Forward (F) i Reverse (R), 0,2 μl polimerazy (5u μl -1, Fermentas ), genomowe DNA (30 ng μl -1 ). Do analiz użyto 3 kombinacji starterów: ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG i ITS2 GCTGCGTTCTT- CATCGATGC, ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC i ITS4 TCCTCCGCTTATTGA- TATGC, ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG i ITS2 GCTGCGTTCTTCATC- GATGC. PCR przeprowadzono w 40 cyklach i następujących warunkach: wstępna denaturacja 95 C przez 5 min, denaturacja 95 C przez 1 min, przyłączanie starterów 55 C przez 30 s, amplifikacja 72 C przez 30 s, końcowa amplifikacja 72 C przez 10 min. Produkty amplifikacji rozdzielono z użyciem elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen), a wielkość produktów ustalona przy użyciu oprogramowania ScreenGel (Qiagen) (ryc. 1). Produkty po PCR trawione były przy użyciu enzymu Hae III (5`- GG CC-3`) w roztworze o składzie: 9 μl H 2 O, 1 μl bufor R (Fermentas), 1 μl Hae III (Fermentas), 5 μl produkt po amplifikacji. Trawienie prowadzone było przez 16 godz. w temperaturze 37 C, po tym czasie enzym był dezaktywowany przez 5 min inkubację w 75 C. Po trawieniu otrzymane produkty rozdzielono z użyciem elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen), a wielkość produktów ustalono przy użyciu oprogramowania ScreenGel (Qiagen) (ryc. 2). Po analizie elektroforogramów utworzona została binarna macierz przy użyciu oprogramowania urządzenia Qiaxel, którą analizowano w programie NTSYSpc [21]. Do stworzenia macierzy dystansu genetycznego wykorzystano algorytm Nei [22]. Dendrogram utworzono przy wykorzystaniu metody UPGMA. Wyniki Do analizy RFLP-PCR wykorzystano 20 szczepów Candida albicans wyizolowanych z chorobowo zmienionych miejsc od pacjentów: paznokcie rąk, paznokcie stóp, przestrzeń międzypalcowa stóp, jama ustna, żołądź, pochwa, krew i od pacjentów z grzybicą oskrzeli (tab. I). Analiza elektroforogramów uzyskanych po rozdziale produktów amplifikacji oraz trawieniu enzymem Hae III (ryc. 1, 2), umożliwiła wykrycie 4 polimorficznych markerów (tab. II). Pozwoliło to na utworzenie macierzy binarnej. Dane te wykorzystano do obli- 111

4 Ogórek R., Kozak B., Lejman A., et al. Mikologia Lekarska 2012, 19 (3) Ryc. 1. Elektroforogram rozdziału produktów amplifikajicji z zastosowaniem startera ITS 5 oraz ITS 2 dla izolatu Candida albicans numer 8 Fig. 1. Electropherogram of division of the amplification products using primer the ITS 5 and ITS 2 for Candida albicans isolate number 8 Ryc. 2. Elektroforagram produktów amplifikacji ze starterami ITS 5 oraz ITS 2 dla izolatu Candida albicans numer 8 po trawieniu enzymem Hae III Fig. 2. Electropherogram amplification products with primers ITS 5 and ITS 2 for Candida albicans isolate number 8 after digestion with the enzyme Hae III 112 Ryc. 3. Dendrogram UPGMA obrazujący dystans genetyczny pomiędzy badanymi izolatami Candia albicans Fig. 3. UPGMA dendrogram showing the genetic distance between isolates of Candia albicans

5 Ogórek R., Kozak B., Lejman A. i wsp. Analiza genetyczna szczepów Candida albicans za pomocą techniki RFLP-PCR czenia dystansu genetycznego oraz stworzenia dendrogramu zróżnicowania genetycznego w badanym materiale (ryc. 3). Utworzona macierz dystansu genetycznego i dendrogram zróżnicowania genetycznego podzieliły badane izolaty na dwie grupy (I i II). W grupie I wyróżniono 6 podgrup (A-F). Najwięcej izolatów zgrupowało się w podgrupie D. Znalazły się w niej izolaty zarówno z tkanek zewnętrznych, jak i wewnętrznych. Najmniej liczną okazała się podgrupa F, w której znalazł się 1 izolat. W grupie II wyróżniono 2 podgrupy (A i B), każda po 2 izolaty (tab. II, ryc. 3). Szczepy C. albicans należące do obu grup (I i II) można