Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy

Transkrypt

1 Prace oryginalne / Original papers Mikologia Lekarska 007, 14 (3): Copyright 007 Cornetis ISSN X Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie Streszczenie Abstract Wprowadzenie: Badania mikoserologiczne s¹ cennym uzupe³nieniem diagnostyki grzybic uk³adowych. Cel pracy: Porównanie trzech metod serologicznych stosowanych w rutynowej diagnostyce inwazyjnej kandydozy odczynu hemaglutynacji poœredniej, odczynu immunoprecypitacji w elu i odczynu lateksowego oraz próba oceny przydatnoœci tych i innych metod serologicznych w diagnostyce grzybic g³êbokich wywo³ywanych przez grzyby z rodzaju Candida. Materia³ i metody: Na materiale 1086 surowic od pacjentów z podejrzeniem grzybicy narz¹dowej lub uogólnionej wykonano testy: hemaglutynacji poœredniej (IHA), odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ) oraz odczyn lateksowy (OL). Wyniki: Uzyskano dodatni odczyn IHA w 43,9% badanych surowic, odczyn OP w 7,46% i odczyn OL w 6,91%. Porównano wyniki w³asne z danymi w piœmiennictwie œwiatowym. Omówiono równie metody diagnostyczne dotychczas nie stosowane w Polsce. Wnioski: 1) W badaniu stwierdzono du ¹ rozbie noœæ wyników uzyskiwanych w odczynie hemaglutynacji poœredniej (IHA) i odczynie immunoprecypitacji w elu (OP ), ) Zaobserwowano wy sz¹ czu³oœæ IHA w porównaniu z OP, 3) Surowicom dodatnim w odczynie Pastorex Candida towarzyszy³y niskie miana przeciwcia³ anty-candida w odczynie IHA. S³owa kluczowe: Candida, kandydoza, antygen, przeciwcia³o, mikoserologia Introduction: Mycoserological tests are valuable contribution to systemic mycoses diagnostics. Objective: A comparison of three serological methods used in routine diagnostics of invasive candidiasis: indirect haemagglutination test, gel immunoprecipitation test, and latex agglutination test, and assessment of the usefulness of those and other methods in the diagnostics of deep candidiasis. Materials and methods: Three tests were performed with 1086 serum samples collected from patients suspected of systemic or generalized mycosis: indirect haemagglutination test, gel immunoprecipitation test and latex test. Results: The haemagglutination test was positive in 43.9% of the serum samples, immunoprecipitation test in 7.46% of them, and latex agglutination test in 6.91%. The findings were compared with those reported in international literature. Moreover, diagnostic procedures, not in use in Poland yet, are discussed. Conclusions: 1) In the study we observed a big divergence of the indirect haemagglutination test results and gel immunoprecipitation test results, ) The results indicate that indirect haemagglutination test is more sensitive than gel immunoprecipitation test, 3) The antigen-positive patients in Pastorex Candida had lower Candida antibody titres in the indirect haemagglutination test. Key words: Candida, candidiasis, antigen, antibody, mycoserology Wprowadzenie Brak charakterystycznych objawów infekcji grzybiczych sprawia, e ich rozpoznanie na podstawie wywiadu i objawów klinicznych jest bardzo trudne. Wczesna i precyzyjna diagnostyka mikologiczna ma istotne znaczenie, poniewa umo liwia szybkie wdro enie w³aœciwego leczenia, a tym samym zmniejszenie liczby powik³añ i œmiertelnoœci w nastêpstwie infekcji grzybiczych (1, ). Liczne problemy zwi¹zane z diagnostyk¹ kliniczn¹ i mikrobiologiczn¹ inwazyjnej kandydozy oraz wzrastaj¹ca czêstoœæ tych infekcji, przyczyni³y siê do rozwoju testów serologicznych opartych na wykrywaniu antygenów Candida oraz przeciwcia³ skierowanych przeciwko tym antygenom (1, 3). Mimo i, procedura wykonania testów serologicznych z regu³y nie jest skompli- Adres do korespondencji: Prof. dr hab. n. med. Anna B. Macura Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ ul. Czysta 18, Kraków tel.: wew. 47, mbmacura@cyf-kr.edu.pl kowana, to interpretacja wyników w przypadku grzybicy narz¹dowej sprawia czêsto wiele trudnoœci zwi¹zanych zarówno z charakterystyk¹ populacji chorych (pacjenci z obni on¹ odpornoœci¹, których uk³ad odpornoœciowy czêsto nie jest w stanie wytworzyæ wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej), jak równie z cechami drobnoustrojów wywo³uj¹cych te infekcje (pokrewieñstwo antygenowe miêdzy ró nymi gatunkami grzybów oraz grzybami i bakteriami) (, 3). Dodatkow¹ trudnoœci¹ w przypadku infekcji wywo³anych przez grzyby z rodzaju Candida jest koniecznoœæ odró nienia zwyk³ej kolonizacji b³on œluzowych (zw³aszcza w przypadku Candida albicans) od inwazji tkanek i kandydemii wymagaj¹cych leczenia przeciwgrzybiczego (1-3). W ci¹gu ostatnich lat dokonano znacznego postêpu zwi¹zanego z popraw¹ czu³oœci i swoistoœci testów serologicznych wykonywanych w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy. By³o to mo liwe zarówno dziêki dok³adniejszemu poznaniu budowy wielu istotnych klinicznie antygenów Candida (m.in. mannan, glukan, enolaza, arabinitol), jak równie usprawnieniu techniki wykonywanych badañ. Wykrycie antygenów kr¹ ¹cych Candida i okreœlenie ich miana, w korelacji z objawa- 179

2 180 mi klinicznymi, mo e równie s³u yæ do monitorowania skutecznoœci terapii przeciwgrzybiczej (1-3). Nadal jednak rozpoznanie inwazyjnej kandydozy na podstawie wyniku pojedynczego badania nie jest mo liwe. Testy serologiczne powinny byæ traktowane jako badania pomocnicze, a ostateczna diagnoza inwazyjnej kandydozy powinna opieraæ siê na analizie wielu informacji z wywiadu chorobowego, objawów klinicznych oraz badañ pomocniczych (3). Cel pracy Celem pracy by³o porównanie trzech metod serologicznych stosowanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w rutynowej diagnostyce inwazyjnej kandydozy odczynu hemaglutynacji poœredniej, odczynu immunoprecypitacji w elu i odczynu lateksowego. Pracê zilustrowano zestawieniem wyników badañ mikoserologicznych prowadzonych tymi metodami w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie w latach Dodatkowo, powo³uj¹c siê na dane literaturowe, podjêto próbê oceny przydatnoœci tych i innych metod serologicznych w diagnostyce grzybic g³êbokich wywo³ywanych przez grzyby z rodzaju Candida. Materia³ i metody W Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach przebadano 1086 surowic pochodz¹cych od pacjentów szpitalnych, g³ównie z Kliniki Hematologii, Kliniki Pulmonologii, Kliniki Chorób ZakaŸnych oraz z Uniwersyteckiego Szpitala Dzieciêcego, u których podejrzewano grzybicê narz¹dow¹ b¹dÿ uogólnion¹. Pacjenci ambulatoryjni stanowili niewielki odsetek badanych. W surowicy pacjentów oznaczono swoiste przeciwcia³a anty-candida oraz kr¹ ¹cy antygen grzyba stosuj¹c trzy powszechnie znane odczyny serologiczne: odczyn hemaglutynacji poœredniej Hemkit Candida IHA (ravo Diagnostika GmbH, Niemcy), odczyn immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji oraz odczyn lateksowy Pastorex Candida (Bio-Rad, Francja). Odczyn hemaglutynacji poœredniej (IHA) oraz odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ) pos³u y³y do wykrywania swoistych przeciwcia³ anty-candida w surowicy pacjentów. W teœcie IHA krwinki czerwone barana (SRBC) uczulone sk³adnikami œciany komórkowej grzyba C. albicans o serotypie A aglutynuj¹ w obecnoœci swoistych przeciwcia³ anty-candida znajduj¹cych siê w badanych surowicach. Uczulone SRBC reaguj¹ z trzema klasami przeciwcia³ IgM, IgG i IgA oraz w niektórych przypadkach tak e z kompleksami antygen przeciwcia³o. Reakcjê pozytywn¹ uzyskuje siê nie tylko dla gatunku C. albicans, ale równie dla innych gatunków z rodzaju Candida, takich jak: C. tropicalis, C. parapsilosis i C. glabrata. Wymienione gatunki grzybów z rodzaju Candida wykazuj¹ podobieñstwo antygenowe w stosunku do gatunku C. albicans. Miano przeciwcia³ w badanej próbce wyznacza siê w stosunku do kontroli negatywnej zawieraj¹cej nieuczulone SRBC. Za wartoœæ znamienn¹ diagnostycznie przyjmuje siê miano >1:160. Drugim testem, zastosowanym do wykrywania przeciwcia³ anty-candida, by³ odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ). Odczyn