Zastosowanie metody PCR-DGGE w mikrobiologii sądowej

Transkrypt

1 dr hab. Aleksandra Ziembińska-Buczyńska, doktor, adiunkt (autor korespondencyjny) inż. Krzysztof Kraśnicki, inżynier, student Politechnika Śląska, Katedra Biotechnologii Środowiskowej Zastosowanie metody PCR-DGGE w mikrobiologii sądowej Streszczenie W oparciu o najnowsze doniesienia mikrobiologii sądowej możliwe jest powiązanie sprawcy z dowodem w postępowaniu śledczym na podstawie analizy molekularnej materiału mikrobiologicznego. Wiadomo, że występujący na powierzchni naskórka człowieka mikrobiom jest nie tylko gatunkowo, ale i osobniczo specyficzny. Korzystając z tej informacji, można powiązać użytkownika danego przedmiotu (np. urządzenia elektronicznego) z takim sprzętem poprzez naniesiony w trakcie użytkowania, właściwy tylko danemu użytkownikowi, specyficzny mikrobiom. Korzystając z metod opartych na tzw. genetycznym odcisku palca (DNA fingerprinting) zbiorowiska bakterii, porównywano zgodności struktury zbiorowiska mikroorganizmów pobranych z naskórka dłoni oraz obudowy telefonu komórkowego u czternastu uczestników badania. W tym projekcie wykorzystano metodę łańcuchowej reakcji polimerazy z elektroforezą w gradiencie denaturacji PCR-DGGE (ang. Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Uzyskana analiza pozwoliła na otrzymanie wyników wskazujących na wysoką zbieżność struktury genotypowej próbek pochodzących od użytkownika z mikrobiomem pobranym z jego telefonu. Metoda PCR-DGGE może być wykorzystywana jako skriningowa, poprzedzająca dodatkowe analizy potwierdzające. Słowa kluczowe metody biologii molekularnej, PCR-DGGE, DNA fingerprinting, ślad mikrobiologiczny, mikrobiom naskórka Wstęp W nowoczesnej kryminalistyce wykorzystuje się wiele narzędzi badawczych usprawniających procedury śledcze. Wśród takich metod analizy biologicznochemiczne stanowią ważny element. Szereg laboratoriów kryminalistycznych dysponuje aktualnie szerokim wachlarzem narzędzi z zakresu biologii molekularnej do badania śladów biologicznych, czyli śladów związanych z organizmem, jak również od niego pochodzących, które mają związek z przestępstwami (Włodarczyk, 2007). Przedmiotem badań biologii molekularnej są analizy materiału genetycznego wyizolowanego ze śladów w postaci tkanek, wydzielin, płynów ustrojowych, śladów kontaktowych, włosów, jak również oznaczanie profili DNA materiału porównawczego przekazanego do badań (Koczura i Kaznowski, 2012). Biologia molekularna jest również niezmiernie użytecznym narzędziem w badaniach mikrobiologicznych, w tym w mikrobiologii sądowej, jednej z szybko rozwijających się gałęzi badań wykorzystywanych w śledztwie. Głównym jej celem jest ustalenie źródła i drogi rozprzestrzeniania mikroorganizmów (np. w przypadku zakażeń szpitalnych czy też zatruć pokarmowych), oraz analiza dowodów w dochodzeniach na miejscu wystąpienia ataku bioterrorystycznego (Butler, 2005). Kluczowym elementem w procedurach mikrobiologii sądowej jest odpowiednie pobranie materiału w sposób umożliwiający wykorzystanie wyników dochodzenia w śledztwie. Przedmiotem badań mogą być szczepy mikroorganizmów izolowane z różnych powierzchni i materiałów identyfikowane narzędziami biologii molekularnej lub z ich użyciem charakteryzowane (np. w oparciu o profile antybiotykooporności) (Breeze i wsp., 2010). Do badań mikrobiologii sądowej można wykorzystywać zarówno bakterie środowiskowe, pochodzące z próbek np. gleby znajdujących się na dowodach rzeczowych (Lerner i inni, 2006), jak i bakterii pochodzących z naskórka (Fierer i wsp., 2010; Tims i wsp., 2010). Powierzchnia naskórka o wielkości 1 cm 2 u zdrowego człowieka zawiera komórek bakteryjnych, należących głównie do rodzajów: Staphylococcus, Corynebacterium, czy też Propionibacterium. Na ludzkim naskórku występują również grzyby mikroskopowe z rodzaju Candida, PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2)