uznać za eurytopy, pojawiają się one na tkankach zewnętrznych i wewnętrznych. Omówienie We współczesnej medycynie metody identyfikacji grzybów izolowanych z chorobowo zmienionych miejsc do gatunku oraz ocena ich zmienności genetycznej, stały się bardzo ważnym elementem prowadzącym do skutecznej terapii [23]. Genom grzybów charakteryzuje się występowaniem unikalnych genów, które nie mają swoich bezpośrednich odpowiedników w genomach innych organizmów. Zwykle występują one w pojedynczych kopiach i cechują się wysoką specyficznością [15]. Można je zatem z powodzeniem wykorzystać do identyfikacji molekularnej. Do identyfikacji drożdżaków z rodzaju Candida wykorzystuje się m.in. gen L1A1 oraz gen CHS1 [15]. Gen L1A1 koduje 14-alfa-demetylazę lanosterolu z układu cytochromu P-450, enzym odgrywający ważną rolę w procesie konwersji lanosterolu do ergosterolu, który stanowi jeden z głównych składników błony komórkowej grzybów [24], a gen CHS1 kodujący białko syntetazę chitynową enzym niezbędny w procesie budowy ściany komórkowej grzybów, której głównym składnikiem jest chityna [25]. Obecnie w badaniach molekularnych najczęściej wykorzystuje się rybosomalne DNA (rdna). Zbudowane jest ono z regionu niekodującego IGS (Intergenic Spacer Region), zawierającego fragmenty ETS1 i ETS2 (External Transcribed Spacer), regionu kodującego elementy strukturalne rybosomu: 18S, 5,8S, 28S oraz wewnętrznych regionów niekodujących ITS1 i ITS2 (Internal Transcribed Spacer) [26]. W literaturze jest wiele doniesień na temat skuteczności wykorzystania fragmentów ITS do zróżnicowania genetycznego w obrębie gatunku i rodzaju grzybów [15, 16, 27]. W przeprowadzonych badaniach wykorzystano także amplifikację fragmentów ITS połączoną z techniką RFLP. Uzyskane wyniki potwierdziły doniesienia literaturowe o skuteczności tej metody do określenia m.in. zróżnicowania genetycznego w obrębie gatunku. Przebadane izolaty C. albicans uzyskane z różnych zmienionych chorobowo miejsc ciała pacjentów utworzyły 2 grupy podobieństwa genetycznego. W grupie I wyróżniono 6 podgrup, gdzie podgrupa A i B wykazywała największe powinowactwo do miejsca izolacji patogenna. Znajdowały się w nich izolaty uzyskane z paznokci i przestrzeni międzypalcowych. W grupie II wyróżniono 2 podgrupy, w których nie zauważono podobnej tendencji co do miejsca, z którego uzyskano izolaty C. albicans. Biorąc pod uwagę wszystkie uzyskane wyniki, należy stwierdzić, że szczepy C. albicans należące do obu grup można uznać za eurybionty, gdyż nie można jednoznacznie stwierdzić podobieństwa genetycznego między większą liczbą szczepów skorelowanego z miejscem ich izolacji. Uzyskane wyniki potwierdzają częściowo doniesienia Kozaka i wsp. [23], którzy przebadali 22 szczepy C. albicans uzyskane także z różnych chorobowo zmienionych części ciała pacjentów za pomocą techniki RFLP-PCR. Stwierdzili oni również, że najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała, ale brak jest 100-procentowej korelacji między miejscem izolacji patogenów a ich podobieństwem genetycznym. Wnioski 1. Technika RFLP-PCR jest skuteczną metodą oceny zróżnicowania genetycznego grzybów w obrębie gatunku Candida albicans. 2. Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida albicans jest słabo powiązane z miejscem ich występowania na ciele pacjenta. 3. Najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała. Piśmiennictwo 1. Odds FC. Candida and Candidosis: A review and bibliography. London, Balliere Tindall, Krzyściak P, Skóra M, Macura AB. Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka. MedPharm Polska. 2011; Kasperska-Zając A, Rogala E. Candida albicans czynnik przyczynowy chorób allergicznych. Alergia Astma Immunologia. 