ten wykonuje siê na szkie³kach podstawowych pokrytych 3 ml % agaru Noble z dodatkiem mertiolatu. W elu za pomoc¹ szablonu wycina siê otwory o sta³ej œrednicy 6 mm, pozostaj¹ce ze sob¹ w okreœlonej odleg³oœci. Do otworów podaje siê równe objêtoœci antygenu wzorcowego C. albicans (antygen metaboliczny firmy Bio-Rad, Francja) oraz badanej surowicy. Szkie³ka umieszcza siê w komorze wilgotnej, w cieplarce w 37ºC na dwie doby. Obecne w surowicy swoiste przeciwcia³a przeciwko antygenowi Candida oraz antygen wzorcowy Mikologia Lekarska 007, 14 (3) dyfunduj¹ w elu w przeciwnych kierunkach, tworz¹c w strefie ekwiwalencji usieciowane kompleksy antygen przeciwcia³o widoczne w elu w postaci linii precypitacyjnych. W celu lepszego uwidocznienia linii el mo na dodatkowo wybarwiæ czerni¹ amidow¹. Pojawienie siê ciemno zabarwionej linii miêdzy otworami dla antygenu i badanej surowicy œwiadczy o dodatnim wyniku badania mikoserologicznego. Testem u ytym do oznaczania kr¹ ¹cego antygenu grzybów z rodzaju Candida by³ odczyn lateksowy Pastorex Candida (OL) wykrywaj¹cy mannan antygen polisacharydowy œciany komórkowej grzyba. Test oparty jest na reakcji aglutynacji cz¹stek lateksu op³aszczonych szczurzym przeciwcia³em monoklonalnym EBCA-1 z fragmentem 1--oligomannozydowym œciany komórkowej grzybów z rodzaju Candida. Powsta³e aglutynaty lateks-(ebca-1)-mannan widoczne s¹ makroskopowo w postaci bia³ych k³aczków. Reakcja dodatnia obserwowana jest dla nastêpuj¹cych gatunków grzybów z rodzaju Candida: C. glabrata, C. guilliermondii, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, a tak e C. dubliniensis, C. lusitaniae, C. famata (3). Wyniki Wyniki testów mikoserologicznych wykrywaj¹cych obecnoœæ swoistych przeciwcia³ anty-candida (odczyn IHA oraz OP ) oraz antygenów polisacharydowych œciany komórkowej grzybów z rodzaju Candida (OL) przeprowadzonych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w okresie przedstawiaj¹ tabele I, II i III. W celu syntezy wyników uzyskanych z poszczególnych lat dokonano analizy zbiorczej metod¹ metaanalizy. ¹cznie w latach wykonano 1086 oznaczeñ mikoserologicznych. W teœcie IHA uzyskano 477 (43,9%) dodatnich wyników, dla których miana przeciwcia³ anty-candida okreœlono na poziomie >1:160. Wœród 477 surowic dodatnich w teœcie IHA 1 surowic (4,1%) wykazywa³o miana równe 1:30, 143 surowice (30,0%) miana 1:640, natomiast 119 surowic (4,9%) miana 1:180 (tab. I i II). Za pomoc¹ odczynu OP przeciwcia³a anty-candida wykryto tylko w 81 surowicach (7,46%). Liczba dodatnich wyników w OP by³a wobec tego prawie szeœciokrotnie ni sza ni liczba dodatnich odczynów IHA. Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie OP (40 dodatnich wyników 49,4%) obserwowano przy wysokich mianach surowicy ( 1:640) w teœcie IHA. W mianie 1:30 tylko 13 surowic (16,0%) dawa³o linie precypitacyjne w OP, natomiast w mianie 1:160 by³o ich 8 (34,6%). Sumarycznie za pomoc¹ odczynów OP i IHA przeciwcia³a anty-candida stwierdzono w 8 próbkach surowicy, czyli w ponad po³owie wszystkich wykonanych badañ (1,4%). W przypadku 18 surowic (1,66%) odczyt odczynu OP by³ niejednoznaczny i trudny do interpretacji (linie precypitacyjne praktycznie niewidoczne makroskopowo). Wyniki te zaklasyfikowano jako w¹tpliwe (tab. I i II). Antygen mannanowy wykrywany by³ znacznie rzadziej ni przeciwcia³a anty-candida, poniewa tylko w 7 badanych surowicach (6,91%). Surowic maj¹cych równoczeœnie dodatni odczyn OL oraz OP by³o zaledwie 7 (0,64%), natomiast surowic wykazuj¹cych dodatnie odczyny OL i IHA by³o 31 (,8%). Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie lateksowym (44 odczyny dodatnie 8,7%) zaobserwowano dla niskich mian przeciwcia³ ( 1:160) w teœcie IHA. W mianie 1:30 w odczynie IHA mannano-dodatnich surowic by³o 13 (17,3%), a w mianie 1: surowic (4,0%). W odczynie OL uzyskano 9,3% wyników ujemnych (100 surowice mannano-ujemne) oraz 0,83% wyników w¹tpliwych (9 surowic), dla których obserwowano œladow¹ aglutynacjê (tab. I i II).