2 a w mieszkach włosowych stwierdzono występowanie lipofilnych Pityrosporum ovale (Dudkiewicz i wsp., 2014). Ze względu na fakt, że ludzki naskórek jest skolonizowany przez bakterie rezydentnej flory bakteryjnej unikalnej pod względem jakościowym dla gospodarza, a w kontakcie z powierzchnią zostaje na niej unikalny jakościowo ślad mikrobiologiczny (Tims i wsp., 2010), w swoich badaniach Fierer i współpracownicy (2012) wykazali, że mikrobiom naskórka ludzkiego można wykorzystać do identyfikacji podejrzanego oraz do dopasowania przedmiotu użytkowego, będącego dowodem w śledztwie, do jego właściciela. Wiadomo również, że tylko 13% składu bakteryjnego mikrobiocenoz bakteryjnych pobranych z naskórka dwóch przypadkowych osób jest identyczne (Fierer i wsp., 2010), stąd szansa na dopasowanie próbek składu jakościowego zbiorowiska bakteryjnego z naskórka i przedmiotu użytkowego, poddawanego badaniu ze stosunkowo dużym prawdopodobieństwem. Skład ilościowo-jakościowy mikrobiomu naskórka ludzkiego zależy od wielu czynników, w tym od dostępności źródeł pokarmowych wykorzystywanych przez drobnoustroje w postaci różniących się składem jakościowo-ilościowym wydzielin gruczołów łojowych (m. in. glicerydy, fosfolipidy, kwasy tłuszczowe, cholesterol) oraz potowych (m.in. aminokwasy, mocznik, kwas moczowy i mlekowy) czy też keratyny pochodzącej ze złuszczonej warstwy rogowej naskórka (Dudkiewicz i wsp., 2014). Należy więc wziąć pod uwagę czynniki środowiskowe, które mogły mieć wpływ na skład próbki pobranej do badań. Badania mikrobiologii sądowej są oparte w głównej mierze na biologii molekularnej, ponieważ wiadomo, że ponad 99% mikroorganizmów żyjących w środowisku nie można wyizolować metodami hodowlanymi na podłożach bakteriologicznych. Do ich badań służy szeroka gama metod biologii molekularnej opartej na analizach kwasów nukleinowych (DNA i RNA) oraz białek. Pośród metod opartych na technikach biologii molekularnej występuje kilka opartych o tzw. DNA fingerprinting. Są to metody, w wyniku których uzyskuje się tzw. fingerprint, czyli genetyczny odcisk palca bakterii rozdzielony elektroforetycznie wzór prążkowy fragmentów DNA, pochodzących z badanego materiału. Analiza bioinformatyczna takich wzorów prążkowych DNA pozwala na określenie podobieństwa badanych próbek do siebie nawzajem. Najczęściej takie techniki wykorzystuje się do genotypowania czystych kultur bakteryjnych, przykładowo metoda elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (ang. Pulse Field Gel Electrophoresis; PFGE (Tims i wsp., 2010)). Istnieją jednak metody umożliwiające uzyskanie profili (wzorów) prążkowych DNA dla próbki mikroorganizmów całego zbiorowiska bakteryjnego, jakim może być np. próbka środowiskowa gleby, wody lub pobrana z naskórka ludzkiego, bądź powierzchni użytkowej. Przykładem takiej metody jest reakcja łańcuchowa polimerazy w połączeniu z elektroforezą w gradiencie denaturacji (ang. Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; PCR-DGGE) wykorzystana z powodzeniem do badań próbek gleby, będących dowodami w sprawie kryminalnej (Lerner i wsp., 2006). W metodzie tej całkowite DNA bakteryjne, izolowane z próbki środowiskowej (np. próbki gleby lub wymazu z naskórka) stanowi matrycę dla reakcji PCR ze starterami umożliwiającymi amplifikację określonego bakteryjnego genu markerowego. Dla bakterii uniwersalnym markerem molekularnym do identyfikacji, analizy filogenetycznej oraz badań złożoności i różnorodności zbiorowisk bakteryjnych jest gen kodujący 16S rrna (fragment budujący mniejszą podjednostkę rybosomu prokariotycznego). Namnożony w reakcji PCR fragment DNA o jednakowej wielkości dla wszystkich genotypów bakteryjnych w próbce, ale różny pod względem sekwencji DNA ze względu na pochodzenie z różnych bakterii, jest rozdzielany w żelu poliakryloamidowym zawierającym rosnące stężenie czynnika denaturującego mocznika. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego uzyskuje się tzw. fingerprint, czyli wzór prążków DNA odpowiadających poszczególnym genotypom bakteryjnym w próbce. Wzory prążków DNA po obróbce z użyciem oprogramowania bioinformatycznego są porównane, co pozwala określać złożoność badanych zbiorowisk w oparciu o dendrogramy podobieństw próbek lub obliczenie wskaźników podobieństwa (np. współczynnika Dice a). Dodatkową zaletą metody PCR-DGGE jest możliwość wycinania z żelu poliakryloamidowego pojedynczych prążków DNA, które po oczyszczeniu mogą zostać poddane sekwencjonowaniu w celu identyfikacji tego genotypu. Ze względu na stosunkowo stały skład mikrobiomu ludzkiego naskórka i wcześniejsze doniesienia o pozostawianiu na powierzchniach użytkowych unikalnego odcisku bakteryjnego postawiono hipotezę, że można powiązać próbkę pobraną z naskórka ludzkiej dłoni z próbką pobraną z urządzenia mobilnego, które przez tę osobę było używane. Do sprawdzenia tej hipotezy wykorzystano metodę PCR-DGGE, w której uzyskano wzory prążkowe DNA, których struktura została porównana z użyciem oprogramowania bioinformatycznego. Ponadto wśród osób poddanych badaniu przeprowadzono ankietę skonstruowaną w taki sposób, aby wyjaśnić najbardziej prawdopodobne przyczyny różnic w strukturze genotypowej próbek z naskórka i powierzchni użytkowych. Materiały i metody Pobór próbek bakteryjnych Próbki do badań w tym eksperymencie zostały pobrane z naskórka dłoni 14 osób badanych oraz z powierzchni 16 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2) 2016

3 ich telefonów komórkowych. Grupę badaną, mieszaną pod względem płci, stanowiły osoby w wieku lat. Pobór materiału wykonano w sterylnych warunkach za pomocą patyczków wymazowych zwilżonych solą fizjologiczną. Pobrane próbki zawieszano w 0,5 ml sterylnej soli fizjologicznej i intensywnie wytrząsano przez 90 sekund. Następnie wszystkie próbki wirowano w obr./min przez 1 minutę. Jako matrycę do reakcji PCR użyto całego osadu bakterii osiadających na dnie wirowanych probówek. Amplifikacja metodą łańcuchowej reakcji polimerazy PCR i ewaluacja uzyskanych wyników Osad bakteryjny, uzyskany po zwirowaniu 0,5 ml zawiesiny bakteryjnej, został użyty jako materiał do reakcji PCR. Do amplifikacji fragmentu genu kodującego 16S rrna wszystkich bakterii użyto ogólnych starterów bakteryjnych 338f-GC (5 GCCC GCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCGCCTACCGGGAGGCAGCAG 3 ) i 518r (5 ATTACCGCGGCTGCTGG 3 ) (Muyzer i wsp., 1993). Starter 338f-GC ma dodatkowo dołączony tzw. ogon GC, fragment podwyższający temperaturę topnienia amplikonu PCR i uniemożliwiający całkowite rozplecenie nici DNA podczas elektroforezy w gradiencie denaturacji. Amplifikację prowadzono w objętości końcowej 30 µl mieszaniny o następującym składzie: woda dejonizowana, polimeraza 1,5 U polimerazy TAQ Go Flexi (Promega), 1 bufor do polimerazy TAQ Go Flexi 2 mm MgCl 2, 5 pmol/µl starterów (Genomed), 20 pmol/ µl mieszaniny nukleotydów (Promega). Reakcję PCR prowadzono w termocyklerze T-1000 (Bio-Rad) wg następującego profilu temperaturowego: (1) wstępna denaturacja 95 C przez 10 minut, (2) denaturacja 95 C przez 1 minutę, (3) przyłączanie starterów, tzw. annealing 52 C przez 2 minuty, (4) 72 C przez 2 minuty, (5) końcowa elongacja 72 C przez 12 minut. Kroki 2 4 powtarzano 30 razy. Ewaluację produktu PCR prowadzono w 0,8% żelu agarozowym z bromkiem etydyny (10 µl/ml, Promega) w buforze 1 TBE (Tris, boran, EDTA; ph = 7,2) przez 30 minut pod napięciem 80 V. Żele wizualizowano w świetle UV i archiwizowano w systemie Gel Doc (Bio-Rad). Rozdział amplikonów PCR metodą elektroforezy w gradiencie denaturacji DGGE Uzyskane w reakcji PCR amplikony o długości 180 pz zostały rozdzielone w 8% żelu poliakryloamidowym zawierającym gradient czynnika denaturującego 1000 MM R1* R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8* R9 R10* R11 R12 R13 R MM T1* T2* T3 T4 T5* T6 T7 T8* T9* T10* T11 T12 T13 T Ryc 1. Obraz w świetle UV produktów PCR genu kodującego 16S rrna o wielkości 180 pz próbek mikroorganizmów pobranych z dłoni oraz telefonów 14 osób badanych; MM marker masy molekularnej (Promega 1kb DNA Ladder); * reakcję amplifikacji prowadzono do uzyskania wyraźnego produktu; w przypadku próbki nr 10 nie udało się uzyskać amplikonu PCR. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2)

4 R1 T1 R2 T2 R3 T3 R4 T4 R5 T5 R6 T6 Analizę zdjęć żeli po elektroforezie prowadzono z użyciem programu Quantity One 1D Software (BioRad), w oparciu o nią obliczono współczynnik podobieństwa próbek Dice a oraz skonstruowano dendrogramy podobieństw próbek, wykorzystując algorytm najbliższego sąsiada (ang. neighbor joining). Ankietyzacja badanych R7 T1 R8 T8 R9 T9 R11 T11 R12 T12 R13 T14 R14 T14 Aby ułatwić analizę wyników i ustalić ewentualne rozbieżności w uzyskanych wynikach, przeprowadzono ankietę składającą się z 4 pytań zamkniętych (odpowiedź: tak/nie): Pytanie 1. Czy na krótko przed pobraniem wymazu z dłoni myłeś/-łaś ręce? Pytanie 2. Czy na co dzień używasz bakteriobójczego mydła do dezynfekcji rąk? Pytanie 3. Czy jesteś jedynym użytkownikiem swojego telefonu? Pytanie 4. Czy używasz bakteriobójczych chusteczek do czyszczenia telefonu? Ryc. 2. Obraz w świetle UV wzorów prążkowych DNA uzyskanych metodą DGGE uzyskanych po rozdziale fragmentów 180 pz genu kodującego 16S rrna wszystkich bakterii w próbkach. mocznika w zakresie 30 60%. Elektroforezę prowadzono w systemie DCode Mutation Detection System (Bio-Rad) przez 18 godzin pod napięciem 40 V w stałej temperaturze 60 C. Żel po rozdziale barwiono barwnikiem fluorescencyjnym Sybr Gold (1:10 000, Invitrogen) oraz wizualizowano świetle UV i archiwizowano w systemie Gel Doc (Bio-Rad). Wyniki a) b) 14,42 1,35 R4 15,14 T4 4,30 14,48 R5 4,24 17,21 R3 16,23 T1 2,95 17,32 R2 19,10 T2 8,97 9,71 10,98 R6 9,52 4,80 T6 2,49 9,73 34,65 R1 20,62 T5 17,19 T3 W wyniku amplifikacji metodą PCR uzyskano amplikony genu kodującego 16S rrna o długości 180 pz (ryc. 1). W przypadku materiału pobranego od osoby nr 10 nie udało się uzyskać amplikonu PCR, pomimo wielokrotnej amplifikacji i modyfikacji metodyki badań. Próbki te nie były poddawane dalszym procedurom badawczym. Amplikony PCR rozdzielono metodą elektroforezy w gradiencie denaturacji DGGE w zakresie czynnika Ryc. 3. Podobieństwo próbek bakteriologicznych pobranych z naskórka dłoni (R) i z powierzchni telefonów komórkowych (T) 14 osób badanych przedstawione jako dendrogram utworzony w oparciu o algorytm najbliższego sąsiada; a) dendrogram z żelu DGGE dla próbek 1 6; b) dendrogram z żelu DGGE dla próbek 7 14 (w przypadku próbki 10 nie uzyskano amplikonu PCR do rozdziału DGGE). 3,61 1,83 4,51 2,58 6,04 4,22 5,10 5,79 13,31 6,74 9,54 24,08 22,85 10,24 14,23 10,08 16,21 9,79 12,72 14,23 14,40 9,43 10,68 15,42 17,98 T12 R12 R8 T8 T7 R7 R13 T13 T14 R9 T9 T11 R11 R14 18 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2) 2016