2002;7: Szczepaniak W, Zawirska A, Adamski Z. Rola grzybów drożdżopodobnych rodzaju Candida w etiopatogenezie wybranych schorzeń przewodu pokarmowego. Nowiny Lekarskie. 2004;73: Brajer B, Batura-Gabryel H, Łukaszuk C, i wsp. Biotypy szczepów Candida albicans wyizolowanych z górnych dróg oddechowych osób zamieszkujących trzy regiony geograficzne Polski. Mikol. Lek. 2005;12: Odds FC, Abbot AB, Stiller RL, i wsp. Analysis of Candida albicans phenotypes from different geographical and anatomical sources. J Clin Microbiol. 1983;18: Nawrot U, Karpiewska A. Patogeneza zakażeń wywołanych przez Candida albicans. Mikol Lek. 2002;9: Karkowska-Kuleta J, Rapala-Kozik M, Kozik A. Fungi pathogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus. Acta Biochim Pol. 2009;56: Magee PT, Bowdin L, Staudinger J. Comparison of Molecular Typing Methods for Candida albicans. J Clin Microbiol. 1992;30: Mavor AL, Thewes S, Hube B. Systemic fungal infections caused by Candida species: epidemiology, infection process and virulence attributes. Curr Drug Targets. 2005;6: Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK, i wsp. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol. 2001;183: Brown AJ, Odds FC, Gow NA. Infection-related gene expression in Candida albicans. Curr Opin Microbiol. 2007;10: Godoy P, Cano J, Gené J, i wsp. Genotyping of 44 Isolates of Fusarium solani, the Main Agent of Fungal Keratitis in Brazil. J Clin Microbiol. 2004;42: Ratcliffe ST, Donald W, Webb DW, i wsp. PCR-RFLP Identification of Diptera (Calliphoridae, Muscidae and Sarcophagidae) A Generally Applicable Method. J Forensic Sci.2003;48:1-3. [ data dostępu: Mecler I, Nawrot U. Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Mikol Lek. 2008;15: Nawrot U, Czmajduch N, Gościniak G. Identyfikacja grzybów z rodzaju Candida na podstawie analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych rybosomalnego DNA. Mikol Lek. 2011;18: Schlotterer C, Tautz D. Chromosomal homogeneity of Drosophila ribosomal DNA arrays suggest intrachromosomal exchanges drive concerted evolution. Current Biol. 1994;4: Collins FH, Paskewitz SM. A review of the use of ribosomal DNA (rdna) to differentiate among cryptic Anopheles species. Insect Mol Biol. 1996;5: Fenton B, Mallock G, Moxey E. Analysis of eriophyid mite rdna internal transcribed spacer sequences reveals variable simple sequence repeats. Insect Mol Biol. 1997;6: Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 1987;19: Rohlf FJ. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. ver Exeter software, Setauket, New York, Nei M. Genetic distance between populations. Am Naturalist. 1978;106: Kozak B, Ogórek R, Kalinowska K. Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida albicans za pomocą markerów ITS. Episteme. 2012;20:

6 Ogórek R., Kozak B., Lejman A., et al. 24. Burgener-Kairuz P, Zuber JP, Jaunin P, i wsp. Rapid detection and identification of Candida albicans and Candida glabrata in clinical specimens by species-specific nested PCR amplification of a cytochrome P-450 Lanosterol-α-Demethylase (L1A1) gene fragment. J Clin Microbiol. 1994;32: Jordan JA. PCR identification of four medically important Candida species by using a single primer pair. J Clin Microbiol. 1994;32: Iwen PC, Hinrichs SH, Rupp ME. Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens. Med Mycol. 2002;40: Krupa P. Identification by PCR-RFLP of a fungus isolated from Mycorrhizal Roots of a Distinguishable Birch growing in areas disturbed by Industry. Pol J Environ Stud. 1999;8: Praca wpłynęła do Redakcji: Zaakceptowano do druku: Konflikt interesów: nie zgłoszono ADRES DO KORESPONDENCJI: Mgr inż. Rafał Ogórek pl. Grunwaldzki 24a Wrocław rafal.ogorek@up.wroc.pl Mikologia Lekarska 2012, 19 (3) 114