3 Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy Tabela I: Wyniki badañ mikoserologicznych surowicy pacjentów z podejrzeniem inwazyjnej kandydozy wykonanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach Table I: Results of mycoserological tests in the serum of patients suspected of invasive candidiasis performed at the Dept. of Mycology, Chair of Microbiology CMUJ in the years Rok Year Liczba badañ Number of tests Liczba dodatnich odczynów serologicznych Number of positive serological tests Liczba ujemnych/w¹tpliwych* odczynów serologicznych Number of negative/doubtful* serological tests IHA OP OL IHA OP OL ,7% 7/0 48,3/0,00% 144/0 96,4/0,00% 141/3 94,6/,01% ,6% 1 11,4% 13,% 97/0,4/0,00% 19/ 8,9/,70% 18/ 8,4/1,08% ,6% 9,3% 8 3,40% 133/0 6,4/0,00% 08/6 88,1/,4% 6/ 9,8/0,8% ,3% 19 7,17% 1,89% 14/0 4,7/0,00% 44/ 9,1/0,7% 60/0 98,1/0,00% ,% 14,8% 3 1,7% 16/0 64,/0,00% 3/ 9,4/1,99% 17/ 86,/0,80% ,9% 81 7,46% 7 6,91% 609/0 6,1/0,00% 987/18 90,9/1,66% 100/9 9,3/0,83% 8 1,4% IHA odczyn hemaglutynacji poœredniej / indirect haemagglutination test, OP odczyn precypitacji w elu / gel immunoprecipitation test, OL odczyn lateksowy latex agglutination test, * wyniki w¹tpliwe; dotyczy odczynów OP i/lub OL / doubtful OP and/or OL tests results Tabela II: Porównanie liczby dodatnich wyników odczynów OP i OL oraz wyników odczynu IHA uzyskanych w latach Table II: Comparison of the number of positive OP, OL tests results and IHA test results obtained in the years Rok Year Liczba badañ Number of tests Liczba dodatnich odczynów Number of positive tests results IHA OP OL 1:80 1:160 1:30 1:640 1: ,8% 41 7,% 33,1% 3 1,4% 1 14,1% ,0% 36 19,% 36 19,% 8 1,1% 4 13,0% 1 11,4% 13,% ,% 4,9%,0% 6 11,0% 10,6% 9,3% 8 3,40% ,6% 64 4,% 9,3% 3 1,1% 9 10,9% 19 7,17% 1,89% ,9% 87 34,7% 3 13,9% 34 13,% 0 7,97% 14,8% 3 1,7% ,1% 8 6,0% 1 19,8% ,% ,0% 81 7,46% 7 6,91% 609 6,1% ,9% IHA odczyn hemaglutynacji poœredniej / indirect haemagglutination test, OP odczyn precypitacji w elu / gel immunoprecipitation test, OL odczyn lateksowy / latex agglutination Tabela III: Zestawienie dodatnich, ujemnych oraz w¹tpliwych wyników oznaczeñ mikoserologicznych uzyskanych w latach Table III: Combination of positive, negative and doubtful mycoserological tests results performed in the years Odczyny z C. albicans Tests with C. albicans 00 N= N= N=36 00 N=6 006 N=1 Surowice wykazuj¹ce przynajmniej jeden odczyn dodatni,7% 6,8% 48,3% 48,7% 4,4% Serum with at least one test positive Surowice wykazuj¹ce wszystkie odczyny ujemne Serum with all of the tests negative Surowice wykazuj¹ce odczyn w¹tpliwy* Serum with doubtful test* 64 43,0% 1,34% 78 4,% 1,08% ,6%,1% 13 0,9% 1 0,38% N liczba badañ / number of tests, * wyniki w¹tpliwe; dotyczy odczynów OP i/lub, OL / doubtful OP and/or OL tests results 13 3,8% 0,80% N= ,% 9 48,7% 1 1,10% Wœród wszystkich przebadanych surowic (1086) 4 czyli nieco wiêcej ni po³owa (0,%) wykazywa³a przynajmniej jeden odczyn dodatni na trzy wykonywane dla ka dej surowicy, natomiast 9 (48,7%) posiada³o wszystkie trzy odczyny ujemne. Tylko w 3 surowicach (0,8%) zaobserwowano wszystkie trzy odczyny dodatnie OP, OL oraz IHA w mianie 1:30 (tab. II). Dyskusja W zwi¹zku z wprowadzeniem do lecznictwa inwazyjnych metod diagnostycznych, leków dzia³aj¹cych immunosupresyjnie, a tak e agresywnych metod leczenia nowotworów (chemioterapii i radioterapii), rola grzybów jako czynników etiolo- 181