5 Tabela 1. Wyniki ankiety dotyczącej osób, od których pobierano próbki do badań, oraz wartości współczynnika podobieństwa Dice a dla analizowanych próbek, obliczone w oparciu o analizę densytometryczną wzorów prążkowych DNA uzyskanych metodą DGGE (na szaro zaznaczono odpowiedzi osób, dla których wykazano wysokie podobieństwa próbek z powierzchni telefonu i naskórka; * dla osoby nr 10 nie uzyskano materiału DNA do badań). Pytanie Ankietowany/a Pytanie 1. Czy na krótko przed pobraniem wymazu z dłoni myłeś/-łaś ręce? Pytanie 2. Czy na co dzień używasz bakteriobójczego mydła do dezynfekcji rąk? Pytanie 3. Czy jesteś jedynym użytkownikiem swojego telefonu? Pytanie 4. Czy używasz bakteriobójczych chusteczek do czyszczenia telefonu? Współczynnik podobieństwa Dice a próbki z naskórka i z powierzchni telefonu Osoba 1 Nie Nie Tak Nie 23,5% Osoba 2 Nie Nie Tak Nie 73,6% Osoba 3 Nie Nie Nie Nie 54,9% Osoba 4 Nie Nie Tak Nie 70,4% Osoba 5 Nie Nie Nie Nie 43,6% Osoba 6 Tak Nie Tak Nie 81,5% Osoba 7 Nie Nie Tak Nie 77,5% Osoba 8 Nie Nie Tak Nie 73,7% Osoba 9 Nie Nie Tak Nie 79,9% Osoba 10* Nie Nie Nie Nie - Osoba 11 Nie Nie Tak Nie 76,6% Osoba 12 Tak Nie Tak Nie 75,5% Osoba 13 Nie Nie Tak Nie 71,4% Osoba 14 Tak Tak Tak Nie 52,7% denaturującego %. Zdjęcie uzyskanych wzorów prążkowych DNA widoczne w świetle UV przedstawia rysunek 2. Wzory prążkowe poddano analizie bioinformatycznej z użyciem oprogramowania Quantity One 1D Software (Biorad). Obliczony współczynnik Dice a (tabela 1) i skonstruowane dendrogramy w oparciu o algorytm najbliższego sąsiada pozwoliły określić podobieństwo próbek (ryc. 3). Każda osoba, biorąca udział w eksperymencie, odpowiedziała na 4 pytania dotyczące higieny dłoni oraz użytkowanych telefonów komórkowych. Wyniki ankiety zestawiono również w tabeli 1. Dyskusja Wiadomo, że metoda PCR-DGGE jest narzędziem niezmiernie użytecznym w badaniach złożonych zbiorowisk bakteryjnych (Lerner i wsp., 2006). Metoda ta znalazła zastosowanie w mikrobiologii sądowej przy porównywaniu próbek gleby pochodzącej z miejsca zbrodni (Lerner i wsp., 2006). Takie jej użycie w przypadku porównania mikrobiocenozy bakteryjnej z dowodu w sprawie z użytkującym go posiadaczem pozwala na dopasowanie obydwu próbek ze znacznym prawdopodobieństwem. W przypadkach niejednoznacznych nie jest to dowód wiążący w sprawie, ale taki ślad biologiczny może stanowić okoliczność obciążającą w postępowaniu śledczym (Pawłowski, 1997). Przedmiot tej pracy stanowi porównanie zgodności mikrobiomu występującego na urządzeniu mobilnym z mikrobiomem pobranym od jego użytkownika. Badaniu poddano 14 osób. W przypadku badania, w którym porównywano strukturę genotypową próbki mikrobiomu pobranego z naskórka i urządzenia mobilnego, wykazano, że próbki te są do siebie bardzo podobne, w przypadku 9 na 14 próbek podobieństwo obliczone jako współczynniki Dice a wynosiło powyżej 70% (tabela 1). Pomimo wielokrotnych prób nie udało się skutecznie zamplifikować materiału bakteryjnego pobranego od osoby nr 10, w związku z czym wykluczono te próbki z dalszych analiz. Mogło to wynikać z cech osobniczych osoby badanej, które warunkują skład wydzielin gruczołów potowych oraz łojowych. Zawarte w nich substancje mogą blokować amplifikację PCR. Przykładowo mocznik jest składnikiem naturalnego czynnika nawilżającego skóry, stanowiący jego 7% wagowych (Grether-Beck i wsp., 2012). U niektórych osób może stanowić nawet do 1% masy naskórka. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2)

6 Wchodzący w skład wydzielin skórnych mocznik jest inhibitorem reakcji PCR (Wilson, 1997). Wysokie stężenie mocznika w wydzielinach skórnych mogło być przyczyną trudności w przeprowadzeniu amplifikacji pobranego materiału i prawdopodobnie uniemożliwiło otrzymanie produktów PCR od osoby nr 10. Produkty amplifikacji fragmentu genu kodującego 16S rrna rozdzielono metodą DGGE, prowadząc do otrzymania wzorów prążkowych DNA dla zbiorowisk bakteryjnych pochodzących z urządzeń mobilnych i występujących na skórze ich właścicieli. Rycina 2 przedstawia uzyskane wzory prążkowe DNA produktów PCR rozdzielone metodą DGGE. Ścieżki 1 i 2, odpowiadające próbkom pobranym od osoby nr 1, zostały nieznacznie wykrzywione, co spowodowane jest niedoskonałością metody. Wykrzywienie ścieżek nastąpiło najprawdopodobniej poprzez bliskość źródła przyciągania, jakim jest ładunek elektrody, przy której były umiejscowione, co wpłynęło na obniżenie dokładności analizy otrzymanej w dalszej obróbce bioinformatycznej. W wyniku takich problemów metodycznych otrzymane wartości liczbowe podobieństwa próbek (wpółczynnik Dice a) oraz lokalizacja próbek T1 i R1 na dendrogramach nie przedstawiają rzeczywistego stopnia dopasowania próbek. Pomimo wykrzywienia na żelu dostrzegalne jest podobieństwo tych ścieżek jako widoczne występowanie prążków na tych samych wysokościach na żelu. Wzory prążkowe DNA o niskim podobieństwie (współczynnik Dice a poniżej 50%; odpowiednio 54,9% i 43,6%) uzyskano dla osób badanych o numerach 3 i 5 (R3, T3 i R5 i T5). Również w dendrogramie obrazującym podobieństwo badanych próbek (rysunek 3a i b) próbki R3/T3 i R5/ T5 nie są zlokalizowane na jednej gałęzi drzewa. Niskie podobieństwo genetyczne tych próbek może zostać wyjaśnione faktem, że osoby te nie są jedynymi użytkownikami swoich urządzeń mobilnych (tabela 1) stąd możliwość wymieszania materiału bakteriologicznego z materiałem pochodzącym od współużytkowników. Stosunkowo niskie podobieństwo próbek 52,7%, wykazuje materiał pobrany od osoby nr 14 (próbki T14, R14). W tym przypadku powodem takiej różnicy może być fakt, że badany/a (osoba nr 14) używa mydła bakteriobójczego i krótko przed pobraniem materiału do analiz umył/a ręce (tabela 1). Dodatkowo są to dwie ostatnie ścieżki w żelu, które również ulegają nieznacznemu wykrzywieniu w trakcie rozdziału elektroforetycznego, co dodatkowo zaniża wartości liczbowe analizy densytometrycznej, która została na nich wykonana. W przypadku pozostałych próbek pobieranych od osób badanych materiał pobrany z naskórka ich dłoni i z powierzchni ich telefonu komórkowego tworzą jeden klaster (jedną grupę próbek) na pojedynczej gałęzi dendrogramu, co sugeruje, że w porównaniu z innymi próbkami w tej analizie (pochodzącymi od innych badanych) są do siebie najbardziej podobne. Wyniki te są zbieżne z danymi uzyskanymi dla podobnego badania porównawczego (Fierer i wsp., 2010), w którym wykorzystano metodę sekwencjonowania metagenomowego. Próbki pochodzące od jednego badanego naskórka i urządzenia mobilnego (laptopa) były najbardziej podobne i łatwo je było odróżnić od próbek innych badanych. PCR-DGGE pozwala na bardzo podobną analizę, jednak jest tańsza od sekwencjonowania. Ma ona jednak swoje minusy, przykładowo genotypy o jednakowej temperaturze topnienia migrują w żelu jako jeden prążek, a niektóre mikroorganizmy mogą generować wielokrotne prążki DNA ze względu na wielokrotność kopii operonu rrn występującego w ich komórce (Lerner i wsp., 2006). Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że metoda PCR-DGGE może być stosowana do potwierdzenia, że dwie próbki pochodzą od jednego badanego (podejrzanego). Przy analizie wyników niezbędne jest jednak uwzględnienie wpływu współużytkowania sprzętu przez wiele osób oraz wpływu czynników zewnętrznych, takich jak stosowanie preparatów bakteriobójczych. Pobór próbek powinien być wykonany jak najszybciej i z zachowaniem wysokiej czystości. Dodatkowo istnieje prawdopodobieństwo, że czynniki osobnicze (np. skład wydzielin badanego) będą uniemożliwiały amplifikację materiału genetycznego do analizy. Próbki zlokalizowane w najbardziej zewnętrznych kieszonkach żelu nie powinny być brane pod uwagę w analizach statystycznych prowadzonych z użyciem programu Quantity One 1D Software (Bio-Rad), byłoby to jednak możliwe z użyciem innego, bardziej zaawansowanego narzędzia bioinformatycznego (np. GelCompar, Applied Maths). Wskazane jest stosowanie metody PCR-DGGE jako skriningowej, poprzedzającej dodatkowe analizy potwierdzające. Źródła rycin i tabel: autorzy Bibliografia 1. Breeze R.G., Budowle B., Schutzer S.E., Microbial forensics, Elsevier Academic Press, San Diego Butler J.M., Fundamentals of Forensic DNA Typing: Chapter 15 Additional Loci and Nonhuman DNA Testing, DNA fingerprinting in microbial forensics, Elsevier Academic Press, San Diego Dudkiewicz B., Kmieciak W., Kwaszewska A., Lisiecki P., Sobiś-Glinkowska M., Szarapińska- Kwaszewska J., Szemraj M., Wysocki P., 20 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2) 2016

7 Ćwiczenia z mikrobiologii dla studentów kosmetologii, red. E.M. Szewczyk, Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Łódź Fierer N., Lauber C.L., Zhou N., McDonald D., Costello E.K., Knight R., Forensic identification using skin bacterial communities, Proceedings of the Natural Academy of Sciences of the USA, 107, Grether-Beck S., Felsner I., Brenden H., Kohne Z., Majora M., Marini A., Jaenicke T., Rodriguez-Martin M., Trullas C., Hupe M., Elias P.M., Krutmann J., Urea uptake enhances barrier function and antimicrobial defense in humans by regulating epidermal gene expression, J Invest Dermatol., 132(6): 2012, s Koczura R., Kaznowski A., Możliwości zastosowania badań mikrobiologicznych w kryminalistyce i sądownictwie, [w:] Streszczenia Seminarium Zastosowanie nauk biologicznych w kryminalistyce, , Poznań ( nia.pdf; ). 7. Lerner A., Shor Y., Vinokurov A., Okon Y., Jurkevitch E., Can denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of amplified 16S rdna of soil bacterial populations be used in forensic investigations?, Soil Biology and Biochemistry 2006, nr 38, s Muyzer, G., De Waal, E.C., Uitierlnden, A.G., Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rrna, Applied and Environmental Microbiology 1993, nr 59, s Pawłowski R., Medyczno-sądowe badania śladów biologicznych, Wydawnictwo Instytutu Ekspertyz Sądowych, Kraków Tims S., van Wamel W., Endtz H. P., van Belkum A., Kayser M., Microbial DNA fingerprinting of human fingerprints: dynamic colonization of fingertip microflora challenges human host inferences for forensic purposes, International J Legal Medicine 2010, nr 124, s Wilson I.G., Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification, Applied and Environmental Microbiology 1997, nr 63, s Włodarczyk R., Kryminalistyczne ślady biologiczne portretem sprawców zabójstw i innych przestępstw, Annales Academiae Medicae Stetinensis. Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie 2007, nr 53, Suppl. 2, s PROBLEMY KRYMINALISTYKI 292(2)