4 18 gicznych zaka eñ znacznie wzros³a w ci¹gu ostatnich 40 lat. Wed³ug analiz przeprowadzonych w Stanach Zjednoczonych inwazyjna kandydoza stanowi g³ówn¹ przyczynê zgonów spowodowanych infekcjami grzybiczymi (1, 4), a grzyby z rodzaju Candida s¹ czwartym co do czêstoœci czynnikiem etiologicznym zaka eñ krwi (). W celu rozpoznania grzybic inwazyjnych wykorzystuje siê nastêpuj¹ce metody diagnostyczne: ocenê obecnoœci grzybów w materiale klinicznym (hodowla, badanie bezpoœrednie), metody serologiczne wykrywaj¹ce obecnoœæ antygenów grzybów, swoistych przeciwcia³ przeciwgrzybiczych oraz kompleksów antygen przeciwcia³o, metody biologii molekularnej (PCR, RFLP), badanie histologiczne wycinków tkanek oraz badania obrazowe (badanie rentgenowskie, tomografia komputerowa) (6, 7). 1. Testy serologiczne wykrywaj¹ce przeciwcia³a Testy serologiczne wykrywaj¹ce przeciwcia³a przeciwko antygenom Candida s¹ istotne szczególnie w zaka eniach o przewlek³ym przebiegu (). Interpretacja wyników tych testów mo e jednak nastrêczaæ wiele trudnoœci w zwi¹zku z koniecznoœci¹ odró nienia bezobjawowej kolonizacji b³on œluzowych od inwazyjnej kandydozy. Dodatkowym ograniczeniem w przypadku badañ serologicznych wykrywaj¹cych przeciwcia³a jest czêstsze wystêpowanie upoœledzenia odpornoœci w przypadku pacjentów z inwazyjn¹ kandydoz¹. Uk³ad immunologiczny tych pacjentów nie jest w stanie wytworzyæ wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej (1-3). Wa nym wyj¹tkiem jest tutaj zapalenie wsierdzia wywo³ane przez Candida sp. Poziom przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida w tej grupie pacjentów jest bardzo czêsto wysoki i omawiane badania serologiczne maj¹ w ich przypadku wartoœæ diagnostyczn¹ (1). Testy wykrywaj¹ce obecnoœæ przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida s¹ wykorzystywane równie w celu oceny prognozy choroby. Obserwacja spadaj¹cego miana przeciwcia³ jest istotnym pozytywnym czynnikiem prognostycznym, natomiast ca³kowity brak przeciwcia³ przeciwko Candida, przy obecnoœci objawów klinicznych inwazyjnej kandydozy, najczêœciej wi¹ e siê z niekorzystnym rokowaniem. Zjawisko to wynika ze znacznego upoœledzenia odpornoœci pacjenta lub ze zu ycia przeciwcia³ (wytr¹canie siê kompleksów immunologicznych) (1). Do metod wykorzystywanych w testach serologicznych wykrywaj¹cych obecnoœæ przeciwcia³ nale ¹: odczyn immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji (OP ), immunoelektroforeza przeciwstawna (CIE), metody immunoenzymatyczne (EIA) oraz odczyn hemaglutynacji (, 8, 9). W naszych badaniach pos³u yliœmy siê odczynem hemaglutynacji poœredniej (IHA) oraz odczynem immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji (OP ). Literatura podaje ró ne wartoœci czu³oœci i swoistoœci odczynu IHA. Bisbe i wsp. okreœlili czu- ³oœæ na poziomie 97% i swoistoœæ na poziomie 60% (8). Wysoka czu³oœæ testu IHA pojawi³a siê tak e w badaniach Petriego i wsp. (czu³oœæ 88%), przy czym swoistoœæ by³a bardzo niska (6%) (10). Bär i Hecker uzyskali odmienne wyniki wy sze wartoœci swoistoœci (8,7%) w stosunku do czu³oœci (,9%). Wyznaczona przez nich dodatnia wartoœæ predykcyjna testu wynios³a 60% a ujemna wartoœæ predykcyjna 81,8% (11). Jak podaj¹ Ÿród³a, u ytecznoœæ odczynu podwójnej immunodyfuzji w elu w diagnozowaniu kandydemii jest ograniczona, bowiem test ten cechuje siê nisk¹ czu³oœci¹ i stosunkowo wysok¹ swoistoœci¹ (1, 13). Pallavicini i wsp. okreœlili czu³oœæ tej metody na poziomie 9%, natomiast swoistoœæ okaza³a siê byæ ponad dwukrotnie wy sza 67%. Wyznaczona w tym badaniu dodatnia wartoœæ predykcyjna testu wynosi³a 1%, a ujemna wartoœæ predykcyjna 8% (14). Analizuj¹c powy sze parametry mo na wnioskowaæ, i odczyn podwójnej dyfuzji w elu jest bardziej przydatny do wykluczenia kandydozy ni do jej potwierdzenia. Mikologia Lekarska 007, 14 (3) W przeprowadzonych przez nas badaniach przeciwcia³a anty-candida wykrywane by³y prawie szeœciokrotnie czêœciej w odczynie IHA ni w odczynie OP (odpowiednio 43,9% i 7,46%). Dodatnie wyniki w odczynie OP uzyskiwano g³ównie (49,4%) w przypadku surowic z wysokimi mianami przeciwcia³ w odczynie IHA ( 1:640). Korelacja dodatnich wyników uzyskiwanych w IHA oraz OP by³a niewielka, poniewa tylko 3 surowice na 8 (9,%), w których stwierdzono obecnoœæ przeciwcia³ anty-candida, wykazywa³y równoczeœnie dodatnie odczyny IHA (miano >1:160) i OP. Jednym z najczêœciej wykonywanych badañ jest ocena obecnoœci przeciwcia³ anty-mannan przy u yciu metody immunoenzymatycznej (EIA). Stosunkowo wysok¹ czu³oœæ i swoistoœæ tej metody (odpowiednio 3 i 94%) wykazano w badaniu klinicznym przeprowadzonym na grupie pacjentów z kandydoz¹ potwierdzon¹ hodowl¹ grzybów z materia³ów klinicznych (1). W badaniu przeprowadzonym przez Persat i wsp. wartoœæ diagnostyczna EIA by³a ni sza. Czu³oœæ i swoistoœæ ró nych dostêpnych testów komercyjnych (Platelia, Virotech GmbH, Biomerica ) mieœci³a siê w przedziale 9-90,9% i 18,4-63,1% odpowiednio (16).. Testy serologiczne wykrywaj¹ce antygeny Badania serologiczne wykrywaj¹ce antygeny kr¹ ¹ce grzybów z rodzaju Candida s¹ szczególnie istotne w przypadku pacjentów z obni on¹ odpornoœci¹ oraz chorych, u których infekcja ma przebieg ostry. Testy te maj¹ znaczenie nie tylko diagnostyczne, lecz równie w przypadku okreœlenia miana wykrytego antygenu oraz w korelacji z obrazem klinicznym choroby mog¹ s³u yæ do monitorowania skutecznoœci leczenia. Do metod badawczych wykorzystywanych w mikoserologii do oznaczania kr¹ ¹cych antygenów grzybów nale ¹: aglutynacja lateksowa (LA), metoda immunoenzymatyczna (EIA), immunoblotting, dot immunoassay, liposomal immunoassay oraz metody radioimmunologiczne (radioimmunoassay RIA) (1-3). Wœród antygenów wykrywanych w omawianych testach w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy mo na wymieniæ: mannan, mannoproteiny, glukan, bia³ka szoku cieplnego (hsp90), enolazê, kwaœn¹ proteazê oraz inne antygeny cytoplazmatyczne, jak równie antygeny œciany komórkowej (3, 17). Mannan wystêpuje w osoczu g³ównie w postaci kompleksów immunologicznych szybko usuwanych przez w¹trobê i nerki, st¹d stê enie tego antygenu w osoczu jest bardzo niskie. Dodatkowe trudnoœci diagnostyczne w przypadku testów wykrywaj¹cych mannan sprawiaj¹ ró nice antygenowe miêdzy poszczególnymi gatunkami Candida. Badania opracowane dla C. albicans mog¹ nie wykrywaæ obecnoœci mannanu C. glabrata czy C. krusei (1, 3, 17). Wykrywalne stê enia mannanu w p³ynach ustrojowych pacjentów z inwazyjn¹ kandydoz¹ wyprzedzaj¹ pojawienie siê przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida o 1-3 tygodni (3). W przebiegu niektórych grzybic narz¹dowych stê enia mannanu mog¹ byæ jednak niewykrywalne. Fa³szywie ujemne wyniki w przypadku tego antygenu najczêœciej obserwowane s¹ w przebiegu kandydozy w¹trobowo-œledzionowej, grzybiczego zapalenia wsierdzia czy wewnêtrznego zapalenia ga³ki ocznej (endopthalmitis) (1, 3). Natomiast wysokie stê enie mannanu w p³ynie mózgowo-rdzeniowym obserwowano w przebiegu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wywo³anego przez grzyby z rodzaju Candida (3). Do metod badawczych wykorzystywanych w celu wykrywania obecnoœci mannanu nale ¹ EIA (enzyme immuno assay) (ICON Candida Assay system, Hybritec, USA) oraz aglutynacja lateksowa (RPLA: LA-Candida Antigen Detection System, Immuno Mycologics, USA; Pastorex Candida, Sanofi Pasteur, Francja). W naszych badaniach zastosowaliœmy odczyn lateksowy (OL) (Pastorex Candida, Bio-Rad, Francja). Test ten by³ dodatni

5 Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy w zaledwie 6,91% badanych surowic, co mo e wynikaæ z przejœciowego charakteru antygenemii. Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie lateksowym zaobserwowano dla niskich mian przeciwcia³ w teœcie IHA. Podobne wyniki otrzymali Bär i Hecker w badaniach nad uogólnion¹ kandydoz¹ u pacjentów z oddzia- ³ów intensywnej terapii. Naukowcy ci wykazali, i pacjenci, u których wykryto antygen Candida, mieli ni sze miana przeciwcia³ anty-candida w surowicy (œrednio 1:160) w porównaniu z pacjentami antygeno-negatywnymi (œrednie miana przeciwcia³ 1:180) (11). Swoistoœæ testu lateksowego Pastorex Candida, jak podaje producent (Bio-Rad, Francja), wynosi 99,7%. Inne Ÿród³a podaj¹ porównywalne, wysokie wartoœci swoistoœci (100%) (18). Czu³oœæ testu wyznaczona przez Herenta i wsp. wynios³a,6%, przy czym wartoœæ ta wzrasta³a wraz z liczb¹ próbek surowicy pobranych od danego pacjenta z podejrzeniem inwazyjnej kandydozy. Po ominiêciu w badaniu pacjentów, którym pobrano tylko jedn¹ lub dwie próbki surowicy, czu³oœæ testu wzros³a do 76,9% (18). W przypadku metod immunoenzymatycznych swoistoœæ testów jest wysoka, natomiast ich czu³oœæ waha siê miêdzy 3 i 90% (). Wœród czynników wp³ywaj¹cych na tak du ¹ rozbie - noœæ wyników wymieniane s¹: jakoœæ wykorzystywanych odczynników, gatunek Candida wywo³uj¹cy zaka enie, stan pacjenta, czêstoœæ wykonywanych badañ oraz czas pobrania krwi do badania w korelacji z nasileniem objawów chorobowych. W badaniach klinicznych, w których testy immunoenzymatyczne wykonywano wielokrotnie u ka dego pacjenta oraz w przypadku, gdy próbki krwi pobierano w najciê szym etapie choroby, obserwowano wysok¹ czu³oœæ metod immunoenzymatycznych. Czu³oœæ komercyjnych testów lateksowych wykrywaj¹cych mannan jest ni sza od EIA. W badaniu porównuj¹cym obie te metody wykorzystano odczynniki zawieraj¹ce mannan C. albicans i C. krusei. Wyniki dodatnie badania w przypadku metody immunoenzymatycznej obserwowano w 74% przypadków, natomiast czu³oœæ metody lateksowej wynios³a tylko 38% (). Wyniki badañ opublikowanych w miêdzynarodowym piœmiennictwie potwierdzaj¹ du ¹ przydatnoœæ testów serologicznych w ustaleniu diagnozy inwazyjnej grzybicy wywo³anej przez grzyby dro d opodobne nale ¹ce do rodzaju Candida, jak równie w monitorowaniu skutecznoœci leczenia przeciwgrzybicznego inwazyjnej kandydozy, szczególnie w przypadku wielokrotnego ich wykonania. W przypadku testów wykrywaj¹cych kr¹ ¹ce antygeny grzybów z rodzaju Candida nale y pamiêtaæ o pewnych ograniczeniach tych testów zwi¹zanych g³ównie z przejœciowym charakterem antygenemii czy ró nicami gatunkowymi miêdzy poszczególnymi przedstawicielami rodzaju Candida. Trudnoœci w interpretacji wyników testów wykrywaj¹cych przeciwcia³a anty-candida wystêpuj¹ przede wszystkim w przypadku osób z upoœledzon¹ odpornoœci¹ (pacjenci z zaburzon¹ produkcj¹ immunoglobulin), które stanowi¹ najwiêksz¹ grupê pacjentów poddawanych badaniom mikoserologicznym.. Zaobserwowano wy sz¹ czu³oœæ IHA w porównaniu z OP. 3. Surowicom dodatnim w odczynie Pastorex Candida towarzyszy³y niskie miana przeciwcia³ anty-candida w odczynie IHA. Piœmiennictwo 1. Matthews R., Burnie J.: Mycoserology. [w:] Microbiology and microbial infections. vol. IV Medical Mycology. red. L. Collier, A. Balows, M. Sussman, vol. ed. L. Ajello, R.J. Hay, wyd. Arnold, Londyn, 1998, Ochman E.: Diagnostyka mikrobiologiczna i serologiczna uk³adowych zaka eñ grzybiczych. [w:] Zaka enia grzybicze wybrane zagadnienia. red. D. Dzier anowska, wyd. -medica press, Bielsko Bia³a, 006, Quindos G., Moragues M.D., Ponton J.: The role of antygen and antibody testing in the diagnosis of invasive candidiasis. Mikol. Lek. 004, 11, Pfaller M.A., Diekema D.J.: Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev., 007, 0, Marr K.A.: Invasive Candida infections: the changing epidemiology. Oncology (Williston Park), 004, 18, Budak A.: Diagnostyka serologiczna grzybic. [w:] Zarys Mikologii Lekarskiej. red. E. Baran, wyd. Volumed, Wroc³aw, 1998, Budak A., Macura A.B., Pawlik B.: Diagnostyka mykologiczna. Diagnostyka serologiczna grzybic. [w:] Mikrobiologia lekarska. red. P.B. Heczko, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagielloñskiego, Kraków, 1999, Bisbe J., Miro J.M., Torres J.M., Latorre X., Alia C., Amaral M., Estivill D., Mallolas J., Trilla A., Soriano E.: Diagnostic value of serum antybody and antigen detection in heroin addicts with systemic candidiasis. Rev. Infect. Dis., 1989, 11, Ibanez-Nolla J., Torres-Rodriguez J.M., Nolla M., Leon M.A., Mendez R., Soria G., Diaz R.M., Marrugat J.: The utility of serology in diagnosing candidosis in non-neutropenic critically ill patients. Mycoses, 001, 44, Petri M.G., Konig J., Moecke H.P., Gramm H.J., Barkow H., Kujath P., Dennhart R., Schafer H., Meyer N., Kalmar P., Thulig P., Muller J., Lode H.: Epidemiology of invasive mycosis in ICU patients: prospective multicenter study in 43 non-neutropenic patients. Paul-Ehrlich Society for Chemotherapy, Divisions of Mycology and Pneumonia Research. Intensive Care Med., 1997, 3, Bär W., Hecker H.: Diagnosis of systemic Candida infections in patients of the intensive care unit. Significance of serum antigens and antibodies. Mycoses, 00, 4, Chakrabarti A., Roy P., Kumar D., Sharma B.K., Chugh K.S., Panigrahi D.: Evaluation of three serological tests for detection of anti-candidal antibodies in diagnosis of invasive candidiasis. Mycopathologia, 1994, 16, Freidank H., Thiel L., Henninger S.: Comparison of immunodiffusion and counterimmunoelectrophoresis for the detection of precipitating antibodies against Candida and Aspergillus antigens. Mycoses, 1994, 37 Suppl.1, Pallavicini F., Izzi I., Pennisi M.A., Morace G., Portaccio G.G., Bello G., Iodice F., Godino D., Del Borgo C., Proietti R.: Evaluation of the utility of serological tests in the diagnosis of candidemia. Minerva Anestesiol., 1999, 6, Sendid B., Tabouret M., Poirot J.L., Mathieu D., Fruit J., Poulain D.: New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, Persat F., Topenot R., Piens M.A., Thiebaut A., Dannaoui E., Picot S.: Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidosis. Mycoses, 00, 4, Matthews R.C.: Comparative assessment of the detection of candidal antigens as a diagnostic tool. Med. Mycol., 1996, 34, Herent P., Stynen D., Hernando F., Fruit J., Poulain D.: Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol., 199, 30, Wnioski 1. W badaniu stwierdzono du ¹ rozbie noœæ wyników uzyskiwanych w odczynie hemaglutynacji poœredniej (IHA) i odczynie immunoprecypitacji w elu (OP ). Praca wp³ynê³a do Redakcji: Zaakceptowano do druku: